發(fā)育性癲癇性腦病基因治療展望

季濤云

北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科（北京 100034）

發(fā)育性癲癇性腦?。╠evelopmental and epileptic encephalopathy，DEE）是癲癇中最為嚴(yán)重的一類疾病，致殘率、致死率高，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[1]。雖然DEE中許多疾病均為罕見(jiàn)病，但作為一組疾病，其總體發(fā)病率為（0.27～0.54）/1000例新生兒[1-2]。DEE病因包括遺傳性和非遺傳性，隨著技術(shù)的發(fā)展，尤其是二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)的進(jìn)步，越來(lái)越多DEE的遺傳性病因被識(shí)別。本文主要闡述遺傳性病因相關(guān)DEE的特點(diǎn)、發(fā)病機(jī)制及治療。

1 發(fā)育性癲癇性腦病的概念

DEE 是一組神經(jīng)發(fā)育性疾病，以早發(fā)癲癇、腦電圖異常及發(fā)育落后或倒退為主要特征，包括早發(fā)性嬰兒DEE、嬰兒癲癇伴游走性局灶性發(fā)作、嬰兒癲癇性痙攣綜合征、Dravet綜合征、Lennox-Gastaut綜合征、癲癇性腦病伴睡眠中棘慢波激活、病因特異性癲癇性腦病[鉀電壓門控通道亞家族Q 成員2（KCNQ2）-發(fā)育性癲癇性腦病、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5（CDKL5）-發(fā)育性癲癇性腦病、吡哆醇依賴性發(fā)育性癲癇性腦病]等[3-4]。DEE存在顯著遺傳異質(zhì)性和表型異質(zhì)性。遺傳異質(zhì)性是指不同遺傳因素可導(dǎo)致相同的臨床表型，例如影響不同分子或信號(hào)通路的基因變異可導(dǎo)致相似的電-臨床綜合征如嬰兒癲癇性痙攣綜合征。同一個(gè)基因變異也可以導(dǎo)致多種不同的臨床表型即所謂的表型異質(zhì)性，如鈉電壓門控通道α 亞基1（SCN1A）基因變異可導(dǎo)致遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥、Dravet綜合征、早發(fā)性嬰兒發(fā)育性癲癇性腦病等，其基因型-表型的關(guān)聯(lián)與SCN1A變異是功能獲得性（gain of function，GoF）還是功能缺失性（loss of function，LoF）有一定關(guān)系。除此之外，遺傳背景也會(huì)改變基因型與表型的關(guān)系。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在鉀電壓門控通道亞家族A 成員1（Kcna1）基因敲除和鈣電壓門控通道亞基α1A（Cacna1a）錯(cuò)義變異相結(jié)合的動(dòng)物模型中，與Cacna 1 a相關(guān)的癲癇表型被掩蓋，同時(shí)Kcna 1缺失變異導(dǎo)致的致死性表型被減輕[5]。因此，基因型-表型關(guān)聯(lián)的機(jī)制復(fù)雜，尚需要大量研究以進(jìn)一步明確。

2 發(fā)育性癲癇性腦病的遺傳性病因

DEE的遺傳性病因涉及不同功能的基因變異如細(xì)胞遷移、增殖和分化、神經(jīng)元興奮性、突觸傳遞及神經(jīng)可塑性等。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是NGS技術(shù)的普及，越來(lái)越多的DEE 致病基因得到確認(rèn)，目前已有上百個(gè)基因被確認(rèn)與DEE相關(guān)。除了基因變異導(dǎo)致的DEE 外，約8%的DEE 與新發(fā)的拷貝數(shù)變異有關(guān)[6-7]。在約10%DEE 患者的父母中檢測(cè)出低比例的變異嵌合體[8-9]，上述發(fā)現(xiàn)對(duì)遺傳咨詢?cè)u(píng)估具有重要意義。非編碼區(qū)變異、腦組織中存在變異嵌合體、寡基因遺傳（oligogenic inheritance）和表觀遺傳等均可導(dǎo)致DEE，但是目前常用的NGS方法無(wú)法檢測(cè)到上述異常。

非編碼區(qū)變異主要與基因表達(dá)和調(diào)控有關(guān)，可能是由于非編碼區(qū)變異導(dǎo)致毒性外顯子產(chǎn)生，進(jìn)而影響RNA轉(zhuǎn)錄本的正常剪接。有研究對(duì)640例不明原因DEE患者SCN1A基因的11個(gè)非編碼候選區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)其進(jìn)化保守性和功能特征分析，在內(nèi)含子20中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)變異，這些變異導(dǎo)致毒性外顯子產(chǎn)生，影響全長(zhǎng)SCN1A蛋白的正常表達(dá)[10]。有研究針對(duì)皮質(zhì)發(fā)育畸形所致DEE患者的腦組織和血液配對(duì)樣本進(jìn)行深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在腦組織中存在變異嵌合體[11-13]。對(duì)于大多數(shù)DEE患者來(lái)說(shuō)，獲取腦組織極其困難，臨床實(shí)踐中可能低估了變異嵌合體在DEE 中的影響?；谏鲜鲈?，已有研究試圖從腦脊液中提取DNA以進(jìn)行相關(guān)病因的探索[14-15]，其對(duì)于DEE的病因明確具有重要意義。寡基因遺傳不符合單基因遺傳的特點(diǎn)，而是由多個(gè)（≥2 個(gè)）基因變異相互作用導(dǎo)致的復(fù)雜臨床表型。1個(gè)基因是主要致病基因（主效基因），而其他基因則起修飾作用。離子通道基因變異所致癲癇患者和動(dòng)物模型均證實(shí)了寡基因遺傳的存在[5,16-17]。有研究在1例生后3個(gè)月出現(xiàn)頻繁癲癇發(fā)作、喂養(yǎng)困難、嚴(yán)重發(fā)育遲緩（21個(gè)月體重5.6 kg、身長(zhǎng)69 cm、頭圍39.5 cm，尚不能豎頭、不能發(fā)出“啊啊”聲音）、最終因?yàn)閺?qiáng)直-陣攣發(fā)作導(dǎo)致死亡的男性患兒中發(fā)現(xiàn)，同時(shí)存在KCNJ10基因及KCNT1基因的致病變異，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行功能研究時(shí)發(fā)現(xiàn)兩種變異同時(shí)存在時(shí)會(huì)導(dǎo)致致死的表型[17]。

3 發(fā)育性癲癇性腦病發(fā)病機(jī)制

DEE 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，且多重機(jī)制交織在一起可共同影響大腦發(fā)育和神經(jīng)元的興奮性。皮質(zhì)和皮質(zhì)下神經(jīng)元相互作用，可引起正常皮質(zhì)的功能改變[18]。神經(jīng)元的電活動(dòng)受Na+、K+離子通道相互作用的精細(xì)調(diào)節(jié)，如果平衡被打破可能會(huì)出現(xiàn)異常的去極化，導(dǎo)致異常的神經(jīng)元活動(dòng)和皮質(zhì)興奮性改變[19]。DEE的發(fā)生與大腦處于動(dòng)態(tài)的發(fā)育過(guò)程也息息相關(guān)，在大腦的發(fā)育過(guò)程中存在分子、形態(tài)及功能的變化，發(fā)育中的大腦更容易受到多種因素的影響，更容易發(fā)生頻繁、多灶的癲癇樣放電及癲癇發(fā)作[20]。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)，發(fā)育中的大腦具有更強(qiáng)的可塑性，與發(fā)育成熟的大腦相比，長(zhǎng)時(shí)間癲癇發(fā)作產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷的可能性較小[21]。DEE致病基因編碼的蛋白涉及多種生物學(xué)功能，如離子通道、膜運(yùn)輸調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等（表1），其中約25%的基因參與編碼離子通道，包括電壓門控離子通道和配體門控離子通道。下面以編碼電壓門控鈉離子通道相關(guān)的基因變異為例闡述DEE的發(fā)病機(jī)制。變異的功能研究對(duì)揭示病理生理機(jī)制、闡明基因型-表型關(guān)系、遺傳咨詢、精準(zhǔn)治療及長(zhǎng)期管理具有重要意義。

表1 DEE致病基因分類

編碼Ⅰ型鈉通道（Nav1.1）α亞基的SCN1A是臨床上最常見(jiàn)的癲癇致病基因之一，迄今已報(bào)道了數(shù)百種變異，其相關(guān)表型范圍從表型嚴(yán)重的DEE（早發(fā)性嬰兒DEE、Dravet綜合征）到相對(duì)較輕的遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥，部分?jǐn)y帶此基因變異的患者可表現(xiàn)為非癲癇表型如偏癱性偏頭痛。NaV1.1是γ-氨基丁酸（GABA）能中間神經(jīng)元的主要Na+通道，位于GABA 能中間神經(jīng)元的軸突初始段，SCN1A基因變異導(dǎo)致其興奮性降低，降低了GABA 能神經(jīng)元的抑制作用[22-23]。GABA能神經(jīng)元功能的抑制與Dravet綜合征相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)LoF的嚴(yán)重程度可以決定表型的嚴(yán)重程度[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，SCN1A基因變異引發(fā)的散發(fā)性或家族性偏癱性偏頭痛可能與NaV1.1功能增強(qiáng)有關(guān)[26-27]。基因型-表型相關(guān)性可能主要取決于SCN1A基因變異后對(duì)功能的影響，但上述關(guān)聯(lián)亦受到遺傳背景以及SCN1A基因變異與癲癇發(fā)作之間的相互作用等的影響，這可能是基因型-表型關(guān)聯(lián)復(fù)雜的原因之一[28]。

SCN8A基因編碼電壓門控鈉離子通道亞基Nav1.6，該通道是位于成熟興奮性神經(jīng)元軸突的主要Na+通道，是動(dòng)作電位產(chǎn)生及傳導(dǎo)的重要分子基礎(chǔ)。新發(fā)的SCN8A基因雜合變異引發(fā)的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，大多數(shù)患者表現(xiàn)為DEE 且有癲癇猝死發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[29]，部分患者表型相對(duì)較輕如表現(xiàn)為自限性家族性嬰兒癲癇[30]，還有一些患者表現(xiàn)為智力障礙、孤獨(dú)癥譜系障礙等，而無(wú)癲癇發(fā)作。研究發(fā)現(xiàn)與癲癇相關(guān)的表型多與GoF 變異相關(guān)，此種變異導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)；而無(wú)癲癇發(fā)作的智力障礙、孤獨(dú)癥譜系障礙多與LoF變異相關(guān)[31-32]。上述研究對(duì)治療有一定的指導(dǎo)作用，如部分SCN8A基因GoF變異的患者對(duì)高劑量的鈉通道阻滯劑有一定反應(yīng)[30,33]。

編碼鈉離子通道基因SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN8A均可導(dǎo)致DEE，但是SCN1A基因主要在抑制性神經(jīng)元中表達(dá)，而同樣編碼電壓門控鈉離子通道的SCN2A、SCN3A、SCN8A在大腦多個(gè)區(qū)域的興奮性神經(jīng)元中優(yōu)先表達(dá)[34]。體外和體內(nèi)電生理研究對(duì)于確定通道相關(guān)基因變異的功能影響至關(guān)重要，變異后功能的改變?cè)谙嗤蚣易逯锌赡懿煌踔猎谙嗤蛑幸部赡懿煌?。功能研究為藥物選擇和研發(fā)提供了重要的基礎(chǔ)。

4 發(fā)育性癲癇性腦病治療

目前DEE 治療主要是對(duì)癥治療，包括針對(duì)癲癇發(fā)作的抗癲癇發(fā)作藥物的應(yīng)用，以及針對(duì)發(fā)育落后的康復(fù)治療。在部分DEE 患者中，即使癲癇發(fā)作得到較好的控制，但發(fā)育障礙和其他合并癥仍然較為嚴(yán)重[35]。隨著人們對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)許多疾病是由于遺傳物質(zhì)改變所致，例如某一基因的變異導(dǎo)致蛋白表達(dá)異常，從而引起病變。基因治療可通過(guò)修復(fù)致病基因達(dá)到緩解和治愈疾病的目的，為DEE 患者帶來(lái)了新的希望。目前常用的基因治療方法包括：①使用病毒載體的基因替代治療；②調(diào)節(jié)基因表達(dá)，如反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）治療脊髓性肌萎縮癥；③基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）的基因編輯療法。

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）是目前基因治療的主流病毒載體。在SCN1A變異所致Dravet 綜合征的小鼠中注射AAV9-REGABAeTFSCN1A(ETX101)可顯著降低無(wú)誘因和發(fā)熱誘發(fā)的癲癇發(fā)作的發(fā)生率，并延長(zhǎng)其生存期[36]。在結(jié)節(jié)性硬化癥的小鼠模型中應(yīng)用AAV1-環(huán)化重組酶以及AAV9-錯(cuò)構(gòu)瘤蛋白，小鼠生存期延長(zhǎng)，腦病理異常亦顯著減少[37]。也有研究在Cdkl5變異導(dǎo)致的小鼠模型中注射AAV-PHP.B-hCDKL5_1，注射后小鼠腦中CDKL5 表達(dá)有所恢復(fù)且運(yùn)動(dòng)功能有改善[38]。ASOs是一種與特定靶mRNA互補(bǔ)的單鏈脫氧核酸，包含12～28個(gè)堿基，通過(guò)與mRNA或前mRNA序列互補(bǔ)，ASOs 可被合成為DNA/RNA 異源雙鏈體，成為影響蛋白質(zhì)編碼和非編碼核糖核酸的疾病修飾劑，降低毒性蛋白質(zhì)水平，增加功能蛋白質(zhì)的水平或修飾受損蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以改善功能[39]。2020年相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)用ASOs治療Scn8a基因變異的R1872W小鼠，延遲了其癲癇發(fā)作起病時(shí)間，并延長(zhǎng)了其存活時(shí)間[40]。在Dravet綜合征動(dòng)物模型中，通過(guò)反義寡核苷酸靶向增強(qiáng)核基因輸出（targeted augmentation of nuclear gene output，TANGO）可增加Scn1a轉(zhuǎn)錄物和Nav1.1蛋白的表達(dá)，從而降低癲癇發(fā)作的頻率、延長(zhǎng)壽命且能將中間抑制性神經(jīng)元的興奮性恢復(fù)至野生型的水平[41-42]。STK-001是用于治療Dravet綜合征的ASOs藥物，可選擇性上調(diào)SCN1A基因的一個(gè)等位基因，從而增加NaV1.1 蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，STK-001應(yīng)用于Dravet綜合征患者的臨床研究正在進(jìn)行中[43]，期待能為Dravet綜合征提供新的有效治療藥物。CRISPR 是一種基因編輯技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)修復(fù)或敲除變異基因和編輯其他相關(guān)基因來(lái)治療疾病。它使得在細(xì)胞和組織中快速、廉價(jià)和相對(duì)容易糾正基因組中的錯(cuò)誤成為可能。CRISPR突出的優(yōu)勢(shì)是具有治療由單基因變異引起的遺傳疾病方面的潛在用途。目前CRISPR已應(yīng)用于阿爾茲海默癥、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、Dravet綜合征等疾病的動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。在CRISPR的潛力轉(zhuǎn)化為臨床有效治療之前，仍然存在許多挑戰(zhàn)，如該技術(shù)的遞送效率、脫靶效應(yīng)、安全性等[44]。

DEE 表型復(fù)雜，致病基因種類繁多，以上特點(diǎn)導(dǎo)致其基因治療的研究和臨床應(yīng)用面臨更大挑戰(zhàn)和困難。隨著相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該疾病的基礎(chǔ)性研究，通過(guò)對(duì)變異的功能研究揭示其病理機(jī)制和闡明基因型-表型相關(guān)性至關(guān)重要，有助于開(kāi)展進(jìn)一步的基因治療研究。遞送技術(shù)是基因治療過(guò)程中的關(guān)鍵技術(shù)，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)更多有效的非病毒載體，如細(xì)胞外囊泡、脂質(zhì)納米顆粒及類病毒體等，其技術(shù)進(jìn)步將極大推動(dòng)基因治療的應(yīng)用范圍，還將有助于進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本?；蛑委熢贒EE中的應(yīng)用目前仍存在以下問(wèn)題[45]：①由于大多數(shù)DEE與廣泛的大腦功能障礙有關(guān)，因此需要針對(duì)整個(gè)大腦進(jìn)行遞送；②DEE 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與LoF 或GoF 有關(guān)，過(guò)量表達(dá)可能導(dǎo)致不良影響；③DEE發(fā)病部分與體細(xì)胞嵌合有關(guān)，導(dǎo)致替代治療的量和分布更加復(fù)雜；④治療窗口期非常重要，基因的替代治療應(yīng)該在腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)發(fā)育成熟之前進(jìn)行。雖然目前基因治療還存在諸多問(wèn)題，但相信隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，上述問(wèn)題將會(huì)迎刃而解。

5 結(jié)語(yǔ)

癲癇是最常見(jiàn)兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，根據(jù)起病年齡、癲癇發(fā)作類型、腦電圖特征、病因、合并癥及預(yù)后，可以分為不同的癲癇類型和癲癇綜合征。DEE 是其中最為嚴(yán)重的類型之一，嚴(yán)重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量。DEE表型多樣，病因復(fù)雜，針對(duì)致病機(jī)制的研究結(jié)果為我們提供了更清晰的靶向目標(biāo)，為研究安全有效的治療方法提供了基礎(chǔ)，針對(duì)病因的個(gè)體化基因治療未來(lái)可期。