小麥TaTVP1基因的克隆與表達(dá)分析

馬燕斌,李換麗,文 晉,王 霞,周仙婷,王新勝

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)/山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所,山西運(yùn)城 044000;2.運(yùn)城學(xué)院,山西運(yùn)城 044000)

土壤鹽堿化等非生物脅迫是導(dǎo)致小麥等農(nóng)作物減產(chǎn)的主要因素之一,土壤中過高的鈉離子濃度會破壞胞內(nèi)的離子平衡,造成作物體內(nèi)的代謝途徑紊亂,從而抑制其生長。為降低鹽堿逆境對農(nóng)作物產(chǎn)量的影響,除改良土壤外,培育耐鹽堿農(nóng)作物品種也可有效抵御土壤鹽堿化等不利影響,進(jìn)而在一定程度上穩(wěn)定農(nóng)作物產(chǎn)量。多年來,傳統(tǒng)遺傳育種與分子改良相結(jié)合極大地促進(jìn)了研究人員選育具有耐鹽堿、耐旱等特性種質(zhì)資源的效率[1-2]。

近年來,作物中多種耐旱、耐鹽堿的基因被克隆鑒定并證實有助于改良作物的耐逆特性。H+轉(zhuǎn)運(yùn)無機(jī)焦磷酸酶(H+-PPase,TVP)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的H+轉(zhuǎn)運(yùn)酶,可作為調(diào)解細(xì)胞酸度的質(zhì)子泵,驅(qū)動各種離子在液泡內(nèi)的區(qū)隔化,同時也參與了調(diào)解植物生長素的運(yùn)輸,在植物環(huán)境耐受性、生長發(fā)育過程中都可能起到了作用[3]。有報道稱,大豆GmVP1基因能提高轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根在一定條件下對鹽脅迫的反應(yīng)[4];TPSP融合基因在小麥中的表達(dá)可表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐旱性[5];煙草中敲除NtMYB68轉(zhuǎn)錄因子能改善煙葉中紫黃質(zhì)的堆積,促進(jìn)脫落酸的合成,從而改善煙株的抗旱性[6];擬南芥中過表達(dá)白菜Bp-NFYA5、番茄sly-miR397基因可以提高其干旱耐受性[7-8];外源基因玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的過表達(dá),可使玉米耐旱性增強(qiáng)[9];GhPNP1 可通過cGMP 信號途徑正向調(diào)解棉花對干旱的耐受性[10];大豆中的BADH基因也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性[11];此外,植物耐旱密切相關(guān)的還有DREB類等基因[12-13];細(xì)胞質(zhì)膜蛋白SOS1和液泡膜蛋白NHX協(xié)同作用,使胞質(zhì)內(nèi)維持低濃度鹽離子,從而提高了植物的抗鹽性[14-16]。綜上所述,各類不同基因的研究極大地豐富了耐旱、鹽堿基因研究的理論基礎(chǔ),同時也說明作物耐旱、鹽堿機(jī)理可能具有更復(fù)雜的多途徑調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此,還需對植物的耐鹽、耐旱性進(jìn)一步探索,從更多的抗逆性作物著手,挖掘更多相關(guān)基因,從細(xì)胞、組織和整體水平上闡釋植物耐干旱、鹽脅迫的信號調(diào)控機(jī)制,進(jìn)而為作物的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)有的研究已有很多關(guān)注小麥抗逆材料的創(chuàng)制及其分子機(jī)制的解析,筆者以小麥耐旱品種晉麥47和舜麥1718為材料,對其TVP1基因進(jìn)行克隆鑒定,并利用生物信息學(xué)對該蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和發(fā)育進(jìn)化等方面進(jìn)行分析,旨在為進(jìn)一步研究該基因的功能與機(jī)理打下基礎(chǔ),同時也為利用該類基因進(jìn)行植物耐逆優(yōu)良種質(zhì)選育提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試材料晉麥47(JM47)、舜麥1718(SM1718)均為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所國審品種,種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗田。

1.2 材料處理將晉麥47(JM47)、舜麥1718(SM1718)2種品種小麥籽粒浸泡在經(jīng)過高壓滅菌的蒸餾水中,過夜萌發(fā),次日挑選生長狀態(tài)一致飽滿的種子,播種于土壤條件相同的花盆中,在22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),長日照7 d,取苗樣液氮速凍,于-80 ℃保存,供DNA提取之用。小麥在溫室盆栽中生長至幼穗階段時,取根、莖、葉、穗4個組織樣品于無RNA酶離心管中,液氮速凍以備RNA提取。

1.3 總DNA提取、RNA提取和cDNA制備DNA按照GENEOUTTM Plant DNA Isolation Kit (LABGENE, 上海)試劑盒的說明書進(jìn)行提取,-20 ℃保存。小麥材料及其不同組織樣品在液氮低溫下冷凍磨成樣品,分別稱取約0.1 g樣品粉末,加入Trizol試劑(Invitrogen,USA)進(jìn)行RNA提取,整個試驗過程嚴(yán)格按照操作要求進(jìn)行,避免RNase污染。利用分光光度計測定各樣品RNA濃度、純度后,以RNA為模板,參考RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTM Reverse Transcription Mix, Oligo(dT) (Promega, 上海)說明書,合成cDNA第1鏈,于-20 ℃冰箱保存。

1.4TaTVP1基因的克隆從NCBI數(shù)據(jù)庫下載TaTVP1 (AY296911.1)基因CDS序列,利用Primer Premier 6.0軟件根據(jù)該基因保守序列設(shè)計克隆特異性引物,引物由北京奧科生物科技公司合成,序列分別為TaTVP1-F:5′-CATGGCGATCCTCGGG-3′,TaTVP1-R: 5′-CTAGATGTACTTGAAC-3′。以晉麥47和舜麥1718幼苗的cDNA分別為模板,利用ExTaq酶(Takara,上海)擴(kuò)增TaTVP1基因的全長序列。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性40 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸2 min,終延伸10 min,30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,按照DNA純化回收試劑盒(Omega Bio-Tek,美國)說明書回收片段,進(jìn)行克隆。

1.5 蛋白結(jié)構(gòu)分析利用SOSUI軟件預(yù)測分析TaTVP1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域;利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)對TaTVP1蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測。

1.6 進(jìn)化關(guān)系分析從NCBI網(wǎng)站blastp分析并下載與TaTVP1氨基酸序列同源性較高的其他物種的氨基酸序列,利用Clustal工具進(jìn)行多序列比對,MEGA 5.0軟件分析進(jìn)化關(guān)系,利用Neighbor-Joining算法構(gòu)建進(jìn)化樹,Bootstrap分析1 000次。

1.7TaTVP1基因的組織表達(dá)分析利用Beacon Designer 軟件,參照TaTVP1基因序列,選擇基因保守區(qū)設(shè)計特異性的熒光定量引物,內(nèi)參基因為小麥Actin基因引物(表1)。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅢ (Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa)說明書,采用Applied Biosystems Step OnePlusTM 儀擴(kuò)增,PCR體系25 μL,擴(kuò)增程序為: 95 ℃預(yù)變性4 min,95 ℃變性5 s, 60 ℃退火20 s, 72 ℃延伸10 s,循環(huán)40次。設(shè)置3次重復(fù)。數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量。

表1 定量PCR分析使用引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1TaTVP1基因全長的克隆以晉麥47(JM47)、舜麥1718(SM1718)的cDNA為模板,擴(kuò)增克隆均得到全長2 000余bp的TaTVP1基因片段(圖1),純化回收產(chǎn)物,連接克隆載體pMD19-T轉(zhuǎn)化至Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞,隨機(jī)挑取長勢較好的菌落,經(jīng)菌液PCR檢測,篩選出陽性克隆,送至北京奧科生物科技公司測序。結(jié)果顯示,TaTVP1基因序列全長2 289 bp,推測編碼762個氨基酸。

注:M.5 000 DNA Marker;1.晉麥47材料擴(kuò)增的TaTVP1片段;2.舜麥1718擴(kuò)增的TaTVP1片段。

2.2 小麥TaTVP1的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析通過NCBI網(wǎng)站中blastp在線工具對TaTVP1氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索,選取相似性較高的多個作物TVP1氨基酸序列與TaTVP1進(jìn)行比較分析,利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示(圖2),各作物TVP1蛋白在進(jìn)化中分化成兩大類,一類是大豆、擬南芥、棉花、煙草聚為一簇的雙子葉植物TVP1 Ⅰ類;另一類是小麥、玉米、水稻、青稞、大麥草TVP1聚為一簇的Ⅱ 類,其中小麥TVP1蛋白與水稻、玉米等禾本科單子葉植物TVP1蛋白的遺傳距離最近。這說明TVP1蛋白在單雙子葉植物中的遺傳分化明顯。

2.3 TaTVP1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析利用SOSUI軟件對TaTVP1蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析,表明TaTVP1蛋白的氨基酸序列包含12個疏水跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3)。亞結(jié)構(gòu)域分析顯示,小麥TVP1蛋白分為2個獨(dú)立的結(jié)構(gòu),一個是N端,包含4個疏水的跨膜區(qū)域,另一端是C端,包含8個疏水跨膜區(qū)域,其多肽鏈的N端和C端均在膜外。

圖3 TaTVP1跨膜結(jié)構(gòu)分析

2.4 TaTVP1跨膜氨基酸序列比對分析小麥TVP1編碼762個氨基酸,由該氨基酸序列(圖4)包含的12個跨膜結(jié)構(gòu)域(I-XII)序列的分析和比較可知,小麥TVP1與擬南芥、水稻各跨膜區(qū)中保守氨基酸一致的分別為10、13、15、19、21、20、13、19、21、19、25及17個,各跨膜區(qū)疏水氨基酸的個數(shù)依次為16、15、12、13、11、13、14、15、17、13、11及14個。

注:I～XII為分析跨膜序列結(jié)果所標(biāo)示的氨基酸序列,疏水性氨基酸有A丙氨酸、Y酪氨酸、F苯丙氨酸、W色氨酸、V纈氨酸、I異亮氨酸、L亮氨酸和P脯氨酸。

2.5 TaTVP1蛋白三級結(jié)構(gòu)域預(yù)測根據(jù)前述預(yù)測的不同疏水氨基酸跨膜結(jié)構(gòu),進(jìn)一步預(yù)測TaTVP1蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成的功能結(jié)構(gòu),分別利用不同長度的氨基酸序列進(jìn)行模型匹配比較分析可知,全長TaTVP1氨基酸可折疊形成膜結(jié)構(gòu)孔道蛋白高級結(jié)構(gòu)(圖5A),該孔道具有較清晰的管狀結(jié)構(gòu);其中N段300氨基酸(圖5B)與C端301～762 aa(圖5C)能夠形成獨(dú)立的孔道結(jié)構(gòu)組成模型。

注:A、B、C、D分別表示氨基酸序列為全長、N端1～300 aa、C端301～762 aa及241～762 aa。

2.6TaTVP1在小麥不同組織的表達(dá)分析選用耐旱品種晉麥47和水地品種舜麥1718為材料,分析TaTVP1基因在根、莖、葉、穗4個不同組織的表達(dá)水平,并比較該基因在2個品種中不同組織的表達(dá)水平。定量PCR結(jié)果顯示(圖6),TaTVP1在不同組織中的表達(dá)水平存在明顯差異,在根與莖中的表達(dá)量較高,葉、穗組織中表達(dá)量較低。在2個品種間,晉麥47的莖中表達(dá)量最高,高出根中表達(dá)量的1.63倍,穗中表達(dá)量最低;而舜麥1718莖中TaTVP1表達(dá)量與根中的表達(dá)量差異很小,葉、穗中的表達(dá)量較低。

圖6 TaTVP1在小麥不同組織中的表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

植物對逆境非生物脅迫的響應(yīng)過程十分復(fù)雜,涉及生理、生化特性的多種過程。在植物中,H+轉(zhuǎn)運(yùn)無機(jī)焦磷酸酶與NHX逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以穩(wěn)定胞質(zhì)內(nèi)的酸堿度,使胞質(zhì)內(nèi)的Na+維持在較低濃度,進(jìn)而增強(qiáng)植物的耐鹽、耐旱性[15-16]。該研究中克隆所獲得的小麥TVP1基因的核苷酸序列與參考基因序列存在一些單核苷酸差異,這可能是不同品種小麥之間單核苷酸多態(tài)性造成的。而且,六倍體小麥中含有A、B、D 3個染色體組,TVP1在不同染色體組中還存有同源基因[17]。TaTVP1蛋白中12個跨膜區(qū)域中的疏水氨基酸序列具有較高的一致性,表明該蛋白在進(jìn)化過程中,結(jié)構(gòu)域遺傳保守性較高,也預(yù)示著其在細(xì)胞中的功能不可替代。有研究報道,擬南芥NHX肽鏈C末端的缺失可引起Na+/H+交換活性發(fā)生明顯變化[18],表明C末端與Na+/H+交換活性密切相關(guān),分析顯示TVP1的C末端位于膜外的氨基酸序列較長,且親水氨基酸含量較高,推測該序列可能參與胞質(zhì)內(nèi)的離子交換,影響Na+/H+的交換活性,同時,TVP1蛋白三級結(jié)構(gòu)具有明顯的孔道結(jié)構(gòu),也預(yù)示與其具有的質(zhì)子泵作用密切相關(guān),但具體的行使功能過程需要進(jìn)一步探究。

研究表明,植物耐鹽性與耐旱性具有一定的相關(guān)性,耐旱材料往往也表現(xiàn)出較好的耐鹽性。過表達(dá)液泡H+焦磷酸酶的轉(zhuǎn)基因植物對高濃度NaCl的耐受性更強(qiáng),對干旱的耐受性也更強(qiáng),由此可知該基因有助于提高植株的耐旱和耐鹽性[19-20]。而在各種非生物脅迫下,許多轉(zhuǎn)H+焦磷酸酶基因植物的莖和根生物產(chǎn)量增加[21-24]。該研究組織特異性表達(dá)結(jié)果中,該基因在根、莖中的相對表達(dá)量明顯高于葉、穗中,這可能與TVP1在不同組織中抗逆性的作用特征有關(guān);耐旱品種晉麥47與舜麥1718相比,莖部表達(dá)量又明顯高于根部,這種表達(dá)模式可能與晉麥47表現(xiàn)出優(yōu)良的耐旱性特征相關(guān),后續(xù)可以通過轉(zhuǎn)化該基因等方法對其功能進(jìn)行進(jìn)一步闡釋。該研究獲得并分析了小麥TVP1基因的核苷酸與氨基酸序列,對其表達(dá)模式也進(jìn)行了研究。后期將在小麥中過量表達(dá)TVP1基因,探究其耐旱、耐鹽功能,并進(jìn)一步闡釋其機(jī)制,從而為培育耐逆優(yōu)良種質(zhì)的植物提供理論基礎(chǔ)。