兒童克羅恩病早期篩查和診斷研究進(jìn)展

汪陳慧綜述 楊 輝審校

南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院消化科（江蘇南京 210008）

克羅恩?。–rohn’s disease，CD）是一種慢性非特異性消化道炎性疾病，屬于炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的一個亞型，臨床表現(xiàn)為反復(fù)腹痛、腹瀉，伴明顯體重下降，可有腹部腫塊、腸瘺、肛周病變以及發(fā)熱、貧血、生長發(fā)育遲緩等全身性表現(xiàn)[1]。目前CD 的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，主流觀點認(rèn)為，環(huán)境因素、遺傳易感性和免疫反應(yīng)失調(diào)與CD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來，兒童CD 的發(fā)病率顯著增加，成為一種全球性的兒科疾病。在世界范圍內(nèi)，兒童CD 發(fā)病率在0.2/100000～13.9/100000之間，中國兒童CD發(fā)病率目前尚不清楚，但呈逐年上升趨勢[2]。因為起病隱匿，臨床表現(xiàn)不具特異性，而且缺乏非侵入性的診斷方法，兒童CD 的早期診斷往往很困難。Ricciuto等[3]分析加拿大111 例IBD 患兒的診斷時間發(fā)現(xiàn)，診斷延遲在CD中更為常見，兒童CD從出現(xiàn)癥狀至確診的中位時間為6.8個月，其中約20%的患兒診斷延遲時間超過1年。然而CD具有進(jìn)展性和致殘性，診斷延遲與CD并發(fā)癥和需要手術(shù)的風(fēng)險增加相關(guān)，CD 患兒診斷延遲可導(dǎo)致腸道狹窄和內(nèi)瘺的發(fā)生率升高2.5倍(HR 2.53，95%CI1.41～4.56)，診斷延遲每增加1個月，年齡別身高z分下降0.13個標(biāo)準(zhǔn)差(95%CI0.005～0.021)[4]。因此早期診斷和干預(yù)可減少CD 患兒并發(fā)癥的發(fā)生，降低手術(shù)率和致殘率，改善長期預(yù)后，提高患兒的生存質(zhì)量。

目前，兒童CD 的臨床診斷需要結(jié)合臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡檢查、組織病理學(xué)以及影像學(xué)檢查進(jìn)行綜合分析[1]，其中內(nèi)鏡及組織病理學(xué)檢查最為關(guān)鍵[5]，然而它具有侵入性，不利于兒童的早期篩查和診斷。眾多臨床研究表明，對于出現(xiàn)非特異性胃腸道癥狀的患兒，采用一些非侵入性及耐受性良好的手段，可盡早篩查出需要內(nèi)鏡檢查的CD高?；純海s短出現(xiàn)癥狀至確診的時間。本文就CD 患兒早期識別的篩查手段和診斷方法進(jìn)行綜述。

1 影像學(xué)檢查

腸道超聲（intestinal ultrasound，IUS）是疑似CD的有效篩查手段之一，常見的CD 征象包括腸壁增厚、腸道彈性和蠕動降低、腸壁回聲改變等，其中最可靠的是腸壁增厚（bowel wall thickening，BWT）[6]。與其他非侵入性檢查聯(lián)合應(yīng)用時，其靈敏度和特異度會顯著提高。一項針對患兒進(jìn)行IBD 篩查的研究發(fā)現(xiàn)，BWT（＞3 mm）和糞便鈣衛(wèi)蛋白（fecal calprotectin，F(xiàn)C，＞200 μg/g）聯(lián)合檢測能顯著提高診斷準(zhǔn)確率，陽性預(yù)測值為100%，陰性預(yù)測值為88.5%，其中，BWT（＞3 mm）單項檢測特異度最高（96%），靈敏度較低（70%）；FC（＞200 μg/g）靈敏度最高（96%），但特異度較低（72%），相反FC、血液炎癥指數(shù)和BWT 三項檢測均正常的兒童發(fā)生IBD的概率幾乎為0；FC和增加的BWT可較準(zhǔn)確地指導(dǎo)對有輕度胃腸道癥狀的患兒進(jìn)行進(jìn)一步的侵入性檢查[7]。

CD在CT和磁共振成像（magnetic resonance，MRI）上常見的特征包括異常腸壁增厚伴強(qiáng)化和腸壁分層、腸系膜血管增多(梳狀征)、結(jié)腸周/腸周脂肪堆積和纖維脂肪增生等。目前，臨床評估CD最常用的影像學(xué)檢查方法是磁共振小腸成像（magnetic resonanceenterography，MRE）和CT小腸成像（CT enterography，CTE），然而，由于電離輻射、軟組織對比度差等原因，CTE 比MRE 更受限制，尤其在兒童中，MRE被認(rèn)為是診斷和跟蹤兒童CD的一線方法[1]。但是，MRE 需要兒童口服大劑量的造影劑，長時間的檢查、鎮(zhèn)靜和較高的費用，因此在臨床上，有非特異性胃腸道癥狀的兒童往往首選影像學(xué)檢查不是MRE，相較而言常規(guī)腹部CT 更為常見。Kang 等[8]將診斷為CD 前進(jìn)行腹部CT 的患兒納入CD 組，將診斷為感染性小腸結(jié)腸炎前進(jìn)行CT 檢查的患兒納入對照組，研究他們的CT 和實驗室檢查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)多節(jié)段腸道受累和較低的白蛋白水平(≤4 g/dL)是CD 的重要危險因素，當(dāng)這兩個特征相結(jié)合時，曲線下面積（area under curve roc，AUC）為0.985，鑒別CD的靈敏度為96%，特異度為100%。因此，CT多節(jié)段腸道受累和白蛋白降低有助于早期鑒別CD 與感染性小腸結(jié)腸炎。

小腸克羅恩?。╯mall bowel Crohn’s disease，SBCD）的發(fā)病部位僅局限于小腸，在CD 患者中約占30%。對于CD患兒由于小腸的解剖結(jié)構(gòu)和位置，內(nèi)鏡檢查不易發(fā)現(xiàn)病灶，因此孤立的SBCD 往往很難診斷，也是診斷延遲的危險因素[4,9]。目前，MRE和CTE 是評估SBCD 常用的影像學(xué)檢查方法[1]。MRE 可以提供極好的腸道細(xì)節(jié)，包括評估腸腔和腸壁、鄰近的腸系膜和軟組織，以及各種腸外腹盆腔CD表現(xiàn)，同時使兒童免受電離輻射暴露風(fēng)險，可用于兒童CD 的早期診斷，特別是SBCD[10-11]。與MRE相比，小腸超聲造影（small intestinal contrast ultrasonography，SICUS）更加經(jīng)濟(jì)、方便、快捷，適合早期篩查評估，可提供比MRE更高空間分辨率的圖像，且不需要鎮(zhèn)靜或麻醉，耐受性更好，特別適用于年幼患兒[12]。一項回顧性研究評估了SICUS檢測CD小腸病變的準(zhǔn)確性和一致性，在疑診CD患兒中，SICUS 診斷CD 小腸病變的靈敏度和特異度分別為81.8%和100%，與MRE和腸鏡檢查具有較高的一致性[13]。然而超聲檢查結(jié)果的精確性與檢查者的經(jīng)驗及專業(yè)程度有關(guān)，因此多數(shù)醫(yī)院開展受限。

此外，CD 患兒肛周病變的患病率較高，部分患兒首發(fā)癥狀即為肛瘺或肛周膿腫，其發(fā)病率約為24%[14]。肛周MRI可以確定肛瘺和肛周膿腫的范圍和位置。與非CD 肛瘺患者比較，CD 肛瘺患者肛周MRI影像學(xué)特征以多分支、多膿腫、多內(nèi)口數(shù)、高位內(nèi)口、直腸炎和肛管炎高發(fā)為特征，且CD肛瘺患者比單純表現(xiàn)為肛瘺患者更年輕[15]。因此，肛周MRI可提高CD肛瘺患兒的早期診斷率。

2 新型生物標(biāo)志物

傳統(tǒng)的兒童CD 標(biāo)志物主要包括抗釀酒酵母抗體（ASCA）、抗乙糖苷甘露糖抗體（AMCA）、抗乙糖苷殼糖抗體（ACCA）等，它們屬于多糖抗體，抗原多為細(xì)菌細(xì)胞壁中多糖成分。ASCA、AMCA 和ACCA都是對CD具有較高特異性的抗體。楊輝等[16]報道ASCA IgG、ASCA IgA 在CD 患兒的陽性率分別為50%、62.5%，高于AMCA IgG和ACCA IgA的陽性率（37%），顯示ASCA 在CD 患兒中的特異性優(yōu)于AMCA 和ACCA，但它們的檢測靈敏度都較低。此外，ASCA在乳糜瀉中也存在30%～40%陽性率，因此限制了其在CD患兒早期診斷中的應(yīng)用。

FC是胃腸道中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的一種蛋白，對兒童IBD 的檢測具有很高的靈敏度，為0.92（95%CI0.84～0.96)，它在過敏性腸炎、胃腸道感染和乳糜瀉等疾病中均可升高，主要缺點是兒童的特異度相對較差，為0.76（95%CI0.62～0.86），但是當(dāng)FC水平很高（＞800 μg/g）時，可作為CD的篩查工具[17]。當(dāng)FC 與其他炎癥指標(biāo)聯(lián)合檢測時，可彌補(bǔ)其特異度低的缺點。一項研究將其與及血清膽堿酯酶（cholinesterase，ChE）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）聯(lián)合檢測時，ROC 0.973，分別以FC＞96.17 μg/g、血清ChE＜7 537.61 U/L、PCT＞0.56 μg/L為診斷IBD的臨界值，聯(lián)合檢測的靈敏度為94.0%，特異度為90.0%，對兒童IBD的早期診斷價值較好[18]。

目前有報道，新型的生物標(biāo)志物如抗克羅恩病肽353（anti-Crohn's disease peptide 353，ACP353）、抗糖蛋白2（glycoprotein 2，GP2）應(yīng)用于兒童CD的診斷[16]。最近，一項來自日本兒童的研究表明，ACP 353、抗GP2 和ASCA 在CD 患兒中的濃度（中位數(shù)分別為2.25、3.0 和8.9 U/mL）顯著高于潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC，1.1、1.9和3.4 U/mL，P＜0.001）、其他腸道疾?。?.1、1.85和2.95 U/mL，P＜0.001）和健康對照組（1.1、1.7和2.8 U/mL，P＜0.001）。在95%特異度時，ACP353的靈敏度為45.0%，顯著高于抗GP2（30.8%，P＜0.05）或ASCA（26.7%，P＜0.01）[19]。這一結(jié)果顯示，ACP 353 對于CD 患兒的早期診斷具有較高價值?？笹P2 也是一個CD 標(biāo)志物。一項包括53例CD 患兒的隊列研究顯示，與UC 患兒（42 例）和對照組（53 例）比較，CD 患兒抗GP2 水平顯著升高（P＜0.05），抗GP2-IgG 和IgA 的特異度高達(dá)98.7%和90.0%，但靈敏度較低，分別為42.0%和35.5%[20]。病變累及回結(jié)腸的CD患兒抗GP2-IgA水平也顯著升高，這一現(xiàn)象在低齡患兒更明顯。此外，糞便幾丁質(zhì)酶3樣蛋白-1（chitinase3-like protein 1，CHI3L1）對成人CD有較高的診斷價值[21]，但目前仍缺乏兒童CD的研究報道。CHI3L1是一個中性粒細(xì)胞自身抗原靶點，CHI3L1-IgA和SIgA可作為CD的新標(biāo)志物有助于CD診斷[21]。

微小RNA（miRNA）是一類由內(nèi)源性基因編碼的長度約為22～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA，在CD 中參與促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和炎癥過程。血循環(huán)和腸黏膜組織中的miRNA 被認(rèn)為是預(yù)測CD 的新型生物標(biāo)志物。一項采集CD 患兒、健康對照組和腹腔疾病患兒對照組的血清樣本進(jìn)行miRNA 檢測的研究顯示，11 種CD 相關(guān)的血清miRNA 包括miR-16、miR-484、miR-30e、miR-106a、miR-195、miR-20a、miR-21、miR-140、miR-192、miR-93、let7b被認(rèn)為是可應(yīng)用于診斷CD的非侵入性生物標(biāo)志物，其靈敏度介于69.57%～82.61%，特異度介于75.00%～100%[22]。miR-146a在CD患兒炎癥十二指腸黏膜中的表達(dá)明顯高于CD組（3.21±0.50對0.62±0.26，P≤0.01）和對照組（3.21±0.50對1.00±0.33，P≤0.05）正常十二指腸黏膜；與對照組相比，十二指腸炎癥區(qū)域的miR-155表達(dá)也顯著增加（4.87±1.02對1.00±0.40，P≤0.001），提示腸黏膜miR-146 a 和miR-155 參與兒童CD 的發(fā)病[23]。此外，CD 患兒炎癥結(jié)腸活檢組織中miR-223表達(dá)明顯高于CD組和對照組正常結(jié)腸黏膜[24]。迄今為止，關(guān)于兒童IBD 患者的miRNA 研究很少，Jabandziev等[25]統(tǒng)計了集中在兒童IBD患者的miRNA 研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 譜有明顯的重疊，其中miR-146a、miR-142-3p和miR223有希望成為未來兒科IBD 的潛在非侵入性生物標(biāo)志物，此外，還有miRNA 生物標(biāo)志物(如miR-24)能夠準(zhǔn)確區(qū)分UC和CD病例。

環(huán)境因素和易感基因之間的相互作用將不可避免地導(dǎo)致CD 患兒血清和炎性黏膜中蛋白質(zhì)組圖譜的顯著改變，近年來這已被認(rèn)為是CD 的潛在診斷生物標(biāo)志物[26]。例如Torres等[27]檢測了200例診斷前后CD 患者的血清，確定了51 種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，這些抗體和蛋白質(zhì)可以高度準(zhǔn)確地預(yù)測5 年內(nèi)診斷為CD 的患者，AUC 為0.76，在1 年內(nèi)預(yù)測CD的AUC為0.87。此外，在兒童隊列中，Starr等[28]發(fā)現(xiàn)一組包含5 種蛋白質(zhì)作為候選生物標(biāo)記物，可以區(qū)分IBD患兒和健康對照組，另一組包括12種蛋白質(zhì)可以區(qū)分CD和UC患兒。

雖然CD患兒的生物標(biāo)志物研究日益深入，目前尚沒有一種生物標(biāo)志物顯示出對于CD 患兒早期診斷具有可靠的臨床應(yīng)用價值。而生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測顯現(xiàn)出較高的特異度與靈敏度，預(yù)示其將在CD患兒早期篩查中提供重要幫助。

3 腸道微生物

3.1 腸道細(xì)菌

消化道微生物區(qū)系與CD 的發(fā)病機(jī)制之間存在復(fù)雜關(guān)系，腸道微生物失調(diào)是CD的一個潛在危險因素。一項研究中，新診斷的IBD 患兒與其健康同胞和健康對照組相比，微生物多樣性顯著不同，IBD組糞便樣本中真桿菌屬、乳酸桿菌屬、腸桿菌屬和梭狀芽胞桿菌屬減少，而鏈球菌屬、普氏菌屬和大腸桿菌屬增加[29]。相比之下，一項針對CD患兒微生物群的縱向前瞻性單中心研究發(fā)現(xiàn)，與新診斷CD 患兒的相關(guān)細(xì)菌最多是梭桿菌屬和副流感嗜血桿菌[30]。此外，Kowalska-Duplaga等[31]研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的CD患兒與健康對照組兒童糞便樣本之間有11個屬和17 個種存在顯著差異，其中雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、糞球菌、糞桿菌、芽殖菌和瘤胃球菌豐度減少。檢測IBD 患兒的糞便微生物區(qū)系（FM）和黏膜樣本微生物區(qū)系（MM）發(fā)現(xiàn)，IBD 組和對照組在FM 和MM的總體組成上有明顯的分離，IBD的FM中細(xì)菌豐富度降低。在門水平上，IBD的FM中出現(xiàn)了變形桿菌和放線菌的豐度，而具有抗炎特性的種類（即瘤胃球菌）減少。與非炎癥區(qū)和對照組樣本相比，炎癥區(qū)的梭桿菌占優(yōu)勢[32]。值得注意的是，一項調(diào)查中，多達(dá)40%CD患兒有口腔疾病，CD患兒舌樣本中梭桿菌屬和厚壁菌屬減少，表明口腔細(xì)菌入侵腸道可能是觀察到的部分生物失調(diào)的原因[33]。

由此可見，IBD 患兒糞便樣本中最常見大腸桿菌、梭桿菌屬、普雷沃菌屬的豐度增加，而最常減少的菌群包括雙歧桿菌屬、梭狀芽胞桿菌以及厚壁菌門的細(xì)菌（瘤胃球菌、真桿菌屬、梭菌屬）。由于多種因素，已發(fā)表研究的結(jié)果不一致且難以比較，尚不能確定導(dǎo)致CD相關(guān)炎癥的細(xì)菌種類，但可以清楚地看出，與健康兒童相比，CD 患兒體內(nèi)的微生物組在多樣性和群落豐富度方面都有顯著差異。因此，對CD患兒進(jìn)行腸道生物群分析，可以將CD患兒與具有相似癥狀的患兒區(qū)分開來，可早期篩查CD 高?；純?。雖然這項檢測不能取代內(nèi)鏡和組織學(xué)檢查作為明確診斷的工具，但基于微生物多樣性的分類可以作為篩查CD患兒的一種有效的補(bǔ)充技術(shù)[34]。

3.2 腸道真菌

在新診斷的、未接受治療的CD患兒中進(jìn)行的一項研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CD 患兒腸黏膜和糞便樣本中增加的真菌類群都屬于擔(dān)子菌門，而減少的類群都屬于子囊菌門，CD 患兒與對照組兒童比較，腸黏膜和糞便樣本中真菌多樣性無顯著差異，而與CD腸黏膜相比，CD糞便中真菌多樣性顯著降低，表明CD患兒真菌菌群失調(diào)[35]。El Mouzan等[36]發(fā)現(xiàn)，真菌菌群失調(diào)在CD 患兒早期篩查中具有較高準(zhǔn)確率，糞便真菌菌群失調(diào)的AUC高于黏膜（0.85±0.057對0.71±0.067，P＜0.001），提示糞便真菌菌群分析對于CD 早期篩查和診斷具有更高的準(zhǔn)確性。雖然目前糞便真菌分析成本高，其臨床應(yīng)用受到限制，但鑒于真菌菌群在CD患兒識別中的重要作用，可發(fā)展一種非侵襲性的篩查試驗，有利于CD患兒的早期篩查和診斷。

4 代謝組學(xué)

腸道微生物群變化會影響免疫系統(tǒng)和代謝途徑，這些變化在IBD研究中很有意義，因為它們可能發(fā)展成為指示疾病發(fā)病的標(biāo)志物或指導(dǎo)治療的標(biāo)志物。關(guān)于IBD 新診斷患兒的代謝組學(xué)報告顯示，與健康對照組相比，UC 和CD 患兒的代謝物譜有顯著不同。在血清樣本中，與對照組相比，CD 患兒的氨基酸代謝、葉酸生物合成和信號通路受到干擾，鞘磷脂代謝途徑也受到干擾。在糞便樣本中發(fā)現(xiàn)CD 患兒一般表現(xiàn)為低水平或中等水平的代謝物，而這些代謝物在UC患兒中更為豐富。因此，糞便代謝物圖譜比血清樣本更好地鑒別CD和UC[37]。

在CD 患兒的脂質(zhì)代謝組學(xué)研究中，Daniluk等[38]發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，大部分重要代謝物屬于磷脂類，在CD和UC中的表達(dá)下調(diào)，只有一種代謝物乳糖神經(jīng)酰胺18:1/16:0（LacCer18:1/16:0）水平升高且能顯著區(qū)分CD和UC，將LacCer18:1/16:0與其他炎癥標(biāo)志物相結(jié)合，AUC 顯著增加，具有很高的特異度和靈敏度[38-39]。Filimoniuk 等[40]也發(fā)現(xiàn)，與對照組和UC組相比，CD組血清中的C16:0-LacCer濃度顯著增加，差異最大，是CD診斷中的最高AUC，最高的特異度和靈敏度。此外，與對照組相比，兩組IBD患者的C20:0-Cer和C18:1-Cer濃度均相應(yīng)升高[40-41]。因此，LacCer18:1/16:0可能是一個對于CD患兒早期篩查有前景的生物標(biāo)志物。

對IBD 患兒的尿液樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，IBD 患兒的尿液代謝譜與健康對照組兒童顯著不同，這些代謝差異包括中樞能量代謝、氨基酸、膽汁酸和腸道微生物代謝產(chǎn)物，其中IBD 患兒的焦谷氨酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸水平顯著升高[42]。在新診斷IBD 患兒中，CD 組尿液中硫代吲哚、羥基吲哚硫酸鹽、苯乙酰谷氨酰胺和唾液酸排泄量高于UC 組，而蘇氨酸、絲氨酸、犬尿氨酸和次黃嘌呤排泄量低于UC組（P＜0.05）。根據(jù)尿絲氨酸/吲哚硫酸鹽比值（AUC=0.972，P＜0.001）可很好地區(qū)分CD和UC[43]。

揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds，VOCs）是代謝組的揮發(fā)性組分，來源于腸道微生物群的持續(xù)代謝過程，這些化合物可在呼出氣體、尿液和糞便中檢測到，是一種新的有前途的篩查腸道炎癥的生物標(biāo)志物[44]。Patel等[45]分析了IBD患兒呼出的VOCs，其中21 個預(yù)先選擇的VOCs 均能正確地區(qū)分IBD 組和健康對照組（P＜0.0001）。多因素logistic回歸分析顯示，3種特異性VOCs[1-辛烯、1-癸烯、（E）-2-壬烯]預(yù)測IBD 的準(zhǔn)確性較好，AUC0.96（95%CI0.93～0.99），但CD和UC患兒之間VOCs無明顯差異。Monasta等[46]通過檢測VOCs中有前景的IBD 生物標(biāo)志物（例如乙酸、丙烯、乙醛、乙腈和甲基乙基酮），也得出了類似結(jié)果，即在呼出的代謝物中可能存在IBD 患兒的獨特呼吸印記。而另一項研究分析腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）/功能性腹痛（functional abdominal pain-not otherwise specified，F(xiàn)AP-NOS）患兒和IBD患兒的糞便VOCs 發(fā)現(xiàn)，兒童IBS/FAP-NOS 可通過糞便VOCs 與IBD 鑒別，且準(zhǔn)確性較高(AUC 0.94，95%CI0.88～1，P＜0.00001)[47]。因此，VOCs分析是一種有潛在應(yīng)用價值的篩查IBD患兒的非侵入性方法，然而，VOCs 分析還沒有規(guī)范化的標(biāo)準(zhǔn)，離臨床應(yīng)用還很遙遠(yuǎn)。

綜上所述，CD患兒早期篩查和診斷的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，然而缺乏大樣本、多中心的前瞻性研究，目前還沒有足夠可靠的非侵入性的指標(biāo)可以在不進(jìn)行內(nèi)鏡檢查和組織活檢的情況下確診CD。未來，重點關(guān)注CD的生物發(fā)病和臨床前階段，對高危因素兒童進(jìn)行早期篩查、隨訪，及早干預(yù)，以改變疾病病程，降低手術(shù)率和致殘率，改善患兒生活質(zhì)量。