葛根及其復(fù)方配伍對(duì)自身免疫性重癥肌無力大鼠骨骼肌Mitofilin、OPA1 蛋白表達(dá)的影響

陳 茉，文穎娟，楊俊超，彭高強(qiáng)，王河江，仝武寧

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬渭南市中心醫(yī)院，陜西 渭南 714000）

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG） 是一種受自身抗體介導(dǎo)的獲得性神經(jīng)-肌肉接頭免疫性疾?。?］。以眼瞼下垂、骨骼肌無力、易疲勞為主要臨床表現(xiàn)，多采用糖皮質(zhì)激素、膽堿酯酶抑制劑、免疫球蛋白等藥物治療［2］，雖在一定程度上可緩解患者臨床癥狀，但長期用藥易發(fā)生肝腎功能損害、內(nèi)分泌系統(tǒng)失衡等一系列不良反應(yīng)，嚴(yán)重危及患者生命。故選取有效靶點(diǎn)，深層次探析MG 發(fā)病與治療機(jī)制，已迫在眉睫。

經(jīng)研究證實(shí)，線粒體與MG 骨骼肌異常密切相關(guān)［3］。一方面，當(dāng)骨骼肌線粒體發(fā)生異常，機(jī)體自由基產(chǎn)生增加、興奮性氨基酸釋放增多、鈣離子超載等，使得異常線粒體過度堆積于體內(nèi)，出現(xiàn)胞瞼下垂、運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀；另一方面，若肌肉組織中正常線粒體數(shù)目過少，則無法產(chǎn)生足夠的能量以維持肌肉的收縮活動(dòng)，亦會(huì)出現(xiàn)四肢無力等臨床表現(xiàn)［4］。因此，本研究以骨骼肌線粒體為出發(fā)點(diǎn)，研究歸脾胃經(jīng)藥物葛根及其復(fù)方對(duì)骨骼肌線粒體內(nèi)膜蛋白Mitofilin、視神經(jīng)萎縮蛋白（optic atrophy 1，OPA1） 的影響，深入探討自身免疫性重癥肌無力 （experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG） 發(fā)病與治療機(jī)制，以期為從“脾-肌肉-線粒體” 角度治療重癥肌無力提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性大鼠80 只，體質(zhì)量160～180 g，購于四川成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （川） 2020-030］。

1.2 藥物 葛根組由葛根20 g 組成；葛芪組由葛根20 g、黃芪15 g 組成；葛參組由葛根20 g、丹參15 g 組成；葛妙組由葛根20 g、蒼術(shù)15 g、黃柏15 g、牛膝15 g、薏苡仁15 g 組成；葛根復(fù)方組由葛根20 g、黃芪15 g、丹參15 g、蒼術(shù)15 g、牛膝15 g、黃柏15 g、薏苡仁15 g 組成。中藥飲片均購于陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院，按常規(guī)煎法分別濃縮成50 mL 藥液，大鼠用藥量為成人用藥的6.25 倍。強(qiáng)的松組采用強(qiáng)的松混懸液，由0.2%羧甲基纖維素鈉配制。

1.3 試劑 鼠源性R97～R116 肽段、完全弗氏試劑（complete freund’ s adjuvant，CFA）、不完全弗氏試劑（incomplete freund’ s adjuvant，IFA）、PBS 磷酸緩沖液、2.5% 戊二醛 （貨號(hào)C8385FE270-1、F5881、F5506、ZLI-9062、P1126，陜西博達(dá)生物科技有限公司）；ECL 超敏發(fā)光試劑盒、Mitofilin 兔抗大鼠多克隆抗體、OPA1 兔抗大鼠多克隆抗體、乙酰膽堿受體抗體 （acetylcholine receptor antibody，AchR-ab） ELISA 試劑盒、電泳液、轉(zhuǎn)膜液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、封閉液 （貨號(hào)WB0164、BS-1824R、PB0773、ml003131、WB0132、WB0154、WB0158、WB0159、WB0161，西安阿爾寶生物科技有限公司）。

1.4 儀器 超凈工作臺(tái)、165-8001 型垂直電泳槽、170-3930 型Trans-Blot 轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad 公司）；Multiskan FC550 型酶標(biāo)儀 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）；JY88-Ⅱ型超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、SH01D 型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立 將80 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、葛根組、葛芪組、葛參組、葛妙組、葛根復(fù)方組、強(qiáng)的松組，每組10 只，除空白組外，其余7 組均參考文獻(xiàn)［5］ 報(bào)道方法復(fù)制EAMG 模型。將鼠源性R97～R116 肽段、CFA、PBS 按照1 ∶1.5 ∶1.5 比例充分混勻制成免疫乳劑，取乳劑200 μL 于大鼠足墊、腹部、背部多點(diǎn)皮下注射；首次免疫后30、45 d，將三者再次按照1 ∶3 ∶3比例充分混勻制成免疫乳劑后，取乳劑200 μL 強(qiáng)化接種?？瞻捉M則在同一時(shí)間段注射等量PBS。觀察大鼠進(jìn)食量、飲水量、毛色以及體質(zhì)量（每周稱量3 次） 變化。

2.2 分組及給藥 最后1 次造模2 d 后進(jìn)行灌胃給藥，各組給藥劑量分別為葛根組2.08 g／kg、葛芪組3.65 g／kg、葛參組3.65 g／kg、葛妙組8.33 g／kg、葛根復(fù)方組11.46 g／kg，強(qiáng)的松組5.4 mg／kg；空白組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，每天1 次，連續(xù)給藥4 周。

2.3 血清IFN-γ、IL-4 水平檢測 分別于造模后2 周和給藥結(jié)束24 h 后，大鼠體外靜脈取血，檢測血清中干擾素γ（interferon γ，IFN-γ） 和白細(xì)胞介素4 （interleukin 4，IL-4） 水平。

2.4 大鼠腓腸肌肌電平均振幅變化 仰臥位固定大鼠，通過針電極將地線固定于大鼠尾部，沿肌纖維走行于記錄電極旁開3～5 mm 處緩慢插入另一單極針作為參考電極，給予0.5～1 Hz 電流刺激強(qiáng)度，分別于造模后2 周和灌胃給藥結(jié)束24 h 后，采用MPA2000 軟件進(jìn)行肌電振幅變化分析。

2.5 血清AchR-ab 水平檢測 給藥結(jié)束24 h 后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r／min 離心15 min，分離得血清，于-20 ℃保存，嚴(yán)格按照AchR-ab ELISA 試劑盒說明書檢測血清AchR-ab 水平。

2.6 骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 處死大鼠后迅速分離坐骨神經(jīng)，取脛骨前肌分支，利用鋒利刀片修成2 mm×2 mm×2 mm 大小塊，浸泡于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中4 ℃固定2 h，再浸于1%四氧化鋨液中固定1 h，脫水包埋后，切成約50 nm 厚度，以鉛、鈾染色，于透射電鏡下觀察。

2.7 Western blot 法檢測Mitofilin、OPA1 蛋白表達(dá) 處死大鼠后迅速分離大鼠脛骨前肌，剪切成細(xì)小碎片，勻漿、裂解，離心后取上清液，檢測蛋白濃度。經(jīng)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，加入稀釋后的一抗 （1 ∶1 000） 4 ℃孵育過夜，洗滌條帶，加入二抗（1 ∶500） 室溫孵育顯影，采用Image-Pro Plus 軟件分析灰度值，以βactin 條帶灰度值為參照，計(jì)算目的蛋白Mitofilin、OPA1 相對(duì)表達(dá)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 25.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)和方差分析；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)則采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠體質(zhì)量的影響 如表1 所示，首次免疫前各組體質(zhì)量均無顯著差異 （P＞0.05）。免疫后第4 周（給藥前），模型組和各給藥組大鼠體質(zhì)量低于空白組（P＜0.01）；免疫后第6 周（給藥第2周），模型組和各給藥組大鼠體質(zhì)量低于空白組 （P＜0.01），且各給藥組大鼠體質(zhì)量與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）；免疫后第8 周（給藥第4 周），模型組大鼠體質(zhì)量低于空白組（P＜0.01），各給藥組大鼠體質(zhì)量高于模型組（P＜0.01）。

表1 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠體質(zhì)量的影響（g，±s，n＝10）

表1 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠體質(zhì)量的影響（g，±s，n＝10）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別首次免疫前第4 周第6 周第8 周空白組201.9±9.33217.2±10.59234.8±10.08247.8±11.13模型組203.4±10.62192.4±10.25△△185.4±8.54△△177.4±6.31△△強(qiáng)的松組199.0±6.11189.7±7.62△△182.9±5.28△△201.9±8.20**葛根組204.5±12.96192.4±11.87△△186.7±8.96△△197.4±7.57**葛芪組196.7±11.47187.1±10.73△△181.9±7.68△△196.5±6.80**葛參組197.0±6.46185.3±10.64△△180.5±9.90△△195.1±9.94**葛妙組202.5±7.17185.7±9.64△△180.3±9.41△△196.5±10.84**葛根復(fù)方組200.4±7.40189.4±7.75△△181.7±5.03△△204.3±13.14**

3.2 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠血清IFN-γ、IL-4 水平的影響 如表2 所示，給藥前，與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠血清IFN-γ、IL-4 水平均升高（P＜0.01）；給藥后，與模型組比較，各給藥組大鼠血清IFN-γ、IL-4 水平均降低（P＜0.01）。

表2 EAMG 大鼠各組IFN-γ、IL-4 變化測定（pg／mL，±s，n＝10）

表2 EAMG 大鼠各組IFN-γ、IL-4 變化測定（pg／mL，±s，n＝10）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與強(qiáng)的松組比較，●P＜0.05。

組別IL-4給藥前給藥后給藥前給藥后IFN-γ空白組0.136±0.0120.134±0.01512.21±1.4113.42±0.93模型組0.184±0.009△△0.180±0.010△△32.24±2.31△△30.63±1.22△△強(qiáng)的松組0.192±0.013△△0.153±0.017**34.41±2.01△△18.85±2.02**葛根組0.195±0.013△△0.162±0.010**●33.37±1.09△△22.67±3.24**葛芪組0.189±0.013△△0.170±0.010**●34.13±1.09△△24.34±2.52**葛參組0.192±0.013△△0.165±0.010**●33.68±1.09△△22.10±3.09**葛妙組0.191±0.013△△0.166±0.010**●35.45±1.09△△25.26±2.34**葛根復(fù)方組0.194±0.008△△0.144±0.011**35.18±2.09△△15.54±3.12**●

3.3 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠腓腸肌肌電平均振幅的影響 如表3 所示，給藥前，與空白組比較，EAMG 大鼠腓腸肌肌電平均振幅降低（P＜0.01）；給藥4 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠腓腸肌肌電平均振幅升高（P＜0.01），其中以強(qiáng)的松組和葛根復(fù)方組升高最為顯著。

表3 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠腓腸肌肌電平均振幅的影響（μV，±s，n＝10）

表3 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠腓腸肌肌電平均振幅的影響（μV，±s，n＝10）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與強(qiáng)的松組比較，●P＜0.05。

組別給藥前給藥后空白組19.7±1.319.3±1.0模型組6.2±0.9△△6.5±0.4△△強(qiáng)的松組4.7±0.8△△16.9±0.3**葛根組5.4±0.3△△14.1±0.5**葛芪組5.9±0.2△△13.5±0.7**葛參組6.2±0.5△△14.9±0.4**葛妙組6.0±0.3△△13.1±0.6**葛根復(fù)方組5.5±0.5△△17.7±0.7**●

3.4 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠血清AchR-ab 水平的影響 如表4 所示，與空白組比較，模型組大鼠血清AchRab 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清AchR-ab 水平降低（P＜0.01），其中以葛妙組、強(qiáng)的松組、葛根復(fù)方組最為顯著。

表4 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠血清AchR-ab 水平的影響（±s，n＝10）

表4 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠血清AchR-ab 水平的影響（±s，n＝10）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與強(qiáng)的松組比較，●P＜0.05。

組別AchR-ab空白組0.074±0.010模型組0.339±0.019△△強(qiáng)的松組0.218±0.021**葛根組0.245±0.014**●葛芪組0.240±0.023**葛參組0.240±0.014**●葛妙組0.216±0.022**葛根復(fù)方組0.212±0.022**

3.5 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響 如圖1 所示，正常情況下，骨骼肌線粒體呈線狀或桿狀，均勻分布于Z 線兩側(cè)，雙層核膜清晰完整，內(nèi)嵴膜結(jié)構(gòu)清晰，排列規(guī)則，基質(zhì)分布均勻，線粒體無腫脹或空泡變性形態(tài)。與空白組比較，模型組可見線粒體腫脹明顯，甚至出現(xiàn)線粒體空泡變性，內(nèi)嵴排列紊亂、斷裂，部分可見內(nèi)嵴溶解消失；與模型組比較，各給藥組線粒體腫脹程度減弱，線粒體數(shù)目增多，內(nèi)嵴排列較為整齊，未見明顯空泡化。

圖1 各組大鼠線粒體超微結(jié)構(gòu)示意圖（×30 000）

3.6 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠骨骼肌線粒體塑性蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠骨骼肌線粒體Mitofiln、OPA1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠骨骼肌Mitofilin、OPA1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），其中以葛根復(fù)方組和強(qiáng)的松組的變化情況最為顯著，見圖2、表5。

圖2 各組大鼠骨骼肌Mitofilin、OPA1 蛋白電泳圖

表5 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠骨骼肌Mitofilin、OPA1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）

表5 葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠骨骼肌Mitofilin、OPA1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與強(qiáng)的松組比較，●P＜0.05。

組別Mitofilin／β-actinOPA1／β-actin空白組3.26±0.042.66±0.19模型組0.07±0.01△△0.26±0.04△△強(qiáng)的松組1.67±0.17**1.72±0.11**葛根組0.34±0.04**●0.46±0.06**●葛芪組0.34±0.02**●0.80±0.04**●葛參組0.43±0.01**●0.86±0.02**●葛妙組1.56±0.01**1.55±0.03**葛根復(fù)方組2.33±0.19**●1.85±0.06**

4 討論

重癥肌無力屬中醫(yī)“痿證” 范疇。《素問·痿論》言：“脾主肌肉”，《脾胃論》 中亦提到：“脾胃俱旺，則能食而肥；脾胃俱虛，則不能食而瘦……脾虛則肌肉削”。強(qiáng)調(diào)脾胃作為氣血生化之源，滋養(yǎng)全身。全身健壯的體現(xiàn)首先來自氣血充盛，其次來自肌肉強(qiáng)健。肌肉為氣血所養(yǎng)，氣血為脾胃所化，脾胃強(qiáng)盛則肌肉強(qiáng)健。葛根為根，根主上升，甘味入脾，能補(bǔ)脾胃之氣，脾胃氣盛則肌肉力強(qiáng)，辛則散表，升舉陽氣，解其肌腠。國家級(jí)名老中醫(yī)裘昌林［6］、周仲瑛［7］、李聲岳［8］、劉友章［9］等均以葛根配伍治療重癥肌無力，臨床療效確切。前期實(shí)驗(yàn)研究亦證實(shí)，葛根及其復(fù)方配伍通過調(diào)節(jié)氮自由基（RNS） 衰減水平以及ATP 酶活性等恢復(fù)EAMG 大鼠心肌、平滑肌、胸腺組織線粒體正常功能，有效降低AchR-ab 表達(dá)［10-14］。因此，本實(shí)驗(yàn)仍以葛根為主藥，以期能夠明確葛根及其復(fù)方配伍對(duì)EAMG 大鼠骨骼肌線粒體的調(diào)控機(jī)制。

線粒體嵴是保障線粒體正常功能的重要結(jié)構(gòu)之一［15］，嵴連接點(diǎn) （crista junctions，CJs） 可能通過Mitofilin 和OPA1 之間的相互作用［16］參與線粒體氧化磷酸化，完成線粒體塑性，實(shí)現(xiàn)線粒體生物合成［17-18］。研究發(fā)現(xiàn)，重癥肌無力患者體內(nèi)OPA1 蛋白失活，線粒體管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)裂解，出現(xiàn)線粒體過度分裂［19］，而通過上調(diào)神經(jīng)肌肉病變小鼠線粒體內(nèi)Mitofilin 蛋白表達(dá)，能夠有效提升OPA1 蛋白表達(dá)，恢復(fù)線粒體形態(tài)功能［20］。此外，細(xì)胞因子IFN-γ 和IL-4 能夠通過調(diào)節(jié)B 細(xì)胞，干預(yù)AchR-ab 表達(dá)［21］。在EAMG 模型中，若IL-4 過度表達(dá)，將刺激Th1 細(xì)胞大量分泌IFN-γ，導(dǎo)致骨骼肌運(yùn)動(dòng)終板發(fā)生超敏反應(yīng)，誘發(fā)或加重MG 臨床癥狀［22-23］。通過降低IFN-γ 和IL-4 水平，可有效減弱乙酰膽堿受體抗體濃度，起到積極的治療作用［24-25］。

本研究證實(shí)，葛根及其復(fù)方配伍可通過上調(diào)線粒體塑性蛋白Mitofilin、OPA1 表達(dá)，干預(yù)線粒體內(nèi)嵴形態(tài)，有效調(diào)節(jié)AchR-ab、IFN-γ、IL-4 水平，提高腓腸肌肌力水平，一定程度上恢復(fù)EAMG 大鼠骨骼肌線粒體正常功能。而葛根及其復(fù)方配伍能否通過影響線粒體塑性蛋白表達(dá)，調(diào)控EAMG 大鼠線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白表達(dá)，影響線粒體生物合成，仍有待進(jìn)一步證實(shí)。