綠萼鳳仙花和滇水金鳳MYB61基因克隆及表達(dá)分析

向南星 李澤鳳 李新藝 魏春梅 黃美娟 黃海泉

關(guān)鍵詞：綠萼鳳仙花；滇水金鳳；MYB61；木質(zhì)素；表達(dá)分析

在低等植物向高等植物進(jìn)化過程中，植物木質(zhì)化是適應(yīng)陸地環(huán)境的關(guān)鍵表現(xiàn)之一[1]；木質(zhì)化是指木質(zhì)素單體氧化聚合形成的木質(zhì)素在細(xì)胞壁上沉積，使植物細(xì)胞壁增厚的過程[2]；木質(zhì)素的沉積過程一般發(fā)生在次生木質(zhì)部，具有增強植物的機械支撐力、保障植物體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)長距離運輸及提高生物及非生物脅迫能力等功能[3-6]。近年來，隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)和蛋白組學(xué)等方面的發(fā)展，植物木質(zhì)化的分子調(diào)控機制已得到深入的研究。木質(zhì)素作為植物生長發(fā)育過程中的一種次生代謝產(chǎn)物，其合成受轉(zhuǎn)錄因子和激素酶等制約；其中MYB、NAC和WRKY類轉(zhuǎn)錄因子家族主要參與調(diào)控木質(zhì)素生物合成和其他次級細(xì)胞壁形成的相關(guān)途徑[7-8]；尤以MYB類轉(zhuǎn)錄因子在此過程中發(fā)揮直接且重要的調(diào)控作用。

MYB家族作為植物中最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其主要調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程，如代謝調(diào)節(jié)、生物和非生物的應(yīng)激響應(yīng)、細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期的控制等[9]。MYB家族基因均含有一段高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域[10]；根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和基序重復(fù)類型及個數(shù)不同，將其分成1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB[11]。研究表明，R2R3-MYB廣泛參與苯丙烷類代謝途徑，如調(diào)控木質(zhì)素的生物合成、次生代謝和細(xì)胞分裂等方面[12]。研究發(fā)現(xiàn)源自擬南芥的AtMYB61屬于R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子，主要參與調(diào)控植物木質(zhì)部木質(zhì)化和氣孔孔徑等方面[13-15]；源自神農(nóng)香菊的CiMYB61基因在煙草中過表達(dá)時，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草的莖和葉中的木質(zhì)素含量顯著增加[16]；在擬南芥中過表達(dá)AtMYB61會使木質(zhì)素異位沉積[13-14]；且MYB61是調(diào)控水稻細(xì)胞壁中纖維素合成的顯性因子之一[17-18]；綜上，MYB61基因參與調(diào)控了植物木質(zhì)素的生物合成。

我國鳳仙花屬（ImpatiensL.）植物資源極為豐富，約有270余種，且主要分布于中國西南地區(qū)[19]；根據(jù)鳳仙花對水分的依賴程度，主要分為水生、濕生和陸生三大類型，且不同類型鳳仙花的木質(zhì)化程度存在較大差異[20]。綠萼鳳仙花（Impatienschlorosepala）和滇水金鳳（Impatiensuliginosa）主要分布在云南省和貴州省，因花型獨特、分枝能力強和花期長等特點，可作為園林植物予以開發(fā)利用[21]；綠萼鳳仙花生長于山谷溪水或疏林旁，其莖匍匐肉質(zhì)且含水量大，屬于典型的濕生鳳仙花；滇水金鳳主要在水中生長，其莖直立且空心，易倒伏，屬于典型的水生鳳仙花。滇水金鳳和綠萼鳳仙花木質(zhì)化的研究不僅能對該屬植物從水生到陸生的適應(yīng)機制作出相應(yīng)判斷，還有助于培育更健壯的鳳仙花植株。目前，尚無滇水金鳳和綠萼鳳仙花木質(zhì)素相關(guān)基因MYB61的報道。本研究以綠萼鳳仙花和滇水金鳳為試驗材料，分離克隆MYB61基因，并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育分析；采用qRT-PCR闡釋其在這2種鳳仙花的3個不同部位2個時期的時空表達(dá)模式，結(jié)合木質(zhì)素總含量的測定結(jié)果，進(jìn)而探討MYB61基因在綠萼鳳仙花和滇水金鳳木質(zhì)素生物合成中的功能與作用，為后期進(jìn)一步探究不同鳳仙花木質(zhì)化差異及新品種培育提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為綠萼鳳仙花和滇水金鳳，綠萼鳳仙花種植于西南林業(yè)大學(xué)的樹木園中，滇水金鳳采摘于昆明市撈魚河公園。采取這2種鳳仙花幼苗期和成熟期地下5cm處的根、距頂端的第5片葉和地上5cm處的莖桿。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取與MYB61基因的克隆按照RNA提取試劑盒（OMEGA）操作步驟提取綠萼鳳仙花和滇水金鳳莖的總RNA；再使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金）將RNA合成cDNA，并將其置于–20℃冰箱備用。利用本課題組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用cDNA模板和引物對MYB61基因進(jìn)行PCR擴增，其體系為50.0μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性50s，58℃（IuMYB61）/59℃（IcMYB61）退火1min，72℃延伸1min，36個循環(huán)；72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物回收純化后連接到pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌液交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2MYB61基因的生物信息學(xué)分析IcMYB61和IuMYB61基因的理化性質(zhì)通過ExPASy在線軟件（https：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行分析；利用SMART在線軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/opennewwindow）對其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析預(yù)測，再使用CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對它們的超級家族進(jìn)行預(yù)測。通過NCBI數(shù)據(jù)庫Blast工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）查找同源性高的序列，再用DNAMAN9.0軟件完成序列的多重比對及同源性分析；在MEGA-X軟件上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3MYB61基因的表達(dá)特性分析提取綠萼鳳仙花和滇水金鳳在幼苗期和成熟期根、莖和葉的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過Primerdesigningtool.nih.gov網(wǎng)站設(shè)計IcMYB61基因的熒光定量引物（表2）。參照丁愛琴等[22]的內(nèi)參基因的2–ΔΔCT法，對每個部位進(jìn)行3次生物重復(fù)，將根作為對照，計算出MYB61基因在2個不同時期綠萼鳳仙花和滇水金鳳的3個不同部位中的相對表達(dá)量，利用SPSSStatistics25軟件對得到的相對表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，再使用Origin2021軟件對分析結(jié)果作直觀視圖。

1.2.4木質(zhì)素含量的測定將成熟期綠萼鳳仙花和滇水金鳳整株的新鮮的莖和葉在60℃下烘干至恒重，每個樣品3次重復(fù)，詳細(xì)步驟參照胡慧貞[23]的木質(zhì)素含量測定方法，得到木質(zhì)素酸溶和酸不溶的總含量，使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1MYB61基因的克隆

以綠萼鳳仙花和滇水金鳳的cDNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增后得到目的片段（圖1），將結(jié)果序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)，序列一致，分別將其命名為IcMYB61（登錄號：OP490310）和IuMYB61（登錄號：OP490311）；將其cDNA序列與gDNA序列全長比對發(fā)現(xiàn)，IcMYB61和IuMYB61基因均由2個外顯子和1個內(nèi)含子構(gòu)成，均在上游，其內(nèi)含子長度分別為84bp和66bp（圖2）。

2.2MYB61基因的理化性質(zhì)分析

利用ExPasy-ProtParam在線軟件對綠萼鳳仙花和滇水金鳳MYB61基因進(jìn)行分析（表3），IcMYB61和IuMYB61全長分別為1035bp和1002bp，分別編碼344aa和333aa；不穩(wěn)定指數(shù)分別為67.67和65.89，其數(shù)值高于40，故IcMYB61和IuMYB61均為不穩(wěn)定蛋白；總平均親水指數(shù)分別為–0.728和–0.716，其數(shù)值均低于0，推測IcMYB61和IuMYB61為親水性蛋白。

2.3MYB61基因的結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析

綠萼鳳仙花和滇水金鳳MYB61基因的結(jié)構(gòu)域與保守域預(yù)測結(jié)果表明，IcMYB61和IuMYB61基因的2個典型SANT保守結(jié)構(gòu)域均在13～63和66～114位氨基酸之間（圖3）。通過DNAMAN9.0軟件對試驗的IcMYB61和IuMYB61與其他物種MYB61基因進(jìn)行氨基酸同源序列比對分析（圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IcMYB61和IuMYB61基因與其他植物的氨基酸序列的一致性為56.7%，且同源性主要在N端較高，C端的一致性較低，說明綠萼鳳仙花、滇水金鳳和其他物種的MYB61基因在C端的差異均較大。

利用MEGA-X軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ），根據(jù)綠萼鳳仙花和滇水金鳳MYB61及其他MYB61同源物種的氨基酸序列，從1000個重復(fù)中推導(dǎo)出bootstrap共識樹，并構(gòu)建IcMYB61和IuMYB61基因與其他MYB61基因同源物種的系統(tǒng)發(fā)育分析樹，從圖5可以看出IcMYB61和IuMYB61基因與喜馬拉雅鳳仙花MYB61基因聚為一個大支，IuMYB61基因與喜馬拉雅鳳仙花（ImpatiensglanduliferaXP047337748.1）的同源性較IcMYB61更高，說明IuMYB61與喜馬拉雅鳳仙花的親緣關(guān)系更近，在一定程度上可以證明同一個屬的親緣關(guān)系更近。

2.4MYB61基因的表達(dá)分析

通過qRT-PCR檢測IcMYB61和IuMYB61基因分別在綠萼鳳仙花和滇水金鳳的不同部位中的表達(dá)情況，從圖6可以看出，IcMYB61和IuMYB61基因在綠萼鳳仙花和滇水金鳳的根、莖和葉3個部位（根、莖和葉）及2個不同時期（幼苗期、成熟期）中均有表達(dá)。IcMYB61和IuMYB61基因均在2個時期的根中表達(dá)量最低，在成熟期的莖中表達(dá)量最高；IcMYB61基因在綠萼鳳仙花幼苗期的葉中表達(dá)量最高，莖次之，而在成熟期的莖中表達(dá)量最高，葉次之。IuMYB61基因在滇水金鳳2個時期均表現(xiàn)出在莖中的表達(dá)量最高，葉次之；上述結(jié)果表明IcMYB61和IuMYB61基因主要在成熟期的莖和幼苗期的莖和葉中發(fā)揮作用。

2.5木質(zhì)素總量變化分析

從表4中發(fā)現(xiàn)，在滇水金鳳和綠萼鳳仙花的莖和葉的木質(zhì)素總含量存在顯著差異（P<0.05），經(jīng)對比分析發(fā)現(xiàn)，莖的木質(zhì)素總含量均明顯高于葉的木質(zhì)素含量，且在滇水金鳳中表現(xiàn)更為顯著；由于滇水金鳳的莖為直立莖，綠萼鳳仙花的莖為匍匐莖，說明木質(zhì)素的含量與莖的直立程度有關(guān)。

3討論

MYB是對植物生長發(fā)育過程中影響最大的家族之一，自PAZ-ARES等從玉米（Zeamays）中克隆出首個與類黃酮合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子C1（Colorless1）后[24]，不同植物中的MYB類轉(zhuǎn)錄因子相繼被克隆，并對其功能進(jìn)行探究及分析；目前MYB61基因在水稻（Oryzasativa）、神農(nóng)香菊（Chrysanthemumindicumvar.aromaticum）和模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）等植物中已有研究，其功能主要涉及到纖維素的合成和木質(zhì)化的異位沉積等[13，16-17]。本研究通過克隆獲得了綠萼鳳仙花和滇水金鳳的MYB61基因，其cDNA全長分別為1035bp和1002bp；基因分別編碼344aa和333aa，且都有一個內(nèi)含子，均為不穩(wěn)定親水性蛋白，與白樺MYB61的研究結(jié)果一致[25]；CDD分析結(jié)果表明IcMYB61和IuMYB61具有2個典型的SANT結(jié)構(gòu)域，與ZHANG等[26]和BOYER等[27]的研究結(jié)果相似，與R2R3-MYB亞家族的基本結(jié)構(gòu)研究相吻合[28]，推測IcMYB61基因?qū)儆赗2R3-MYB家族；系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，IcMYB61和IuMYB61基因與喜馬拉雅鳳仙花聚為一支，驗證了同一屬的親緣關(guān)系最近。

植物細(xì)胞在所有細(xì)胞中都能合成初級細(xì)胞壁（primarycellwall，PCW），但只有在特定類型的細(xì)胞中才能產(chǎn)生次級細(xì)胞壁（secondarycellwall，SCW），如雙子葉植物中的木質(zhì)部導(dǎo)管和纖維，它們可以傳導(dǎo)水分和提供機械支持[29]；而這些SCW特異性生物聚合物的合成需要由SCW特異性轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控[30]；有研究發(fā)現(xiàn)神農(nóng)香菊CiMYB61在煙草中過表達(dá)時，葉和莖的硬度顯著增加，且轉(zhuǎn)基因株系的木質(zhì)素含量增加30%～45%[16]；MYB61基因在水稻中過表達(dá)也出現(xiàn)植株木質(zhì)化現(xiàn)象[18]；MYB61在芒草中被認(rèn)為是直接調(diào)控木質(zhì)素單體形成的基因，能直接激活C4L、CCR和HCT等調(diào)控木質(zhì)素合成的相關(guān)基因的表達(dá)[17]，MYB61調(diào)控木質(zhì)素合成功能基因在其他單子葉和雙子葉植物中也有報道[30-31]。綜上所述MYB61在促進(jìn)木質(zhì)素合成過程中發(fā)揮了重要作用。已有研究表明MYB61在大部分植物中均有表達(dá)，且在不同植物的不同部位的表達(dá)量差異較大，主要在莖和葉中的表達(dá)量更高[16，25]；本研究的qRT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IcMYB61和IuMYB61在2個時期的根、莖和葉中均有表達(dá)，在幼苗期和成熟期的根中的表達(dá)量均最低，但均在成熟期的莖中表達(dá)量最高，與白樺等植物的研究結(jié)果一致[16]，推測MYB61主要在鳳仙花的莖中發(fā)揮作用。幼苗期時，MYB61基因在綠萼鳳仙花中葉的表達(dá)量最高，而滇水金鳳莖的表達(dá)量高于葉，這可能是由于在幼苗期滇水金鳳的直立莖比綠萼鳳仙花的匍匐肉質(zhì)莖的木質(zhì)素含量更高；在成熟期時，MYB61基因在綠萼鳳仙花和滇水金鳳中，莖的表達(dá)量均最高，和本研究的木質(zhì)素總含量趨勢一致，這與神農(nóng)香菊的研究結(jié)果一致[25]；可以推測IcMYB61和IuMYB61基因在綠萼鳳仙花和滇水金鳳的木質(zhì)化生物合成中發(fā)揮了重要作用，但其具體功能及作用機理還有待于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因功能驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)IcMYB61和IuMYB61基因?qū)儆邙P仙花中的R2R3-MYB亞家族成員，同時對其在綠萼鳳仙花和滇水金鳳的不同時期不同部位的時空表達(dá)模式及相關(guān)木質(zhì)素的含量進(jìn)行了分析，推測IcMYB61和IuMYB61基因均在木質(zhì)素生物合成中發(fā)揮重要作用，在一定程度上為探究鳳仙花木質(zhì)素合成的分子機制提供了一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而且為鳳仙花品種改良及創(chuàng)新提供一定的理論依據(jù)。