大孔吸附樹(shù)脂分離純化白子菜總黃酮工藝優(yōu)化

于 鳳，許凱歌，許秋雙，李天祥

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

白子菜為菊科菊三七屬植物，2010 年被批準(zhǔn)為新食品原料，全草入藥［1-2］，具有降尿酸［3］、抗痛風(fēng)［4］、治療2 型糖尿?。?-7］、胰島素抵抗［8-9］、治療脂肪肝［10-11］、增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)［12］等功效，并且活性成分豐富，包括黃酮、生物堿、酚酸［13］。課題組前期發(fā)現(xiàn)，白子菜黃酮有著顯著的降低血尿酸作用。

黃酮分離純化方法諸多，以大孔吸附樹(shù)脂為主［14］，它作為一種綠色環(huán)保材料在中藥材、中藥制劑方面應(yīng)用廣泛［15-20］，但目前尚未涉及白子菜總黃酮。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了HPD600、AB-8、ADS-7、D101、DM301 型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)白子菜總黃酮的吸附性能，并優(yōu)化該成分分離純化工藝，以期為其藥理活性研究及相關(guān)制劑開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 HNY-200F 型恒溫培養(yǎng)振蕩器（天津市歐諾儀器儀表有限公司）；UV-6100 PCS 型紫外分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）；DT5-1型低速臺(tái)式離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；R-1001N 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 試劑與藥物 蘆丁對(duì)照品（批號(hào)1009H022，純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）。ZTC1+1Ⅱ型天然澄清劑（A、B 組分，武漢振天成科技有限公司）。HPD600、AB-8、ADS-7、D101、DM301型大孔吸附樹(shù)脂（北京索萊寶科技有限公司）。硫酸、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉為分析純；無(wú)水乙醇為分析純（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.3 藥材 白子菜于2020 年9 月采自天津種質(zhì)資源圃，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為菊科植物白子菜Gynuradivaricate（L.） DC.。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品3.140 2 mg，置于25 mL 棕色量瓶中，60%乙醇溶解，即得（該成分質(zhì)量濃度為0.125 6 mg／mL），精密吸取0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL 量瓶中，60%乙醇定容，制成系列質(zhì)量濃度。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密吸取不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液各0.5 mL，置于10 mL 量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.4 mL，搖勻，靜置5 min，加入10%Al （NO3）3溶液0.4 mL，搖勻，靜置5 min，加入4%NaOH 溶液5 mL，搖勻，靜置5 min，以相應(yīng)試劑為空白，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.012 1X+0.002 6 （r＝0.999 8），在12.56～251.2 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 上樣液制備 稱(chēng)取白子菜粉末300 g，20倍量60%乙醇浸泡30 min，回流提取1 h，共2 次，濾過(guò)，合并濾液，回收溶劑，制備0.2 g／mL 醇提液，置于50 ℃水浴鍋中，緩慢加入4%B 組分（含ZTC1+1 Ⅱ型天然澄清劑） 并不斷攪拌，水浴30 min，加入2%A 組分水浴20 min，每隔5 min 攪拌20 s，室溫靜置2 h，3 000 r／min 離心5 min，取上清液，即得。

2.1.4 測(cè)定方法 精密吸取0.5 mL 上樣液，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法測(cè)定3 次吸光度，取平均值，代入方程，計(jì)算總黃酮含量。

2.2 樹(shù)脂預(yù)處理 取HPD600、AB-8、ADS-7、D101、DM301 型樹(shù)脂適量，裝柱（2 cm×30 cm），8 BV 2%NaOH 溶液以4 BV／h 體積流量沖洗2 h，蒸餾水沖洗至流出液呈中性，60 ℃水浴加熱5 min，95%乙醇浸泡30 min，以3 BV／h 體積流量沖洗4 BV，2%HCl 浸泡30 min，以3 BV／h 體積流量沖洗4 BV，蒸餾水沖洗至流出液呈中性。

2.3 大孔吸附樹(shù)脂篩選

2.3.1 靜態(tài)吸附性能 稱(chēng)取預(yù)處理后抽濾至干的5 種樹(shù)脂各1.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入0.2 g／mL 上樣液20 mL，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱（25 ℃、100 r／min） 中振蕩3 h，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定吸附率，公式為吸附率＝［（C1-C2）／V1］ ×100%，其中C1為吸附前總黃酮質(zhì)量濃度，C2為吸附后總黃酮質(zhì)量濃度，V1為上樣液體積。棄去上清液后，加入55%乙醇20 mL，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩3 h，取上清液，計(jì)算解吸率，公式為解吸率＝｛C3V2／［（C1-C2） ×V1］ ｝ ×100%，其中C3為解吸后總黃酮質(zhì)量濃度，V2為解吸后溶液體積，結(jié)果見(jiàn)表1。由此可知，AB-8 型樹(shù)脂吸附能力最強(qiáng)，HPD600 型樹(shù)脂解吸能力最強(qiáng)。

表1 總黃酮在不同樹(shù)脂上的靜態(tài)吸附能力（±s，n＝3）Tab．1 Static adsorption capacities of total flavonoids on different resins （±s，n＝3）

表1 總黃酮在不同樹(shù)脂上的靜態(tài)吸附能力（±s，n＝3）Tab．1 Static adsorption capacities of total flavonoids on different resins （±s，n＝3）

型號(hào)吸附率／%解吸率／%DM-30182.08±0.2287.11±0.23 D10180.25±0.3687.41±0.29 ADS-780.81±0.1686.14±0.30 AB-884.75±0.2688.30±0.38 HPD60081.06±0.3090.72±0.09

2.3.2 動(dòng)態(tài)吸附性能 稱(chēng)取預(yù)處理后抽濾至干的5 種樹(shù)脂各3.0 g，裝柱（1 cm×50 cm），40 mL 0.2 g／mL 上樣液以3 BV／h 體積流量上樣，收集流出液，4 BV 55% 乙醇洗脫，保持體積流量不變，收集洗脫液，計(jì)算吸附率、解吸率，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，AB-8 型樹(shù)脂吸附能力最強(qiáng)，HPD600型樹(shù)脂解吸能力最強(qiáng)。

表2 總黃酮在不同樹(shù)脂上的動(dòng)態(tài)吸附能力（±s，n＝3）Tab．2 Dynamic adsorption capacities of total flavonoids on different resins （±s，n＝3）

表2 總黃酮在不同樹(shù)脂上的動(dòng)態(tài)吸附能力（±s，n＝3）Tab．2 Dynamic adsorption capacities of total flavonoids on different resins （±s，n＝3）

型號(hào)吸附率／%解吸率／%DM-30172.46±0.6790.27±0.24 D10171.09±0.2187.44±0.48 ADS-772.15±0.2490.47±0.42 AB-878.28±0.4589.12±0.25 HPD60074.20±0.4391.45±0.44

2.3.3 混合樹(shù)脂吸附性能 分別按1 ∶0、2 ∶1、3 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 3、1 ∶ 2、0 ∶ 1 比例稱(chēng)取HPD600、AB-8 型樹(shù)脂共3.0 g，混勻后裝柱，40 mL 0.2 g／mL 上樣液以4 BV／h 體積流量上樣，收集流出液，計(jì)算吸附率，20 mL 55% 乙醇以4 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，計(jì)算解吸率，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，兩者比例為3 ∶2 時(shí)吸附性能最佳。

表3 不同比例混合樹(shù)脂吸附性能（±s，n＝3）Tab．3 Adsorption capacities of mixed resins with different ratios （±s，n＝3）

表3 不同比例混合樹(shù)脂吸附性能（±s，n＝3）Tab．3 Adsorption capacities of mixed resins with different ratios （±s，n＝3）

HPD600、AB-8 型樹(shù)脂比例吸附率／%解吸率／%1 ∶083.14±0.0983.96±0.05 1 ∶185.98±0.0889.10±0.05 2 ∶183.88±0.0587.67±0.06 3 ∶286.71±0.0589.94±0.07 2 ∶385.05±0.0988.43±0.01 1 ∶284.88±0.0285.66±0.02 0 ∶184.16±0.0183.43±0.06

2.4 混合樹(shù)脂吸附研究

2.4.1 生藥量與混合樹(shù)脂干重比例 稱(chēng)取HPD600 型樹(shù)脂1.8 g、AB-8 型樹(shù)脂1.2 g，共5份，混勻后裝柱，設(shè)定生藥量與混合樹(shù)脂干重比例分別為1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1，分別量取0.2 g／mL 上樣液7.5、15、30、45、60 mL，以4 BV／h 體積流量上樣，收集流出液，計(jì)算總黃酮吸附率，結(jié)果見(jiàn)表4。由此可知，兩者比例大于3 ∶1時(shí)吸附率迅速降低，表明吸附已飽和。

表4 生藥量與混合樹(shù)脂干重比例對(duì)總黃酮吸附率的影響（±s，n＝3）Tab．4 Effect of crude drug dosage-mixed resin dry weight ratio on adsorption rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表4 生藥量與混合樹(shù)脂干重比例對(duì)總黃酮吸附率的影響（±s，n＝3）Tab．4 Effect of crude drug dosage-mixed resin dry weight ratio on adsorption rate of total flavonoids （±s，n＝3）

生藥量與混合樹(shù)脂干重比例吸附率／%1 ∶291.78±0.07 1 ∶191.68±0.06 2 ∶191.31±0.08 3 ∶189.92±0.09 4 ∶179.81±0.07

2.4.2 上樣液質(zhì)量濃度 稱(chēng)取HPD600 型樹(shù)脂1.8 g、AB-8 型樹(shù)脂1.2 g，共5 份，混勻后裝柱，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備上樣液，取質(zhì)量濃度為1.2 g／mL 者7.5 mL，蒸餾水依次稀釋至0.075、0.15、0.3、0.6、1.2 g／mL，以4 BV／h 體積流量上樣，收集流出液，計(jì)算總黃酮吸附率，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，上樣液質(zhì)量濃度為0.3 g／mL 時(shí)藥液流動(dòng)性、混合樹(shù)脂吸附性能較好，并且可避免藥液浪費(fèi)。

表5 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)總黃酮吸附率的影響（±s，n＝3）Tab．5 Effect of sample solution concentration on adsorption rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表5 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)總黃酮吸附率的影響（±s，n＝3）Tab．5 Effect of sample solution concentration on adsorption rate of total flavonoids （±s，n＝3）

上樣液質(zhì)量濃度／（g·mL-1）吸附率／%0.07576.24±0.09 0.1581.64±0.04 0.385.82±0.04 0.687.02±0.07 1.287.97±0.04

2.4.3 上樣體積流量 按“2.4.2” 項(xiàng)下方法裝柱，取0.3 g／mL 上樣液30 mL，分別以1、2、3、4、5 BV／h 體積流量上樣，收集流出液，計(jì)算總黃酮吸附率，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，體積流量為1、2 BV／h 時(shí)該成分吸附率較大，為了節(jié)省時(shí)間，最終確定為2 BV／h。

圖1 上樣體積流量對(duì)總黃酮吸附率的影響Fig．1 Effect of sample volumetric flow rate on adsorption rate of total flavonoids

2.5 混合樹(shù)脂解吸研究

2.5.1 雜質(zhì)洗脫液體積流量 按“2.4.3” 項(xiàng)下方法裝柱、上樣、收集流出液后，6 BV 蒸餾水分別以3、4、5、6、7、8 BV／h 體積流量除雜，6 BV 55%乙醇以4 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，計(jì)算總黃酮轉(zhuǎn)移率，公式為轉(zhuǎn)移率＝（Z2／Z1） ×100%，其中Z1為上樣液中總黃酮含量，Z2為解吸液中總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表6。由此可知，隨著洗脫液體積流量增加，流出液顏色逐漸加深渾濁，為了提高解吸后溶液中總黃酮純度并節(jié)約時(shí)間，最終確定為5 BV／h。

表6 雜質(zhì)洗脫液體積流量對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率的影響（±s，n＝3）Tab．6 Effect of impurity eluent volumetric flow rate on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表6 雜質(zhì)洗脫液體積流量對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率的影響（±s，n＝3）Tab．6 Effect of impurity eluent volumetric flow rate on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

雜質(zhì)洗脫液體積流量／（BV·h-1）轉(zhuǎn)移率／%3 87.97±0.08 87.71±0.06 5 87.42±0.06 6 84.27±0.08 7 82.04±0.08 8 81.45±0.09 4

2.5.2 雜質(zhì)洗脫液用量 按“2.5.1” 項(xiàng)下方法裝柱、上樣、收集流出液，分別用2、4、6、8、10、12 BV 蒸餾水以5 BV／h 體積流量除雜，6 BV 55%乙醇以4 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，計(jì)算總黃酮轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表7。由此可知，洗脫液用量為8 BV 時(shí)流出液幾乎無(wú)色澄清，表明樹(shù)脂柱中雜質(zhì)沖洗較完全。

表7 雜質(zhì)洗脫液用量對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率的影響（±s，n＝3）Tab．7 Effect of impurity eluent consumption on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表7 雜質(zhì)洗脫液用量對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率的影響（±s，n＝3）Tab．7 Effect of impurity eluent consumption on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

雜質(zhì)洗脫液用量／BV轉(zhuǎn)移率／%2 85.94±0.07 85.48±0.09 6 84.64±0.07 8 84.53±0.09 1083.86±0.09 1283.72±0.09 4

2.5.3 洗脫劑體積分?jǐn)?shù) 按“2.5.1” 項(xiàng)下方法裝柱、上樣，8 BV 蒸餾水以5 BV／h 體積流量除雜，分別用6 BV 10%、25%、40%、55%、70%、85%乙醇以4 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)轉(zhuǎn)移率顯著升高，并且可節(jié)約試劑。

圖2 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率的影響Fig．2 Effect of eluent concentration on transfer rate of total flavonoids

2.5.4 洗脫劑體積流量 按“2.5.3” 項(xiàng)下方法裝柱、上樣、除雜，6 BV 70% 乙醇分別以1、2、3、4、5、6 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，體積流量為1、2 BV／h 時(shí)轉(zhuǎn)移率較高，為了節(jié)約時(shí)間，最終選擇2 BV／h。

圖3 洗脫劑體積流量對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率的影響Fig．3 Effect of eluent volumetric flow rate on transfer rate of total flavonoids

2.5.5 洗脫劑用量 按“2.5.3” 項(xiàng)下方法裝柱、上樣、除雜，分別用5、6、7、8、9 BV 70%乙醇以2 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見(jiàn)表8。由此可知，用量大于4 BV 時(shí)轉(zhuǎn)移率升高，而且逐漸平穩(wěn)，為了節(jié)約試劑，最終選擇8 BV。

表8 洗脫劑用量對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率的影響（±s，n＝3）Tab．8 Effect of eluent consumption on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

表8 洗脫劑用量對(duì)總黃酮轉(zhuǎn)移率的影響（±s，n＝3）Tab．8 Effect of eluent consumption on transfer rate of total flavonoids （±s，n＝3）

乙醇用量／BV轉(zhuǎn)移率／%4 73.75±0.09 80.81±0.07 6 86.02±0.08 7 88.61±0.09 8 89.73±0.07 9 91.01±0.09 5

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱(chēng)取HPD600 型樹(shù)脂1.8 g、AB-8型樹(shù)脂1.2 g，混勻后裝柱，30 mL 0.3 g／mL 上樣液以2 BV／h 體積流量上樣，8 BV 蒸餾水以5 BV／h體積流量除雜，8 BV 70%乙醇以2 BV／h 體積流量洗脫，收集洗脫液，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率；取3 份純化前后上樣液，每份10 mL，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸至無(wú)液體流動(dòng)，置于105 ℃烘箱中2 h，冷卻干燥，稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算總黃酮純度，公式為純度＝（X／Y） ×100%，其中X為純化前總黃酮含量，Y為樣品液烘干后質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)表9。由此可知，純化后總黃酮純度顯著升高，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab．9 Results of verification tests （n＝3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)95%乙醇浸泡并以1 BV／h 體積流量洗脫后，大孔吸附樹(shù)脂再生處理效果較好；提取物大多殘留在柱尾，并且較難洗脫，故可考慮逆向洗脫以再生樹(shù)脂。

在考察檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，蘆丁對(duì)照品溶液、白子菜醇提液分別在510、507 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，可能是由于后者所含成分復(fù)雜，造成波長(zhǎng)略微藍(lán)移，故選擇510 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在考察樹(shù)脂吸附效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)態(tài)、靜態(tài)解吸結(jié)果有所差異，可能是由于樹(shù)脂球徑不同而導(dǎo)致樹(shù)脂和藥液中物質(zhì)接觸面積、藥液流動(dòng)速度不一。在考察吸附條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，藥液酸性增加時(shí)變渾濁，有沉淀生成，并且析出的灰黑色物質(zhì)中可能含有較多黃酮，故本實(shí)驗(yàn)不對(duì)上樣液pH 進(jìn)行調(diào)節(jié)。

驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白子菜總黃酮轉(zhuǎn)移率達(dá)89.67%，純度由上樣前的12.67%增加至70.63%，RSD 均小于5%，表明成本低廉、綠色環(huán)保的HPD600、AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂適用于該成分分離純化，可為其開(kāi)發(fā)利用提供有力支持。