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    基因測(cè)序技術(shù)在單基因狼瘡精準(zhǔn)診斷和機(jī)制研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀

    2023-10-26 15:36:22楊智博
    臨床兒科雜志 2023年9期
    關(guān)鍵詞:狼瘡補(bǔ)體干擾素

    楊智博 劉 力

    1.天津市兒童醫(yī)院 天津大學(xué)兒童醫(yī)院綜合內(nèi)科(免疫)(天津 300074);2.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院(天津 300070)

    單基因狼瘡是單基因變異引起的一類表現(xiàn)為狼瘡樣癥狀的自身免疫性疾病總稱,多呈早發(fā)趨勢(shì),通常由兒童免疫科醫(yī)師確診。盡管該病因只占系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)發(fā)病的很小一部分,但了解其機(jī)制有助于臨床醫(yī)師深刻理解并精準(zhǔn)診療SLE。單基因狼瘡患者的臨床癥狀與其他SLE 患者不同,以中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和皮膚癥狀為主,尤其是單基因狼瘡患者會(huì)出現(xiàn)皮膚凍瘡樣皮損[1]。當(dāng)患者臨床癥狀不典型時(shí),精確診斷仍需基因測(cè)序。相關(guān)研究指出,已有30多個(gè)單基因的100 多個(gè)位點(diǎn)變異可致SLE 表型[1]。這些發(fā)現(xiàn)加深了臨床醫(yī)師對(duì)于SLE 的理解,但其他未知的變異也是未來需研究的方向。有研究認(rèn)為,SLE患者早發(fā)型或反復(fù)感染都應(yīng)進(jìn)行免疫檢查和基因檢測(cè)[2]。本文將從單基因狼瘡概念,基因測(cè)序技術(shù)應(yīng)用,以及單基因狼瘡致病機(jī)制等方面進(jìn)行分析,以期為其精準(zhǔn)診斷和治療提供方向。

    1 單基因狼瘡概念與診斷

    單基因狼瘡是SLE 中較為少見的分支,通常在兒童期發(fā)病,與家族遺傳高度相關(guān)。研究表明,89.8%的患者符合歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟/美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(EULAR/ACR)-2019 診斷標(biāo)準(zhǔn),而93.9%患者符合系統(tǒng)性紅斑狼瘡國(guó)際臨床協(xié)助組(SLICC)-2012診斷標(biāo)準(zhǔn)[3],提示僅依據(jù)現(xiàn)有診斷標(biāo)準(zhǔn)判斷SLE 患者是否為單基因變異所致很困難。但有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)SLE 患者滿足以下條件時(shí),應(yīng)高度懷疑單基因狼瘡:①早發(fā)型狼瘡,首發(fā)年齡<10歲;②高度懷疑或者已經(jīng)確診為免疫缺陷,或有反復(fù)感染史;③臨床癥狀不典型;④病情嚴(yán)重,危及生命;⑤病程進(jìn)展快,迅速惡化或器官損傷積累;⑥對(duì)治療不敏感;⑦有家族史;⑧近親結(jié)婚等[4]。還有一項(xiàng)基因異質(zhì)性研究認(rèn)為,當(dāng)兒童早發(fā)型SLE 合并腎臟和血液系統(tǒng)疾病時(shí),更可能為遺傳病因所致[5]。同時(shí),要精準(zhǔn)診斷單基因狼瘡,需要進(jìn)行基因檢測(cè),而若要判斷變異來源,對(duì)患者及直系親屬全部進(jìn)行基因檢測(cè)是精準(zhǔn)診斷的前提。

    2 基因測(cè)序技術(shù)概述及應(yīng)用

    基因測(cè)序技術(shù)可分為全基因組測(cè)序技術(shù)(whole genome sequencing,WGS)、全外顯子測(cè)序技術(shù)(whole exome sequencing,WES)和靶向基因面板測(cè)序(a targeted next-generation sequencing panel,NGS)等。WGS和WES是廣撒網(wǎng)式測(cè)序,而NGS通常只對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行測(cè)序。有研究提到,運(yùn)用父母-子代一家系的樣本進(jìn)行WGS,可找到幾乎所有的單核苷酸變異和絕大多數(shù)更小的插入-刪除變異,同時(shí)確定許多變異的親本來源[6]。通常對(duì)患者血液淋巴細(xì)胞中分離的DNA進(jìn)行基因測(cè)序,利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫和測(cè)序平臺(tái)分析找出變異位點(diǎn),可診斷單基因狼瘡[4-6]。而精準(zhǔn)診療有賴于大量病例報(bào)道中基因測(cè)序確定的致病位點(diǎn)。

    3 基因變異與單基因狼瘡致病機(jī)制

    由單基因變異引起的機(jī)體功能異常而致病的機(jī)制大致可分為以下幾類:①細(xì)胞清除異常;②Ⅰ型干擾素(IFN-1)的過度產(chǎn)生;③自身免疫耐受受損;④其他單基因變異異常等。

    3.1 細(xì)胞清除異常

    細(xì)胞清除異常是指細(xì)胞程序性凋亡的產(chǎn)物不能被及時(shí)清除,從而引起自身免疫性疾病。其中吞噬細(xì)胞清除程序性死亡細(xì)胞的胞葬作用最重要。細(xì)胞清除異常時(shí),任何殘余產(chǎn)物均可作為損傷相關(guān)的分子標(biāo)志物(damage-associated molecular patterns,DAMP),刺激免疫細(xì)胞活化和分化,觸發(fā)免疫反應(yīng),引起自身免疫病。

    3.1.1 補(bǔ)體系統(tǒng)缺陷 補(bǔ)體系統(tǒng)缺陷是單基因狼瘡最早被發(fā)現(xiàn)且最常見的病因。補(bǔ)體系統(tǒng)參與凋亡細(xì)胞的識(shí)別、調(diào)理吞噬和清除作用。具體機(jī)制如下:當(dāng)單基因變異導(dǎo)致補(bǔ)體缺陷時(shí),凋亡細(xì)胞碎片和免疫復(fù)合物不能被清除,暴露成為自身抗原,刺激自身抗體產(chǎn)生,放大自身免疫效應(yīng),且持續(xù)損傷機(jī)體,從而表現(xiàn)出狼瘡樣癥狀。研究表明,早期補(bǔ)體蛋白(C1q、C1r/C1s、C2和C4)缺陷被認(rèn)為是由于調(diào)理作用受損而觸發(fā)自身免疫導(dǎo)致,這對(duì)清除免疫復(fù)合物和吞噬細(xì)胞凋亡小體至關(guān)重要[1]。還有研究指出,雜合的C2缺陷變異與低復(fù)制量的C4A同時(shí)存在時(shí),是SLE 等疾病的重要危險(xiǎn)因素之一[7]。有病例報(bào)道發(fā)現(xiàn),當(dāng)絲氨酸蛋白酶抑制劑家族G成員1(serpin family G member 1,SERPING-1)基因發(fā)生移碼變異時(shí),血漿中C1 抑制劑(C1-INH)的水平變低,遺傳的C1-INH 缺陷會(huì)導(dǎo)致自發(fā)的早期補(bǔ)體經(jīng)典途徑活化,消耗患者血漿中C4,導(dǎo)致單基因狼瘡[8]。還有研究發(fā)現(xiàn),p.His198Gln變異的C1q和腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白4(C1q and tumor necrosis factor related protein 4,C1QTNF4)蛋白在TNF-α 刺激下抑制NF-κB 的激活,該變異位于C1q 第二結(jié)構(gòu)閾,在C1QTNF4基因中功能改變也可導(dǎo)致早發(fā)型SLE[9]。

    需注意的是,補(bǔ)體缺陷與早發(fā)型狼瘡相關(guān),但其性別比差異不大,關(guān)節(jié)炎多見C2缺乏,狼瘡腎多見C4A/ C4b 缺陷,抗核抗體(ANA)常見,但只有20%的患者顯示抗ds-DNA,相反,抗Ro/SSA抗體在80%的C1q和C4缺陷患者中呈陽性,補(bǔ)體遺傳缺陷中也可見血清總補(bǔ)體CH50水平低下和正常的血清C4、C3水平[10]。具有狼瘡樣表現(xiàn)和高ANA滴度(>1:1000)的兒童,尤其是發(fā)病初癥狀非典型的,如復(fù)發(fā)性肺炎和支氣管擴(kuò)張,也應(yīng)該考慮C4缺乏型單基因狼瘡[11]??傊?,單基因變異引起的補(bǔ)體系統(tǒng)缺陷很可能導(dǎo)致患者表現(xiàn)為狼瘡,通常早發(fā)、嚴(yán)重且可追溯家族史,變異引起細(xì)胞清除異常是導(dǎo)致單基因狼瘡的主要致病機(jī)制之一。

    3.1.2 核酸降解相關(guān)酶缺陷 基因組廣泛關(guān)聯(lián)研究(genome wide association studies,GWAS)已發(fā)現(xiàn)30 多個(gè)單基因的100 多個(gè)位點(diǎn)變異導(dǎo)致SLE 表型,如TREX1、SAMHD1、DNASE1、DNASE1L3、TMEM173等,與單基因SLE 的脫氧核糖核苷酸1(deoxyribonuclease 1,DNASE1)密切相關(guān),脫氧核糖核苷酸1樣3(deoxyribonuclease 1 like 3,DNASE1L3)基因編碼的主要酶可以分裂單鏈和雙鏈DNA,并從病原體和凋亡細(xì)胞中去除外源DNA和自體DNA[12]。DNASE1/DNASE1L3基因缺陷導(dǎo)致細(xì)胞外核酸的積累,血漿中低于120bp的短DNA分子數(shù)量增加與抗dsDNA抗體的存在有關(guān)[13],而攜帶長(zhǎng)DNA分子的微粒具有免疫原性,與其相關(guān)的抗原可能會(huì)造成狼瘡腎損害[14]。這些胞外累積的核酸也可被toll樣受體(TLR7和TLR9)等DNA/RNA傳感器識(shí)別,導(dǎo)致IFN-1的過度生成,從而導(dǎo)致單基因狼瘡。有學(xué)者認(rèn)為,癥狀早發(fā)、肺出血、腎小球腎炎、復(fù)發(fā)性蕁麻疹和抗中性粒細(xì)胞抗體(ANCA)陽性等表現(xiàn)提示臨床上要警惕單基因狼瘡,特別是青少年SLE中DNASE1L3缺陷的單基因狼瘡[15]。基因測(cè)序應(yīng)用有助于發(fā)現(xiàn)這些基因變異位點(diǎn)。

    3.2 干擾素過度產(chǎn)生

    IFN 是可以限制病毒復(fù)制組裝的抗病毒細(xì)胞因子。盡管IFN-1 可以保護(hù)機(jī)體免受病毒侵害,但I(xiàn)FN-1 的過度產(chǎn)生同樣會(huì)使患者出現(xiàn)單基因狼瘡。IFN-1 的過度表達(dá)可以通過以下機(jī)制發(fā)生:核酶活性的缺陷(TREX1、SAMHD1、ADAR1、RNASEs、DNASEs),IFN 信號(hào)抑制調(diào)控因子的缺陷(ISG15、USP18)和先天免疫傳感器的組合活化(MDA5、RIG-I、STING)等[1]。IFN-1 與異二聚體受體(IFNAR1和IFNAR2)結(jié)合,激活Janus 激酶(JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號(hào)通路,誘導(dǎo)數(shù)百個(gè)干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene,ISG)的轉(zhuǎn)錄[1]。這些途徑的任何編碼基因發(fā)生變異時(shí)都會(huì)導(dǎo)致IFN-1 的過度表達(dá),從而導(dǎo)致Ⅰ型干擾素疾病,如單基因狼瘡。

    例如,Aicardi-Goutières 綜合征(AGS)就是一種典型的Ⅰ型干擾素疾病,它是由單基因變異引起,表現(xiàn)為狼瘡樣癥狀的綜合征。對(duì)于早發(fā)的凍瘡樣皮損、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(顱內(nèi)鈣化、白質(zhì)病變、肌張力異常)、發(fā)育遲緩、自身免疫抗體陽性、SLE 臨床表現(xiàn)不典型或常規(guī)治療無效的SLE 患者,應(yīng)考慮AGS[16]。宿主DNA可以通過干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)變異觸發(fā)胞漿內(nèi)的固有傳感器,并激活干擾素產(chǎn)生和ISG 的表達(dá)上調(diào)[17]。所有攜帶DNA 代謝酶的功能缺失性變異(如TREX1或SAMHD1)或DNA傳感器/適配器功能獲得性變異(TMEM173/STING1)的患者在AGS或嬰兒發(fā)病的STING 相關(guān)血管炎(SAVI)這兩種疾病中都分別表現(xiàn)出高且持續(xù)的ISG 表達(dá)[17]。說明了ISG 的表達(dá)增加在相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用。

    脊椎軟骨發(fā)育不良伴免疫調(diào)節(jié)異常(SPENCDI)也屬Ⅰ型干擾素病,是一種罕見的常染色體隱性遺傳的骨骼發(fā)育不良,以椎體和干骺端放射性病變?yōu)樘卣鱗18],其免疫調(diào)節(jié)異??梢员憩F(xiàn)為SLE 等自身免疫病。該病由抗酒石酸酸性磷酸酶5(acid phosphatase 5,ACP5)基因純合變異導(dǎo)致的酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRAP)失活所引起[19],在非核酸相關(guān)的刺激/調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素途徑中發(fā)揮作用[18-20]。當(dāng)該病患者的免疫調(diào)節(jié)異常表現(xiàn)為狼瘡時(shí),這也是一種單基因狼瘡。

    3.3 自身免疫耐受受損

    SLE 患者體內(nèi)廣泛存在自身抗體,當(dāng)某些基因變異時(shí),自身反應(yīng)性T細(xì)胞或B細(xì)胞無效清除,對(duì)其陰性選擇失效就會(huì)觸發(fā)自體免疫和耐受受損,從而發(fā)生自身免疫性疾病,如單基因狼瘡。

    3.3.1 T 細(xì)胞免疫耐受受損 鼠類肉瘤病毒基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,KRAS)基因變異時(shí),增強(qiáng)了絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路(RAS-MAPPK)的傳導(dǎo)信號(hào),刺激淋巴細(xì)胞增殖,并抑制T 淋巴細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致單基因狼瘡等癥狀出現(xiàn),在臨床上稱為Noonan 綜合征。如NRAS、SOS1、PTPN11、RAF和SHOC2等基因變異也與Noonan綜合征相關(guān)[10]。

    3.3.2 B細(xì)胞免疫耐受受損 蛋白激酶Cδ(protein kinase C delta,PRKCD)基因編碼的蛋白激酶Cδ(PKC-δ)是一種促凋亡因子,作用于B細(xì)胞的凋亡。當(dāng)PRKCD基因純合錯(cuò)義變異時(shí),PKC-δ表達(dá)降低,B 細(xì)胞凋亡減少導(dǎo)致未成熟的B 細(xì)胞過度聚集,自身抗體增多,形成免疫復(fù)合物而出現(xiàn)一系列自身免疫性疾病癥狀[10]。

    TLR7 是一種病毒RNA 的傳感器,TLR7 信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)也是自身免疫性疾病的一種發(fā)病機(jī)制。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),由于TLR7 功能獲得性變異引起對(duì)鳥苷的親和力增加,TLR7激活閾值降低會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞驅(qū)動(dòng)自身免疫,造成SLE等自身免疫疾病[21]。TLR7促進(jìn)了被B 細(xì)胞受體激活的高自身反應(yīng)性未成熟B細(xì)胞的異常存活,并以細(xì)胞固有的方式累積CD11c+年齡相關(guān)B 細(xì)胞和生發(fā)中心B 細(xì)胞,濾泡和濾泡外輔助性T 細(xì)胞也隨之增加。雖然人類TLR7Y264H變異足以在小鼠中誘導(dǎo)出狼瘡,但除了增加Ⅰ型干擾素基因轉(zhuǎn)錄外,對(duì)核苷酸酶H2亞基B(ribonuclease H2subunit B,RNASEH2B)半合子沒有明顯的增加效應(yīng),在存在環(huán)境因素刺激的情況下,該變異在人類中的作用可能會(huì)增加,包括依賴TLR7 免疫的單鏈RNA病毒,如新冠病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)等[22]。這證明了失調(diào)的TLR7 能夠驅(qū)動(dòng)自身抗體產(chǎn)生和SLE 的發(fā)生,或許可以為治療單基因狼瘡提供新思路。

    P2Y受體8(P2Y receptor family member 8,P2RY8)是一種在抑制生發(fā)中心B細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中具有既定作用的受體,P2RY8 雜合錯(cuò)義變異同樣會(huì)對(duì)B 細(xì)胞免疫耐受造成損傷并導(dǎo)致SLE 癥狀。低P2RY8水平與狼瘡性腎炎相關(guān),與年齡相關(guān)B細(xì)胞和漿細(xì)胞的增加相關(guān)[23]。編碼區(qū)變異或某些環(huán)境因素可以損害狼瘡患者的P2 RY8 功能,導(dǎo)致P2RY8減少。

    3.4 其他單基因變異引起的狼瘡

    有病例報(bào)道,在單基因狼瘡患者中發(fā)現(xiàn)了脂多糖應(yīng)答性米色樣錨定蛋白(lipopolysaccharideresponsive beige-like anchor protein,LRBA)基因變異缺陷[24]。LRBA促進(jìn)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA4)表達(dá),SLE患者的T細(xì)胞在激活時(shí)不能上調(diào)CTLA4,該通路的改變則可能是LRBA 缺陷導(dǎo)致單基因狼瘡的致病機(jī)制。

    某些狼瘡繼發(fā)于單基因變異引起的原發(fā)性免疫缺陷類疾病。如RAG1、NRAS、PIK3CD、PSYPIP1、TNFAIP3等單基因雜合變異引起原發(fā)性免疫缺陷疾病,都可能繼發(fā)狼瘡[25]。此外,胞質(zhì)分裂作用因子8(dedicator of cytokinesis 8,DOCK8)缺陷導(dǎo)致的高IgE綜合征也會(huì)表現(xiàn)為SLE[26]。

    4 結(jié)論與展望

    近年來,隨著基因測(cè)序技術(shù)在SLE 患者診斷及研究中的廣泛應(yīng)用,很多單基因相關(guān)的變異被發(fā)現(xiàn),其中有許多罕見變異位點(diǎn),也有越來越多的兒童患者及其家庭愿意參與基因測(cè)序來尋找病因,為深入了解單基因狼瘡的致病機(jī)制提供了思路與方向。相關(guān)研究分析表明,罕見變異所受到連鎖不平衡的影響遠(yuǎn)小于常規(guī)變異[27]。已有學(xué)者把已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的31 個(gè)單基因狼瘡變異位點(diǎn)(C1QA、C1QB、C1QC、C1R、C1S、C2、C3、TREX1、RNASEH2A、RNASEH2B、RNASEH2C、SAMHD1、ADAR、DNASE1、DNASE1L3、PRKCD、ACP5、SLC7A7、IFIH1、TMEM173、ISG15、CYBB、FAS、FASLG、KRAS、NRAS、MAN2B1、PEPD、PTPN11、RAG2、SHOC2)作為靶向基因,運(yùn)用NGS診斷自身炎性疾病。所有早發(fā)型SLE患者,無論有無家族史,都應(yīng)該通過NGS檢測(cè)單基因缺陷[28]??傊蟛糠肿儺惗际峭ㄟ^影響炎癥通路和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)生自身抗體或有害炎癥因子,通過其持續(xù)作用而導(dǎo)致自身免疫性疾病如單基因狼瘡的發(fā)生。

    過去,狼瘡的治療藥物選擇有限,大多采用激素和免疫抑制劑等非特異性治療,但隨著對(duì)單基因狼瘡認(rèn)識(shí)的加深,既有助于更全面了解SLE 這類疾病,也可為針對(duì)不同的致病途徑進(jìn)行精準(zhǔn)阻斷治療提供新的方向和依據(jù)。比如,貝利木單抗是一種人源性單克隆IgG抗體,可抑制B淋巴細(xì)胞刺激因子,導(dǎo)致B 細(xì)胞數(shù)量減少并調(diào)節(jié)其功能,可有效緩解成人SLE 患者的皮膚和關(guān)節(jié)癥狀,也有其治療兒童單基因狼瘡患者(C1q 缺陷)后關(guān)節(jié)炎癥狀得到完全緩解的先例,因此貝利木單抗可作為一種輔助治療應(yīng)用于難治性單基因狼瘡患者[29]。此外還有其他治療手段,如某病例報(bào)道中提到的,應(yīng)用造血干細(xì)胞移植治療表現(xiàn)為SLE 的DOCK8 缺陷患者[26]。補(bǔ)充DNASE1L3也可以作為一種療法,用來幫助該種缺陷的患者[13]。更有新鮮冰凍血漿和造血干細(xì)胞移植應(yīng)用到C1q缺乏的早發(fā)型SLE患者中,替代由單核細(xì)胞產(chǎn)生蛋白缺失的先例等[30]。

    盡管已有很多前期研究,但由于該病患者基數(shù)小且大部分為兒童,診療與成人患者相比更具有局限性和不確定性,對(duì)單基因狼瘡的認(rèn)識(shí)仍不足。在未來,發(fā)現(xiàn)更多可能的變異位點(diǎn),厘清發(fā)病機(jī)制仍是研究單基因狼瘡的努力方向,精準(zhǔn)診療等也需要更深入的討論和驗(yàn)證。

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