不同溫型巨大側(cè)耳菌株的生物學(xué)特性及液體發(fā)酵條件研究

李婧怡 駢永茹 嚴(yán)廷良 楊陽(yáng) 李勤奮 李玉

關(guān)鍵詞：巨大側(cè)耳；不同溫型；營(yíng)養(yǎng)需求；生長(zhǎng)條件；生物量

巨大側(cè)耳[Pleurotusgiganteus（Berk.）Karun.&K.D.Hyde]，又名大杯蕈、巨大香菇、豬肚菇，是國(guó)內(nèi)新開(kāi)發(fā)的一種珍稀食藥用菌[1-2]。其營(yíng)養(yǎng)豐富、口味獨(dú)特，具有抗腫瘤、抗氧化、降低肝損傷等多種藥用功能，備受消費(fèi)者青睞，具有較高的潛在市場(chǎng)價(jià)值[3]。巨大側(cè)耳的纖維素降解能力強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)性高、栽培技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，逐步引起食用菌生產(chǎn)者的重視，其栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大，目前已涵蓋浙江、山東、北京、上海、云南、廣東、福建、海南等多個(gè)?。ㄊ校4]。熱帶地區(qū)年平均氣溫較高，對(duì)食用菌出菇溫度要求嚴(yán)格，但多數(shù)食藥用菌屬于中低溫型，如雙孢菇（16～18℃）[5]、金針菇（10～15℃）[6]、黑木耳（20～25℃）[7]等，適合熱區(qū)規(guī)模化栽培的食用菌種類相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)，野生巨大側(cè)耳多于夏末秋初的炎熱季節(jié)出現(xiàn)，主要分布于我國(guó)華中、華南地區(qū)，以及東南亞和大洋洲等熱帶及亞熱帶地區(qū)，人工栽培時(shí)也適宜在氣溫較高的夏季出菇，對(duì)于解決食用菌生產(chǎn)淡季和調(diào)節(jié)市場(chǎng)供應(yīng)具有一定意義，特別是為熱區(qū)食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供新機(jī)遇[8]。

種質(zhì)資源是食用菌研究的基礎(chǔ)，高質(zhì)量的菌種在食用菌產(chǎn)業(yè)中至關(guān)重要[9]。近年來(lái)，隨著溫室效應(yīng)的不斷加劇，高溫已成為限制食用菌在熱區(qū)栽培的主要因素，耐高溫菌株的選育十分迫切。課題組通過(guò)前期在熱區(qū)進(jìn)行巨大側(cè)耳的規(guī)?；耘?，篩選到2株具有不同出菇溫型的巨大側(cè)耳菌株，中溫型菌株P(guān)G79的適宜出菇溫度為22～24℃，適合熱區(qū)的涼季（干季）栽培；高溫型菌株P(guān)G46可耐受25℃以上高溫，適宜出菇溫度為26～30℃，適合熱區(qū)的熱季（濕季）栽培。不同溫型巨大側(cè)耳菌株的獲得，為我國(guó)熱區(qū)全年栽培巨大側(cè)耳提供了寶貴材料。

菌絲階段是食用菌生長(zhǎng)發(fā)育的重要階段，菌絲體培養(yǎng)質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響食用菌出菇產(chǎn)量的高低[10]。因此，探究2株不同溫型巨大側(cè)耳菌絲體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求和環(huán)境條件，對(duì)巨大側(cè)耳的擴(kuò)大化培養(yǎng)和穩(wěn)定栽培至關(guān)重要。本研究采用單因素和正交試驗(yàn)的方法，對(duì)不同溫型巨大側(cè)耳菌株進(jìn)行生物學(xué)特性分析和液體發(fā)酵條件優(yōu)化，并對(duì)液體發(fā)酵中菌絲體生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行研究，旨在獲得巨大側(cè)耳菌絲體生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，以及不同溫型菌株間的營(yíng)養(yǎng)需求和生長(zhǎng)條件差異。研究結(jié)果可為巨大側(cè)耳的規(guī)?；耘嗟於ɑA(chǔ)，進(jìn)而推動(dòng)熱區(qū)食用菌產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株實(shí)驗(yàn)室通過(guò)前期在熱區(qū)進(jìn)行規(guī)?；耘啵Y選到2株不同溫型的巨大側(cè)耳菌株，分別為高溫型菌株P(guān)G46，中溫型菌株P(guān)G79，菌種現(xiàn)保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所菌種保藏中心。

1.1.2供試培養(yǎng)基使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，瓊脂20g，加水混勻后定容至1L。

1.2方法

1.2.1生物學(xué)特性分析取4℃試管斜面保存的菌種，接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化，28℃恒溫暗培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)至平板直徑的3/4，用于后續(xù)試驗(yàn)。

（1）碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響。分別以可溶性淀粉、蔗糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖為碳源，以不加碳源為對(duì)照。用直徑8mm的無(wú)菌藍(lán)槍頭在已活化菌落邊緣打孔取菌塊，將菌塊接種至碳源培養(yǎng)基正中央，28℃恒溫暗培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿平板，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。采用“十”字交叉法，每隔24h測(cè)量記錄菌落直徑，并拍照觀察。

（2）氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響。分別以酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨和氯化銨為氮源，以不加氮源為對(duì)照。方法同1.2.1-（1）。

（3）溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，按照1.2.1-（1）接種后，分別置于15、20、25、30、35、40℃培養(yǎng)箱恒溫暗培養(yǎng)，分析適宜菌絲體生長(zhǎng)的溫度范圍。然后，在適宜溫度范圍內(nèi)劃分為20、23、25、28、30℃，明確菌絲體最適生長(zhǎng)溫度。測(cè)量方法同1.2.1-（1）。

（4）pH對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，用1mol/LHCL和1mol/LNaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5、6、7、8、9，自然pH為對(duì)照。方法同1.2.1-（1）。

（5）正交試驗(yàn)?；趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果，分別從各因素中選取3個(gè)長(zhǎng)勢(shì)最好的培養(yǎng)條件，組成4因素3水平的正交試驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化。方法同1.2.1-（1）。

1.2.2液體發(fā)酵條件優(yōu)化基于生物學(xué)特性試驗(yàn)，在PG46和PG79的最適培養(yǎng)條件下，開(kāi)展巨大側(cè)耳液體發(fā)酵的最適裝液量、轉(zhuǎn)速和接種量探究試驗(yàn)，并探究菌絲動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)規(guī)律[11-12]。

（1）裝液量試驗(yàn)。配制液體培養(yǎng)基時(shí)，在250mL三角瓶中，分別加入80、100、120、150、180、200mL培養(yǎng)基。高溫滅菌后，調(diào)節(jié)pH為7，每瓶接入10片直徑5mm的菌塊，置于搖床中恒溫暗培養(yǎng)，設(shè)置轉(zhuǎn)速150r/min，溫度28℃。培養(yǎng)10d后，烘干稱菌絲體干重。

（2）轉(zhuǎn)速試驗(yàn)。在250mL三角瓶中加入120mL培養(yǎng)基，接種后分別置于轉(zhuǎn)速為100、120、150、180、200r/min的搖床中培養(yǎng)10d。方法同1.2.2-（1）。

（3）接種量試驗(yàn)。在250mL三角瓶中加入120mL的培養(yǎng)基，分別設(shè)置6%、8%、10%、12%、15%的接種量，置于150r/min搖床振蕩培養(yǎng)10d。方法同1.2.2-（1）。

（4）生物量動(dòng)態(tài)檢測(cè)。以干重法測(cè)生物量。在液體發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別以120mL裝液量（250mL三角瓶）、150r/min轉(zhuǎn)速和12%接種量為最適條件，進(jìn)行液體發(fā)酵。從發(fā)酵第3天開(kāi)始，每隔2d取樣進(jìn)行烘干稱重，直至菌絲體的干重趨于平穩(wěn)為止，菌絲干重即為菌絲生物量。方法同1.2.2-（1）。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用SPSS26軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[13-15]。

2結(jié)果與分析

2.1生物學(xué)特性分析

2.1.1碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響由圖1可知，PG46和PG79在5種供試碳源上均可生長(zhǎng)。以麥芽糖為碳源時(shí)，2株菌的菌落形態(tài)規(guī)則，菌絲較濃密且生長(zhǎng)速度最大，分別為0.41、0.38cm/d；以可溶性淀粉為碳源時(shí)，2株菌的菌絲生長(zhǎng)速度較快，但菌落形態(tài)不規(guī)則；以果糖和葡萄糖為碳源時(shí)，PG46菌絲生長(zhǎng)速度較快且菌落規(guī)則，但PG79菌絲的生長(zhǎng)速度較慢且菌落不規(guī)則。綜上，2株巨大側(cè)耳的最適碳源均為麥芽糖，但以單糖為碳源時(shí)，2株菌的利用效果存在差異。

2.1.2氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響由圖2可知，PG46和PG79在5種供試氮源上均可生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)存在顯著差異。以酵母浸粉和蛋白胨為氮源時(shí)，菌落形態(tài)規(guī)則，菌絲濃密且生長(zhǎng)速度最快，分別為0.39cm/d和0.37cm/d（PG46）、0.41cm/d和0.42cm/d（PG79）；以硫酸銨、氯化銨和尿素為氮源時(shí)，菌落形態(tài)均不規(guī)則且長(zhǎng)勢(shì)較差；不添加氮源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度雖較快，但均為氣生菌絲且接近透明，不適宜菌絲生長(zhǎng)。綜上，2株巨大側(cè)耳的最適氮源相同，均為酵母浸粉和蛋白胨。

2.1.3溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響前期研究結(jié)果顯示，PG46和PG79菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度范圍均為20～30℃，在該范圍內(nèi)進(jìn)一步篩選各菌株的最適生長(zhǎng)溫度。結(jié)果顯示（圖3），隨著溫度的升高，2株菌的生長(zhǎng)速度均呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中，PG46在25℃和28℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度快且濃密，分別為0.50cm/d和0.53cm/d；PG79在28℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最快且濃密，為0.56cm/d；當(dāng)溫度高于28℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度均開(kāi)始下降，并且中溫菌株P(guān)G79的生長(zhǎng)速度下降較明顯且菌絲形態(tài)發(fā)生改變，菌落形態(tài)變得不規(guī)則（圖4）。綜上，2株巨大側(cè)耳菌株的菌絲最適生長(zhǎng)溫度大致相同，均為25～28℃，但菌絲體耐受溫度范圍不同，30℃時(shí)中溫菌株P(guān)G79開(kāi)始遭受高溫脅迫。

2.1.4pH對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響由圖5可知，PG46和PG79在pH為5～9范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速度變化不大。當(dāng)培養(yǎng)基偏酸性時(shí)，菌絲潔白濃密且形態(tài)規(guī)則，但生長(zhǎng)速度較慢。隨著pH升高，菌絲生長(zhǎng)速度加快，在pH為7時(shí)生長(zhǎng)速度最快，分別為0.55cm/d和0.54cm/d。當(dāng)培養(yǎng)基偏堿性時(shí)，隨著pH的升高，菌絲變稀疏且呈明顯放射狀，但整體生長(zhǎng)速度較快。綜上，2株巨大側(cè)耳的菌絲均適宜偏中性（pH7）環(huán)境生長(zhǎng)，但適應(yīng)的酸堿度范圍較廣。

2.1.5正交試驗(yàn)由于單因素試驗(yàn)不能檢測(cè)各因素的交互影響，因此，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，開(kāi)展正交試驗(yàn)（表1），以進(jìn)一步探究2株菌的最適生長(zhǎng)條件。由表2和表3可知，PG46和PG79在9種組合下均可生長(zhǎng)，且與單因素試驗(yàn)結(jié)果大致相同，即以麥芽糖為碳源、酵母浸粉為氮源、培養(yǎng)溫度為28℃、培養(yǎng)基pH為7（組合1）時(shí)，為最適生長(zhǎng)條件。但也存在一定差異，除組合1外，PG46在組合7（可溶性淀粉為碳源、酵母浸粉為氮源、培養(yǎng)溫度為25℃、培養(yǎng)基pH為8）中，菌絲生長(zhǎng)也可達(dá)到最佳狀態(tài)；PG79在組合4（蔗糖為碳源、酵母浸粉為氮源、培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)基pH為6）和組合7中，均可達(dá)到最佳生長(zhǎng)狀態(tài)。以上結(jié)果說(shuō)明，各因素間的交互作用對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響較大，在統(tǒng)計(jì)分析中不可忽略。另外，方差分析結(jié)果（表4，表5）還顯示，4個(gè)因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響程度依次為：氮源＞pH＞溫度＞碳源。

2.2液體發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1裝液量對(duì)液體發(fā)酵的影響在液體發(fā)酵過(guò)程中，250mL三角瓶中裝液量直接影響菌絲體的供氧情況。由圖6可知，在一定范圍內(nèi)，隨著裝液量的增加，PG46和PG79的菌絲體生物量均呈先上升后下降的趨勢(shì)。在裝液量為120mL時(shí)，菌絲生物量均達(dá)到最大，分別為5.58g/L和6.83g/L，且與100mL裝液量無(wú)顯著性差異，但菌絲球大小更均勻。綜上，2株巨大側(cè)耳液體發(fā)酵的最適裝液量均為120mL。

2.2.2轉(zhuǎn)速對(duì)液體發(fā)酵的影響由圖7可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，PG46和PG79的菌絲體生物量呈先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)轉(zhuǎn)速為150r/min時(shí)，PG46和PG79的菌絲生物量達(dá)最高，分別為0.62g和0.82g；轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大，菌絲體生物量無(wú)顯著變化，但菌絲球大小均一度和生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)量有所下降。因此，綜合菌絲生物量和菌絲球均一度指標(biāo)，確定150r/min為2株巨大側(cè)耳液體發(fā)酵的最適搖床轉(zhuǎn)速。

2.2.3接種量對(duì)液體發(fā)酵的影響由圖8可知，PG46和PG79的菌絲體生物量隨著接種量的增加而增大。當(dāng)接種量為12%時(shí)，菌絲生物量達(dá)到最大，分別為0.79g和0.93g；其中，PG79接種量為10%、12%、15%的菌絲體生物量無(wú)顯著差異，但接種量為12%的菌絲球大小更均勻；PG46接種量為12%、15%的菌絲體生物量無(wú)顯著差異。因此，最終確定2株巨大側(cè)耳菌株的最適接種量為12%。

2.2.4菌絲生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化由圖9可知，PG46和PG79的菌絲體生長(zhǎng)均呈“對(duì)數(shù)增長(zhǎng)”模式，且PG79的菌絲生物量始終高于PG46，與平板上的生長(zhǎng)速度差異相符（PG79>PG46）。PG46在發(fā)酵3～9d時(shí)生長(zhǎng)速度最快，第9天后生長(zhǎng)變緩，第15天菌絲生物量最高（0.95g），之后趨于穩(wěn)定；PG79在發(fā)酵3～7天時(shí)生長(zhǎng)速度最快，第7天后生長(zhǎng)變緩，第13天菌絲生物量最高（1.09g），之后趨于平穩(wěn)。

3討論

由于巨大側(cè)耳的研究起步較晚，現(xiàn)有研究主要集中在分類地位、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、活性成分、生物學(xué)特性、栽培技術(shù)等方面[3，8]，但涉及的研究報(bào)道較少并且不夠深入。其中，生物學(xué)特性研究大多只針對(duì)1株菌株開(kāi)展，由于菌株間的遺傳多樣性，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的通用性較差[16-17]。本研究以2株具有代表性的不同溫型巨大側(cè)耳菌株為材料，采用單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，從碳源、氮源、溫度和pH4個(gè)方面開(kāi)展生物學(xué)特性研究，并對(duì)液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，分析菌絲生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化。

在生物學(xué)特性試驗(yàn)中，PG46和PG79的最適碳源均為麥芽糖，麥芽糖為二糖，與多數(shù)食用菌優(yōu)先利用單糖或雙糖的結(jié)果一致[18]。以酵母浸粉和蛋白胨為氮源時(shí)，2株菌株菌絲濃密且長(zhǎng)速較快，但以硫酸銨和氯化銨為氮源時(shí)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較差且菌落形態(tài)不規(guī)則，說(shuō)明有機(jī)氮比無(wú)機(jī)氮更適宜巨大側(cè)耳菌絲生長(zhǎng)，可能與有機(jī)氮中提供的維生素、微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)[13，19]。PG46和PG79菌絲的最適生長(zhǎng)溫度均為25～28℃，但菌絲體耐受溫度范圍不同，30℃時(shí)PG46菌絲可正常生長(zhǎng)，但PG79菌落形態(tài)變得不規(guī)則，這一現(xiàn)象與出菇溫型相符。2株菌株均適宜偏中性（pH7）環(huán)境生長(zhǎng)，與孟靈思等[20]的研究結(jié)果一致。在試驗(yàn)范圍內(nèi)（pH為5～9），菌絲均長(zhǎng)勢(shì)較好，說(shuō)明巨大側(cè)耳適應(yīng)的酸堿度范圍較廣，適合進(jìn)行規(guī)?；茝V。正交試驗(yàn)論證了單因素試驗(yàn)結(jié)果，但也存在部分差異，進(jìn)一步說(shuō)明在多因素試驗(yàn)中正交試驗(yàn)的必要性[21]。

液體發(fā)酵具有周期短、成本低、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，是目前食用菌進(jìn)行規(guī)模化栽培的主要發(fā)酵方式，同時(shí)也是生理活性物質(zhì)提取的重要工藝[22-23]。三角瓶中的裝液量直接影響菌絲體的供氧情況。隨著裝液量的增加，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量增加但氧氣含量不斷降低[24]。本研究中，當(dāng)裝液量達(dá)到120mL時(shí)，菌絲生物量最大且菌絲球大小更均勻，說(shuō)明此時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量和供氧水平達(dá)到平衡，過(guò)高或過(guò)低均不利于菌絲生長(zhǎng)。同樣，搖床轉(zhuǎn)速也直接影響到發(fā)酵液中的溶氧水平[25]。搖床轉(zhuǎn)速過(guò)低時(shí)菌球過(guò)大，當(dāng)轉(zhuǎn)速為150r/min時(shí)，菌絲生物量最高，且菌絲球大小均勻，但轉(zhuǎn)速過(guò)高形成的菌球過(guò)小甚至無(wú)法形成完整菌球，影響下一步研究。在工業(yè)化生產(chǎn)中，接種量高低直接影響生產(chǎn)成本。當(dāng)接種量為12%時(shí)，菌絲生物量最高，但與15%接種量無(wú)顯著差異，考慮成本，最終確定12%為最適接種量。在液體發(fā)酵中，發(fā)酵終點(diǎn)也是必須考慮的重要環(huán)節(jié)。由于培養(yǎng)過(guò)程中，菌球處于封閉狀態(tài)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗、氧氣的耗損、菌球生長(zhǎng)過(guò)程中生存空間的縮小及其所產(chǎn)生的次級(jí)產(chǎn)物，均會(huì)影響菌球的生長(zhǎng)[26]。本研究中，2株菌株的菌絲體生長(zhǎng)呈“對(duì)數(shù)增長(zhǎng)”模式。在發(fā)酵前7d（PG79）或前9d（PG46）時(shí)，菌絲處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌絲活力旺盛，長(zhǎng)速最快，可用于酶活性測(cè)定、原生質(zhì)體制備等菌絲活力相關(guān)的研究[27-28]；在發(fā)酵至15d或13d時(shí)，菌絲生物量最高，可用于生理活性成分提取和菌袋接種等菌絲生物量相關(guān)研究[22-23]；繼續(xù)發(fā)酵，菌絲生物量降低，不利于巨大側(cè)耳的菌絲體生長(zhǎng)。

綜上，PG46和PG79菌絲體的生物學(xué)特性基本一致，最適碳源為麥芽糖，最適氮源為酵母浸粉和蛋白胨，最適pH為7，最適溫度為25～28℃。在生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)上，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，裝液量為120mL，接種量為12%時(shí)，更適宜巨大側(cè)耳菌絲體的液體發(fā)酵，且PG46和PG79的菌絲體生物量均呈“對(duì)數(shù)增長(zhǎng)”的模式。研究結(jié)果可為不同溫型巨大側(cè)耳的規(guī)?；耘嗟於ɑA(chǔ)，以進(jìn)一步推動(dòng)熱區(qū)食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。