多功能解磷真菌的篩選與解磷活性評價

楊臘英 郭立佳 周游 汪軍 梁昌聰 徐云龍 黃俊生

關鍵詞：解磷真菌；產紫籃狀菌；磷酸三鈣；植酸鈣；拮抗作用

磷是作物生長發(fā)育所必需的三大營養(yǎng)元素之一，在植物的細胞分裂、能量轉移、信號傳導、核酸合成以及光合作用等過程中發(fā)揮著重要作用，也是農業(yè)生產中最重要的養(yǎng)分限制因子。磷以磷肥的形式添加到土壤中，據統(tǒng)計，在我國，磷肥在土壤中的當季利用率一般只有10%～25%[1]，植物未利用的部分均轉化成不溶的固定形式。在酸性土壤中，土壤中難溶性無機磷多被固定為磷酸鐵、磷酸鋁類化合物，在中性及石灰性土壤中則多被固定為磷酸三鈣類化合物。因此，如何開發(fā)和利用被土壤固定的磷素，提高土壤中磷的有效利用率，減少化學磷肥的施用是我國可持續(xù)農業(yè)中必需解決的問題之一。調節(jié)土壤酸堿度、施用有機肥、土壤淹水處理、合理施用磷肥和利用解磷微生物活化土壤難溶性磷均為提高土壤磷素有效性的途徑[2]，其中，利用解磷微生物來提高土壤磷素有效性不僅符合當下“化肥使用量零增長”的需求，而且可以減少因磷肥的過量施用所造成的農業(yè)環(huán)境污染。

微生物對磷礦粉等難溶性磷肥的增溶作用及其在農業(yè)中的應用正成為國內外研究人員廣泛關注的研究熱點。很多土壤微生物包括細菌、真菌和放線菌均可參與土壤難溶性磷的溶解、轉化和遷移過程，通過酸化、螯合和交換反應，將土壤中被固定的不溶性磷酸鹽變成可溶形式[3-5]，以利于植物的吸收，進而增加作物產量[6-7]。目前對解磷細菌的溶磷特性和機制已開展了大量研究，但解磷真菌的相關研究仍然較少，已報道的主要為曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）[6-18]、木霉屬（Trichoderma）[19-20]、籃狀菌屬（Talaromyces）[19，21]、枝孢屬（Cladosporium）[22]、擬青霉屬（Paecilomyces）[23-24]等，其他類群較少報道。解磷真菌與細菌相比，其產生有機酸的能力更強，部分種屬的溶磷效率明顯高于細菌[8]，且在傳代培養(yǎng)過程中溶磷活性的穩(wěn)定性也顯著優(yōu)于細菌[10]。因此，尋找更多有溶磷功能的真菌類群，可為增強土壤或肥料中磷的可利用性提供更多的菌種資源。

筆者團隊通過近10a的研究，已研發(fā)出一系列用于防控香蕉枯萎病、根結線蟲等土傳病害的生物菌肥產品，為擴寬生物菌肥菌株的功效，將拮抗生防菌與提高肥效利用率的菌株相結合研發(fā)不同系列的微生物菌肥，既可提高作物抵御病蟲害入侵的能力，又能提高磷的利用率，進而改善農產品品質。本研究采用無機磷篩選培養(yǎng)基，從農田黑土中篩選出高效解磷菌株，定性分析該菌株的解磷能力與芽孢桿菌的相互作用，為后續(xù)利用該菌株進行新菌肥的研發(fā)與田間應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試土壤土壤樣品采自西藏藏族自治區(qū)墨脫縣背崩鄉(xiāng)（29°1436N，95°109E），土壤類型為黑土，采樣點為玉米根周土壤。

1.1.2供試菌株解磷對照菌株LGJPJ、拮抗芽孢桿菌菌株X5、香蕉枯萎病病原菌菌株B2均由中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所微生物資源研究與利用研究組分離鑒定并保存。

1.1.3供試培養(yǎng)基

（1）簡化版無機磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g，硫酸銨2.0g，磷酸三鈣5.0g，瓊脂20.0g，水1000mL，pH7.00～7.50。

（2）簡化版蒙金娜固體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g，硫酸銨2.0g，植酸鈣2.0g，瓊脂20.0g，水1000mL，pH7.00～7.50。

（3）簡化版無機磷（有機磷）液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0g，硫酸銨2.0g，磷酸三鈣5.0g（植酸鈣2.0g），胰蛋白胨0.5g，去離子水1000mL，pH7.00～7.50。

（4）保存用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，自然pH。

（5）LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g，酵母提取物5.0g。

所有培養(yǎng)基均在121℃條件下高壓滅菌20min。

1.1.4供試溶液（1）鉬酸鹽溶液：13.00g鉬酸銨[（NH4）6Mo7O24·4H2O]溶于100mL蒸餾水，0.35g酒石酸銻鉀（KSbC4H4O7·H2O）溶于100mL蒸餾水。在不斷攪拌的情況下把鉬酸銨溶液徐徐加入到300mL50%硫酸溶液中，然后加入酒石酸銻鉀溶液混勻，于棕色瓶4℃保存。

（2）10%抗壞血酸溶液：10g抗壞血酸溶于100mL的蒸餾水中，于棕色瓶4℃保存。

（3）150mmol/L對硝基苯磷酸二鈉（pNPP）溶液：稱取2.784gpNPP溶于50mL蒸餾水中。

1.2方法

1.2.1孢子接種液制備挑取菌株的菌絲，放于PDA平板中，28℃恒溫培養(yǎng)至長出孢子，用無菌水沖洗孢子并經無菌3層擦鏡紙過濾后，即制備成真菌的孢子懸液，經鏡檢孢子數約為7×106個/mL。

1.2.2有效磷含量測定吸取各處理的培養(yǎng)液2mL于10000r/min離心10min，參考陳瑋[25]的鉬銻抗比色法，測定上清液中的有效磷含量（使用光程10mm的比色皿，波長采用700nm），以不接菌作為空白對照。以波長700nm處吸光度值（OD700）為縱坐標（y），溶磷量（x）為橫坐標繪制磷標準曲線，得到鉬銻抗磷標準曲線線性回歸方程為：y=0.5031x+0.0112，相關系數R2=0.9976，通過磷標準曲線回歸方程計算溶液中的有效磷含量，以確定菌株的解磷能力。溶磷率計算公式為：溶磷率=（接菌有效磷含量?對照有效磷含量）/加入無機磷源的量×100%。

1.2.3解磷菌的篩選（1）解磷菌的初篩。稱取10g土壤樣品置于90mL無菌水中，28℃搖床震蕩30min制成土壤懸液，土壤懸液梯度稀釋至10–1、10–2后分別用玻璃棒涂布于無機磷固體培養(yǎng)基上，吹干后用封口膜封口并倒置于生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)。通過觀察平板上所長真菌菌落周圍是否產生透明圈來初步篩選解磷菌，挑取具有較明顯透明圈的真菌菌落轉接至PDA平板上進行純化培養(yǎng)，并作為解磷真菌復篩的初篩菌株。

（2）解磷菌的復篩。150mL三角瓶中裝入無機磷液體培養(yǎng)基50mL，接入制備的孢子懸液200μL，于28℃180r/min震蕩培養(yǎng)5d。解磷對照菌株LGJPJ、芽孢桿菌X5從LB平板接種單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，搖培16h后，分別接種200μL菌液至無機磷液體培養(yǎng)基中，于37℃、180r/min搖床上培養(yǎng)5d，吸取各搖培液2mL離心后取上清液，根據有效磷含量測定方法，對比各菌株培養(yǎng)液中有效磷濃度的大小，篩選出高效解磷菌。

（3）解磷菌對有機磷的礦化能力。挑取解磷菌株菌餅置于簡化版蒙金娜固體培養(yǎng)基上，通過觀察平板上所長真菌菌落周圍是否產生透明圈，分別測定解磷菌菌落直徑（d）和溶磷圈直徑（D），計算可溶性指數（D/d），分析菌株對有機磷的礦化能力。同時向培養(yǎng)基平板上滴加2mL150mmol/LpNPP，覆蓋溶磷圈，4h后觀察顯色結果，如有黃色產生則說明解磷菌分泌磷酸酶。

1.2.4解磷菌的鑒定（1）真菌DNA的提取。將經單孢純化菌株在PDA培養(yǎng)基中活化，再按照SDS法[26]提取真菌DNA，于–20℃保存。

（2）ITS基因序列擴增。用真菌通用引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3）、ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）進行PCR擴增。PCR擴增反應體系：模板1μL，10mmol/L引物各1μL，TakaraMix12.5μL，用ddH2O補至25μL。PCR反應條件：94℃預變性2min，然后94℃變性30s、55℃退火50s、72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃再延伸7min。PCR擴增產物置于4℃保存。

（3）β-tubulin基因序列擴增。用真菌通用引物Bt2a（5-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3）、Bt2b（5-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3）進行PCR擴增。PCR擴增反應體系：模板1μL，10mmol/L引物各1μL，TakaraMix12.5μL，用ddH2O補至25μL。PCR反應條件：94℃預變性2min，然后94℃變性30s、58℃退火50s、72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃再延伸7min。PCR擴增產物置于4℃保存。

用1%瓊脂糖凝膠電泳對產物進行檢測，PCR產物經純化后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得的序列經GenBank中的Blast程序與數據庫中的所有序列進行比較分析，利用DNAStar軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5解磷真菌的解磷能力分析（1）解磷菌株對不同濃度磷酸三鈣的解磷能力。50mL不含磷酸三鈣的無機磷液體培養(yǎng)基置于150mL三角瓶中，分別加入0.125、0.250、0.400、0.500、0.600、0.750、1.000g磷酸三鈣，制成終濃度分別為2.5、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0g/L的無機磷液體培養(yǎng)基，分別加入200μL制備的孢子懸液，180r/min、28℃搖床培養(yǎng)11d后，室溫靜置培養(yǎng)，分別在第1、3、5、7、9、11、13、17、25天吸取培養(yǎng)液2mL，測定有效磷含量及培養(yǎng)液pH，每處理3次重復。菌株解磷能力為接菌培養(yǎng)液有效磷濃度減去不接菌培養(yǎng)液有效磷濃度，取3次重復的平均值（mg/L）。

（2）解磷菌株不同孢子濃度懸液的解磷能力。50mL無機磷液體培養(yǎng)基置于150mL三角瓶中，將制備的孢子懸液分別按照0.2、2、20、200μL，2mL接入無機磷液體培養(yǎng)基中，使孢子終濃度分別為28、280、2.8×103、2.8×104、2.8×105個/mL。28℃搖床180r/min培養(yǎng)11d后，室溫靜置培養(yǎng)，分別在第1、3、5、7、9、11、13、17、25天吸取培養(yǎng)液2mL，測定有效磷含量，每處理3次重復。

（3）解磷菌株對不同濃度植酸鈣的礦化能力。在含50mL（植酸鈣終濃度分別為2.0、5.0g/L）的簡化版蒙金娜液體培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，分別加入孢子懸液200μL，孢子終濃度均為2.8×104個/mL，180r/min28℃搖床培養(yǎng)11d后，室溫靜置培養(yǎng)，分別在第1、3、5、7、9、11、13、15、17、25、35天吸取培養(yǎng)液2mL，測定有效磷含量，每處理3次重復。

1.2.6解磷真菌與芽孢桿菌、香蕉枯萎病菌之間的相互拮抗作用采用平板對峙法測定解磷真菌XZY3PSF與芽孢桿菌X5、香蕉枯萎病菌B2之間的相互拮抗作用。香蕉枯萎病菌B2用PDA平板按照孢子懸浮液制備法獲得病原真菌的孢子懸液，參考汪軍等[27]的拮抗活性檢測方法，按照等邊三角形狀分別接種直徑為0.5cm的香蕉枯萎病菌B2、解磷真菌XZY3PSF菌餅及芽孢桿菌X5菌液10μL，28℃培養(yǎng)3～4d，觀察相互之間的拮抗情況。

1.3數據處理

采用Excel2010和SPSS19.0軟件對數據進行分析處理，數值進行對數轉換后采用LSD法進行多重比較，采用Pearsons法進行相關性分析，利用Excel2010軟件制作圖表。

2結果與分析

2.1解磷菌的篩選

在無機磷固體培養(yǎng)基平板上，解磷菌株周圍能形成一圈透明圈（圖1A），根據透明圈直徑大小可以初步判斷解磷菌株解磷能力的強弱。通過對初篩的解磷菌株進行解磷能力測定，結果表明，5d后該菌株的解磷能力達到502.1mg/L，分別高于對照菌株LGJPJ（68.9mg/L）、拮抗芽孢桿菌菌株X5（53.3mg/L）7.3倍、9.4倍。解磷菌株培養(yǎng)第5天在蒙金娜固體培養(yǎng)基平板上的可溶性指數達1.6，滴加pNPP后觀察到有黃色產生（圖1B），說明解磷菌株可分泌磷酸酶。將該菌株命名為XZY3PSF，并進一步對其進行分子鑒定和解磷特性研究。

2.2菌株XZY3PSF的鑒定

菌株XZY3PSF在PDA培養(yǎng)基上的初生菌絲為白色透明，3d后開始產生綠色孢子，聚集在中央，周圍菌絲為白色，平板背面顯示為橘紅色，培養(yǎng)至15d后菌絲幾乎長滿整個平板，孢子灰綠色（圖2A），平板背面深紅色（圖2B）。產孢結構3分支且輪生（圖2C），孢子橢圓形，3.16～3.69μm，孢子呈長鏈狀（圖2D）。

選擇均有ITS與β-tubulin基因序列的同一菌株，并將其序列進行拼接，采用鄰位法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株XZY3PSF的ITS與β-tubulin基因拼接序列與歸屬于T.purpureogenus的CBS184.27等9株菌株在同一分支，且相似度達到99.8%（圖3）。根據形態(tài)觀察和ITS與β-tubulin基因序列對比結果，鑒定XZY3PSF為籃狀菌屬（Talaromyces）產紫籃狀菌（T.purpureogenus）。

2.3菌株XZY3PSF對磷酸三鈣、植酸鈣的解磷能力

2.3.1菌株XZY3PSF對不同濃度磷酸三鈣的解磷能力從圖4可知，隨著磷酸三鈣濃度的升高，培養(yǎng)液中的最高有效磷含量無顯著變化，5g/L磷酸三鈣的培養(yǎng)液中的有效磷含量相對較高，而2.5g/L磷酸三鈣的溶磷率最高，溶磷率隨磷酸三鈣濃度的增加而降低。隨著培養(yǎng)時間的延長，從第9天開始，有效磷含量開始下降，在第13天后有效磷含量隨磷酸三鈣濃度的增大而增大，且在第25天時，濃度為15、20g/L磷酸三鈣的有效磷含量極顯著高于其他濃度（表1）。

2.3.2菌株XZY3PSF不同孢子濃度對磷酸三鈣的解磷能力從圖5可知，隨著解磷菌株孢子濃度的增加，有效磷含量最高值出現(xiàn)的時間逐漸縮短，分別出現(xiàn)在第11、9、9、7、7天；隨著培養(yǎng)時間的延長，孢子濃度為28個/mL的有效磷含量下降趨勢較緩，而其余濃度在第25天與最高峰值呈極顯著差異，尤以濃度為2.8×104個/mL的有效磷含量下降趨勢最為陡峭，在第17天有效磷含量僅為93.9mg/L，在第25天有效磷含量僅為10.3mg/L，與第7天分別相差5.6倍、50.8倍。

2.3.3菌株XZY3PSF對不同濃度植酸鈣的解磷能力從圖6可知，在測試時間段內，2種植酸鈣濃度的有效磷含量均隨培養(yǎng)時間的延長而增加，其中濃度為5.0g/L的有效磷含量在第25天達到最高峰；同時隨著植酸鈣濃度的升高，有效磷含量亦增加，在不同時間均呈極顯著差異。

2.4菌株XZY3PSF與芽孢桿菌X5、香蕉枯萎病菌B2之間的相互作用

采用對峙培養(yǎng)法綜合評價解磷菌株XZY3PSF與已用于研發(fā)生物菌肥產品的芽孢桿菌X5對香蕉枯萎病菌B2的生長抑制情況，及解磷菌株XZY3PSF與芽孢桿菌X5之間的相互作用，研究發(fā)現(xiàn)解磷菌XZY3PSF可抑制香蕉枯萎病菌B2的生長，同時與芽孢桿菌X5之間存在一定的相互拮抗作用（圖7）。

3討論

本研究中篩選的解磷菌株XZY3PSF與對照菌株LGJPJ、芽孢桿菌X5相比，其溶磷效率在7倍以上，這與WHITELAW等[8]的研究結果相似，且解磷菌株XZY3PSF經傳10代后，其仍具有較好的溶磷活性。經鑒定，菌株XZY3PSF鑒定為產紫籃狀菌（T.purpureogenus），籃狀菌屬（Talaromyces）是一種正被開發(fā)利用的生防菌類群，已報道從開裂的人參種皮中分離得到黃色籃狀菌（T.flavus），該菌能產生幾丁質酶，從而抑制核盤菌、黃萎病菌、立枯病菌的細胞壁形成，還能抑制稻瘟病菌、鏈格孢菌、尖鐮孢菌的孢子萌發(fā)和菌絲伸長[28]。田葉韓等[29]發(fā)現(xiàn)產紫籃狀菌Q2菌株對多種土傳病害有明顯的防治作用，趙洋等[30]發(fā)現(xiàn)Q2菌株可通過產生細胞壁降解酶破壞尖鐮孢菌菌絲形態(tài)，起到抑制病原菌生長的作用。據筆者所查文獻，目前尚無產紫籃狀菌在解磷方面的研究報道。通過“三三”拮抗實驗發(fā)現(xiàn)菌株XZY3PSF亦對香蕉枯萎病菌具有較好的抑菌作用，該菌株既有高效解磷效果又具較好拮抗作用，為后續(xù)生物菌肥的研發(fā)提供優(yōu)良微生物菌種。

通過研究0～25d解磷菌株XZY3PSF對磷酸三鈣的解磷情況，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的延長，不同孢子濃度或同一孢子濃度不同磷酸三鈣濃度的有效磷含量均下降，尤其到13d靜置培養(yǎng)后下降速度更快，這可能是由于菌株生長消耗所致。NARSIAN等[9]研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的磷對溶磷活性無影響，但是由于菌株的持續(xù)生長，使菌株生長過程中會以利用培養(yǎng)基中有效磷的形式導致有效磷濃度下降。李豆豆等[18]等發(fā)現(xiàn)草酸青霉菌PSF1在1～6d對磷酸三鈣的解磷量呈上升趨勢，在第6天解磷量達到最高后略有下降，可能是由于此時培養(yǎng)液中菌體較多對磷的消耗較大導致。這一發(fā)現(xiàn)與NARSIAN等[9]、李豆豆等[18]的報道一致，且本研究結果基于更長時限，結論更客觀、可靠。

本研究發(fā)現(xiàn)解磷菌株XZY3PSF對有機磷類的植酸鈣具有持續(xù)的礦化作用，隨著培養(yǎng)時間的延長，0～25d有效磷含量呈逐漸上升趨勢，在第35天時略有下降或趨于平緩，且該菌株對有機磷類磷源的礦化或分解效率強于已報道的巨大芽孢桿菌等細菌。楊曉燕等[31]研究發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌能夠有效降解有機磷和無機磷，對卵磷脂中的磷分解后有效磷含量達到最高值為1.67mg/L，本研究中菌株XZY3PSF對植酸鈣礦化后有效磷含量高達368.6mg/L，對大豆卵磷脂中的磷降解率最高達94.5mg/L（數據另行分析處理）。

利用解磷菌來制備土壤改良劑、生物肥料等，不僅能提高土壤有效磷的利用率、增加農作物的產量，還能有效減少磷素的流失[32]。目前，部分從土壤中分離的解磷菌已投入實際應用，且效果顯著。如洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）作為生物肥料可以顯著提高番茄、馬鈴薯、洋蔥等作物的產量[33]；巴西青霉菌（Penicilliumbilaii）對小麥等谷物類作物的促生作用明顯，能有效減少化學磷肥的施用[7]；以固氮菌株和溶磷真菌產紫籃狀菌混合發(fā)酵所制復合型菌肥對辣椒苗的促生效果最佳[34]。分離的解磷菌株XZY3PSF對有機磷和無機磷的降解具有高活性，且對香蕉枯萎病菌具有較好的拮抗活性，研究結果為研發(fā)具拮抗功能又可提高土壤中磷利用率的復合生物菌肥奠定基礎。