川芎蛋白-葡聚糖共聚物的制備工藝優(yōu)化及其抗氧化性

王海燕，李佳璇，韋利芬，阮婧華，唐東昕，辛加敏，查鑫

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001）

川芎蛋白（Ligusticum chuanxiong protein，LCP）為傘形科植物川芎的干燥根莖的分離蛋白。前期研究表明，LCP 提取率較高，且具有較好的抗氧化能力，但其溶解度較差，限制了其作為天然抗氧化劑在食品行業(yè)的應(yīng)用[1]，所以有必要對(duì)LCP 進(jìn)行有效地改性處理。相比物理法（高壓加工、高壓均質(zhì)化和高強(qiáng)度超聲）和酶法（谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶、氧化酶和酶修飾）的改性方式，糖基化改性被稱為“綠色工藝”，是自發(fā)進(jìn)行的反應(yīng)，無(wú)需添加化學(xué)物質(zhì)，具有綠色、安全的優(yōu)勢(shì)。反應(yīng)實(shí)質(zhì)是蛋白質(zhì)氨基與還原糖羰基的共價(jià)結(jié)合[2]，使得糖基化共聚物同時(shí)具有蛋白質(zhì)的大分子特性和多糖的親水特性，從而改善蛋白質(zhì)溶解度，提高蛋白質(zhì)的抗氧化性。

葡聚糖（dextran，Dex）是一種中性多糖，具有還原性，是糖基化反應(yīng)的必要條件之一，并且中性電荷可抑制蛋白質(zhì)與多糖之間靜電絡(luò)合的形成[3]。其葡萄糖殘基由α-1，6 鍵連接成線性鏈，具有很高的靈活性，可與蛋白質(zhì)緊密纏繞，為糖基化下的分子間聚集提供強(qiáng)大的空間位阻[4]，是制備蛋白質(zhì)-多糖共聚物的理想材料。本研究以接枝度（degree of grafting，DG）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化川芎蛋白-葡聚糖共聚物（glycosylated Ligusticum chuanxiong protein，GLCP）制備條件，并對(duì)在最優(yōu)條件下所得的GLCP 進(jìn)行抗氧化性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川芎：四川千方中藥股份有限公司；葡聚糖、考馬斯亮藍(lán)R250、四硼酸鈉、鄰苯二甲醛、溴酚藍(lán)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉：北京酷來(lái)搏科技有限公司；羥自由基清除能力試劑盒、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]自由基清除能力試劑盒：蘇州格銳思生物科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MINIB-100I 金屬?。汉贾菝讱W儀器有限公司；Mini PROTEAN Tetra Cell 電泳儀：美國(guó)BIO-RAD 公司；UV-6000PC 紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；Quanta 450 FEG 掃描電鏡：美國(guó)FEI 公司；Nicolet Is50 傅里葉變換紅外光譜：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LCP 的提取

采用飽和酚法[5]提取LCP。稱取脫脂后川芎藥材粉末0.5 g，加入預(yù)冷丙酮3 mL，置于-20 ℃冰箱浸提30 min。3 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，分別加入80%丙酮、0.1 mol/L 乙酸銨的80%甲醇液洗滌。沉淀中加入細(xì)胞裂解液2.5 mL 重懸，再加入Tris-飽和酚溶液2.5 mL，充分搖勻，靜置1 h。3 000 r/min 離心5 min，收集上清液，加入3 倍量0.1 mol/L 乙酸銨的80%甲醇液，置于-20 ℃冰箱，放置過(guò)夜。3 000 r/min 離心5 min，收集沉淀，分別用甲醇、80%丙酮洗滌沉淀，-80 ℃冷凍干燥即得LCP。

1.3.2 DG 測(cè)定

采用鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）法[6]，稱取OPA 80 mg 溶解于2 mL 的甲醇中，依次加入20%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液5 mL、0.1 mol/L 硼砂溶液50 mL，β-巰基乙醇200 μL，定容至100 mL。取配制的OPA 試劑4 mL 加入GLCP 溶液200 μL，混勻，于35 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 min，340 nm 測(cè)其吸光值A(chǔ)1，相同條件下加入200 μL LCP 溶液為空白，測(cè)定吸光值A(chǔ)0，二者之差為自由氨基的凈吸光值，通過(guò)以下公式計(jì)算接枝度（D，%）。

1.3.3 GLCP 的單因素考察

采用濕熱法[7]，將提取的LCP 與Dex 配制成一定比例的溶液，磁力攪拌1 h，調(diào)pH 值，置于水浴中反應(yīng)，反應(yīng)后迅速冷卻，得到GLCP。

1.3.3.1 不同底物質(zhì)量比對(duì)DG 的影響

按照3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 的底物質(zhì)量比準(zhǔn)確稱取Dex 與LCP，加入去離子水4 mL 溶解，磁力攪拌1 h，用0.1 mol/L 的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH 值至9.0。將調(diào)好pH 值的溶液放入水浴加熱反應(yīng)，設(shè)定反應(yīng)溫度為70 ℃、反應(yīng)時(shí)間為150 min，反應(yīng)結(jié)束后立即用冷水停止其反應(yīng)，得糖基化產(chǎn)物，對(duì)其接枝度進(jìn)行測(cè)定。單因素試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.3.2 不同pH 值對(duì)DG 的影響

參照1.3.3.1 方法，分別選取反應(yīng)pH 值為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，其他條件固定為底物質(zhì)量比2∶1，反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時(shí)間150 min。

1.3.3.3 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)DG 的影響

參照1.3.3.1 方法，分別選取反應(yīng)時(shí)間為90、120、150、180、210 min，其他條件固定為底物質(zhì)量比2∶1、pH9.0、反應(yīng)溫度70 ℃。

1.3.3.4 不同反應(yīng)溫度對(duì)DG 的影響

參照1.3.3.1 方法，分別選取反應(yīng)溫度為30、50、70、90、110 ℃，其他條件固定為底物質(zhì)量比2∶1、pH9.0、反應(yīng)時(shí)間150 min。

1.3.4 糖基化川芎蛋白響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)建立

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，以A 底物質(zhì)量比、B pH 值、C 反應(yīng)時(shí)間、D 反應(yīng)溫度為自變量，DG 為響應(yīng)值，采用Design Export 8.0.6 軟件分析，通過(guò)四因素三水平優(yōu)化制備過(guò)程。每組平行試驗(yàn)3 次，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface optimization

1.3.5 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSpolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的測(cè)定

配制12%分離膠，5%濃縮膠，進(jìn)行垂直電泳。樣品和3 倍量溴酚藍(lán)緩沖液渦旋混合，置于100 ℃金屬浴加熱反應(yīng)10 min，待冷卻后，取樣品10 μL，標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Maker）5 μL 上樣。初始電壓為80 V，待指示劑進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)為120 V，距離電泳板底部0.5 cm 時(shí)，停止電泳。電泳完畢，取出膠片，置于考馬斯亮藍(lán)R-250中染色，凝膠背景透明為止，于脫色液（冰醋酸∶甲醇∶水=1∶4∶10，體積比）中進(jìn)行脫色處理，直至條帶清晰，觀察分子量。

1.3.6 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察

取少量LCP 和GLCP 樣品固定于雙面導(dǎo)電膠上，進(jìn)行噴金處理，厚度約為10 nm 的電鍍層，在20 kV 電壓下進(jìn)行電子掃描，拍攝具有代表性樣品圖。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）的測(cè)定

分別取適量LCP、GLCP 干燥凍干粉末，按照1∶100（質(zhì)量比）加入溴化鉀進(jìn)行壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀做全波段掃描（4 000～400 cm-1），掃描次數(shù)32 次。

1.3.8 抗氧化性的測(cè)定

1.3.8.1 羥自由基清除能力的測(cè)定

取濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的樣品溶液各125 μL，分別加入試劑盒中試劑一、試劑二、試劑三各125 μL 和蒸餾水500 μL 作為測(cè)定組。樣品溶液125 μL，試劑一、試劑二各125 μL 和蒸餾水625 μL 作為對(duì)照組。試劑一、試劑二、試劑三各125 μL 和蒸餾水625 μL 作為空白組。以VC為陽(yáng)性對(duì)照?；靹蚝?，37 ℃水浴反應(yīng)20 min，510 nm 下測(cè)吸光值。

式中：X 為羥自由基清除率，%；A0為空白組吸光值；A1為測(cè)定組吸光值；A2為對(duì)照組吸光值。

1.3.8.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

取濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的樣品溶液各50 μL，加入試劑盒中工作液950 μL 作為測(cè)定組。樣品溶液50 μL，無(wú)水乙醇950 μL 作為對(duì)照組。無(wú)水乙醇50 μL 和工作液950 μL 作為空白組。以VC為陽(yáng)性對(duì)照?；靹蚝?，25 ℃避光反應(yīng)6 min，734 nm 下測(cè)吸光值。

式中：Y 為ABTS+自由基清除率，%；A0為空白組吸光值；A1為測(cè)定組吸光值；A2為對(duì)照組吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Excel 2019 進(jìn)行處理；Design Expert 8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化；Origin 2018 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

糖基化反應(yīng)是蛋白質(zhì)游離氨基和還原糖羰基之間的共價(jià)結(jié)合，接枝度表示反應(yīng)前后的游離氨基酸含量的變化，以此判斷糖基化反應(yīng)程度，接枝度越大，說(shuō)明反應(yīng)越完全[8]。單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各單因素對(duì)接枝度的影響Fig.1 Effects of single factors on the degree of grafting

由圖1A 可知，隨LCP 添加量的增大，接枝度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在底物質(zhì)量比為2∶1 時(shí)，接枝度達(dá)到最大值為（35.40±0.56）%?？赡苁求w系中糖比例較高時(shí)，活性位點(diǎn)接觸機(jī)率較大，有利于糖基化進(jìn)程。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)比例較大時(shí)，由于蛋白質(zhì)的空間位阻影響，活性位點(diǎn)接觸機(jī)率降低，糖基化反應(yīng)受到影響，從而接枝度降低[9]。綜合考慮選擇底物質(zhì)量比為3∶1、2∶1、1∶1進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖1B 可知，隨著pH 值的增大，接枝度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH 值為9.0 時(shí)，接枝度達(dá)到最大值（34.94±0.32）%?？赡苁请S著pH 值的增大，偏離等電點(diǎn)，溶解度增大，從而使游離氨基增加，羰氨結(jié)合，利于糖基化反應(yīng)。但強(qiáng)堿條件下，LCP 易發(fā)生變性，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露于分子表面[10]，而親水基團(tuán)相對(duì)較少，不與水相相溶，集聚成團(tuán)，溶解度降低[11]，從而接枝度下降。綜合考慮選擇pH 值為8.0、9.0、10.0進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖1C 可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)，接枝度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在反應(yīng)時(shí)間為150 min 時(shí)，接枝度達(dá)到最大值（34.78±0.39）%?？赡苁请S著反應(yīng)進(jìn)行，LCP 中游離氨基逐漸暴露，與Dex 中羰基結(jié)合，進(jìn)行糖基化反應(yīng)，接枝度隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而增大。反應(yīng)150 min 后，達(dá)到美拉德反應(yīng)后期，生成類黑素、還原酮，與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用，從而阻礙糖基化改性[12]。綜合考慮選擇反應(yīng)時(shí)間120、150、180 min 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖1D 可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，接枝度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在反應(yīng)溫度為70 ℃時(shí)，接枝度達(dá)到最大值（35.07±0.63）%?？赡苁怯捎谄暇厶欠肿雍卸鄠€(gè)羥基，引入親水羥基與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，一定程度上保護(hù)了蛋白質(zhì)，使其不易聚集，增大了溶解度，從而體系中自由氨基增加，接枝度隨之增大。隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)在高溫條件下，容易發(fā)生變性，空間結(jié)構(gòu)遭受破壞，鏈與鏈之間分子間氫鍵易團(tuán)聚[13]，導(dǎo)致溶解度降低，自由氨基的減少，從而使接枝度降低。綜合考慮選擇加熱溫度50、70、90 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化糖基化川芎蛋白制備工藝

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

每組樣品平行測(cè)定3 次，取平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析，如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Scheme and results of response surface test

由表2 得擬合方程為Y=35.10-0.60A+0.52B+0.67C+1.21D-2.50AB-0.047AC-0.51AD+0.36BC+0.092BD+0.61CD-2.40A2-3.04B2-4.60C2-3.84D2。

2.2.2 方差分析結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface test

如表3 所示，由模型F 檢驗(yàn)值可知，F(xiàn)=58.34，P<0.01，表明此回歸模型極顯著。方程失擬項(xiàng)F=0.83，P=0.635 1>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明回歸模型與試驗(yàn)實(shí)測(cè)值擬合度較好，誤差較小，可以使用該回歸方程預(yù)測(cè)糖基化川芎蛋白的接枝度。根據(jù)各因素F 值的比較可知，各因素對(duì)響應(yīng)值影響大小為反應(yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間>底物質(zhì)量比>pH 值。通過(guò)對(duì)回歸方程系數(shù)的顯著性分析，可知一次項(xiàng)A、B、C、D 的P 值均小于0.01，表明反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、底物質(zhì)量比、pH 值對(duì)接枝度的影響極顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2影響極顯著（P<0.01）；交互項(xiàng)AB 影響極顯著（P<0.01），AC、AD、BC、BD、CD影響不顯著（P>0.05）。R2=0.983 1，R2Adj=0.966 3，表示所建立的模型置信度較高，能夠很好地反映自變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

2.2.3 因素交互作用

利用Design Expert 8.0.6，分析底物質(zhì)量比、pH 值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度交互作用對(duì)接枝度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2～圖7。

圖2 底物質(zhì)量比與pH 值相互作用的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig.2 Contour diagram and response surface diagram of interaction between substrate ratio and pH

圖3 底物質(zhì)量比與反應(yīng)時(shí)間相互作用的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig.3 Contour diagram and response surface diagram of interaction between substrate ratio and time

圖4 底物質(zhì)量比與反應(yīng)溫度相互作用的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig.4 Contour diagram and response surface diagram of interaction between substrate ratio and temperature

圖5 pH 值與反應(yīng)時(shí)間相互作用的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig.5 Contour diagram and response surface diagram of interaction between pH and time

圖6 pH 值與反應(yīng)溫度相互作用的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig.6 Contour diagram and response surface diagram of interaction between pH and temperature

圖7 反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度相互作用的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig.7 Contour diagram and response surface diagram of interaction between time and temperature

由圖2～圖7 可知，底物質(zhì)量比、pH 值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度4 個(gè)因素在所選范圍內(nèi)存在極值，即等高線中最小橢圓的中心點(diǎn)。結(jié)果表明，AB 交互作用顯著，與F 值結(jié)果一致。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)Design Expert 8.0.6 分析，該模型得到糖基化川芎蛋白制備最優(yōu)條件為底物質(zhì)量比1.75∶1、pH9.19、反應(yīng)時(shí)間152.83 min、反應(yīng)溫度73.67 ℃，預(yù)測(cè)接枝度為35.37%。因考慮實(shí)際操作可行性，將驗(yàn)證條件修改為底物配質(zhì)量比1.8∶1、pH9、反應(yīng)時(shí)間153 min、反應(yīng)溫度74 ℃，平行試驗(yàn)3 次。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，平均接枝度為（35.21±0.12）%，接近理論值，表明該模型可用于優(yōu)化糖基化川芎蛋白的制備過(guò)程。

2.3 SDS-PAGE 結(jié)果

SDS-PAGE 是對(duì)蛋白質(zhì)的亞基及分子質(zhì)量分析的重要手段，并且可用于對(duì)蛋白質(zhì)糖基化后是否生成共聚物作定性鑒別[14]。圖8 是對(duì)LCP 及其糖基化產(chǎn)物進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE 圖譜。

圖8 Maker、LCP、GLCP SDS-PAGE 電泳圖Fig.8 SDS-PAGE of Maker，LCP and GLCP

由圖8 可知，泳道3、4 亞基譜帶顏色與泳道1、2相比，顏色變淺，可能是LCP 與Dex 經(jīng)過(guò)濕熱法糖基化后，生成了共聚物，LCP 中活性基團(tuán)減少，從而蛋白質(zhì)分子與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合減少，出現(xiàn)亞基譜帶顏色變淺[15]。另一方面，小分子的蛋白質(zhì)與糖共價(jià)結(jié)合后，生成大分子的共聚物向上集聚，因此出現(xiàn)亞基譜帶顏色變淺。濃縮膠頂端P1 以及濃縮膠與分離膠接縫處P2均出現(xiàn)新的條帶，分析可能是LCP 與Dex 糖基化反應(yīng)后，生成的共聚物分子量較大[16]，電泳時(shí)，這些共聚物無(wú)法通過(guò)凝膠，只能聚集在P1 和P2 處。通過(guò)亞基譜帶顏色變淺，以及出現(xiàn)新的條帶，可以說(shuō)明LCP 與Dex糖基化后生成了共聚物。

2.4 SEM 觀察

SEM 結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 樣品掃描電鏡圖Fig.9 Scanning electron microscopy of samples

由圖9 所示，LCP 糖基化前后，結(jié)構(gòu)明顯不同。圖9A 表明，糖基化前LCP 呈顆粒狀，近圓球形，大小不一。圖9B 為L(zhǎng)CP 與Dex 簡(jiǎn)單物理混合后的掃描電鏡圖，兩者的混合物具有LCP 相似的結(jié)構(gòu)，表面可以看出LCP 所具備的近圓球形形態(tài)，可以推測(cè)兩者之間并沒(méi)有化學(xué)鍵締合，而是物理混合。圖9C 為糖基化后的LCP，原本的近圓球形態(tài)消失，表面結(jié)構(gòu)變得疏松多孔，呈現(xiàn)蜂窩狀，可能是LCP 與Dex 共價(jià)結(jié)合，糖基化過(guò)程引入糖鏈，LCP 肽鏈逐漸延展開(kāi)，形成的這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[17]，可以更好地提高蛋白質(zhì)的溶解性，從而提高其功能特性。Qu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，糖基化的菜籽分離蛋白結(jié)構(gòu)變得疏松多孔，呈現(xiàn)蜂窩狀，與此結(jié)果一致。

2.5 FTIR 結(jié)果分析

FTIR 結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 LCP、GLCP 傅里葉變換紅外光譜圖Fig.10 Fourier transform infrared spectra of LCP and GLCP

FTIR 是分析蛋白質(zhì)與多糖共價(jià)結(jié)合后，分子水平上相互作用和結(jié)構(gòu)變化的有效手段[19]。由圖10 所示，與LCP 比較，GLCP 在波數(shù)為3 600～3 200 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)了明顯增強(qiáng)的吸收峰，可能是由于Dex 的引入，體系中-OH 增多，伸縮振動(dòng)引起的變化[20]。Zhao 等[21]利用大豆寡糖糖基化改性大豆分離蛋白，紅外光譜也顯示在3 600～3 200cm-1處吸收峰增強(qiáng)，與本文結(jié)果相似。在波數(shù)1 630、1 530、1 240 cm-1處，吸收峰表現(xiàn)出了不同程度的變化，這3 個(gè)波數(shù)分別在酰胺I 帶（1 700～1 600 cm-1）、酰胺II（1 580～1 480 cm-1）、酰胺III（1 300～1 200cm-1）范圍內(nèi)，分別是由于C=O 伸縮振動(dòng)、N—H彎曲振動(dòng)、C—N 拉伸和N—H 變形振動(dòng)引起的[22]。波數(shù)為1 020 cm-1時(shí)，GLCP 吸收峰強(qiáng)度與形狀變化明顯，可能是糖基化反應(yīng)中新形成的C—N 共價(jià)鍵伸縮振動(dòng)引起[23]。通過(guò)上述吸收峰的變化，可以表明LCP 與Dex 以共價(jià)鍵的方式結(jié)合，從而引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

2.6 抗氧化性結(jié)果分析

抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖11。

圖11 LCP、GLCP 對(duì)羥自由基和ABTS+自由基的清除能力Fig.11 Scavenging abilities of LCP and GLCP on hydroxyl radical and ABTS+radical

羥自由基清除率是評(píng)價(jià)自由基清除能力的重要指標(biāo)，有效清除自由基是針對(duì)自由基誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起的各種疾病的保護(hù)方法之一[24-25]。由圖11A 所示，隨著樣品濃度的增大，LCP、GLCP 對(duì)羥自由基的清除率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且GLCP 在濃度為0.8 mg/mL 后，上升速度較快，在濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，清除率為（65.91±1.93）%。在相同的濃度范圍內(nèi)，羥自由基清除能力強(qiáng)弱依次為VC＞GLCP＞LCP，其中陽(yáng)性對(duì)照VC的IC50值為0.67 mg/mL，GLCP 的IC50值為0.88 mg/mL，LCP 的IC50值為2.20 mg/mL。由此可以看出GLCP 的清除效果雖不及VC，但強(qiáng)于LCP。楊志偉等[26]研究β-葡聚糖糖基化對(duì)裸燕麥蛋白抗氧化活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)糖基化裸燕麥蛋白羥自由基清除率是原蛋白的2.13 倍，可以證實(shí)經(jīng)過(guò)糖基化反應(yīng)，清除羥自由基能力可以得到提高。

由圖11B 所示，隨著樣品濃度的增大，LCP、GLCP對(duì)ABTS+自由基的清除率均呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，其中GLCP 趨勢(shì)較陡，有明顯的量效關(guān)系。當(dāng)其濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時(shí)，GLCP 對(duì)ABTS+自由基的清除率為（81.80±2.18）%，LCP 為（41.63±2.18）%。VC組IC50值為0.16 mg/mL，GLCP 的IC50值為0.45 mg/mL，LCP 的IC50值為1.5 mg/mL，可以推測(cè)出GLCP 具有良好的清除ABTS+自由基能力。有關(guān)乳清蛋白研究也表明，糖基化后乳清蛋白清除ABTS+自由基能力有明顯提高[27]。

通過(guò)抗氧化試驗(yàn)結(jié)果，可以得出GLCP 對(duì)羥自由基、ABTS+自由基的清除能力雖弱于VC，但均強(qiáng)于LCP，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。分析可能是經(jīng)過(guò)糖基化后，其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的改變，使其溶解度的增加，在相同濃度下，GLCP 更易溶于水，可向自由基提供質(zhì)子[28]。另一方面，美拉德反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生一些類黑素物質(zhì)，而這些物質(zhì)是自由基清除能力的貢獻(xiàn)者[29]。并且糖基化的蛋白質(zhì)有較好的供氫能力，更易與自由基反應(yīng)[30]。

3 結(jié)論

利用單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化LCP 糖基化最佳工藝條件為底物質(zhì)量比（Dex∶LCP）1.8∶1、溶液pH9、反應(yīng)時(shí)間153 min、反應(yīng)溫度74 ℃。在此條件下糖基化的平均接枝度為（35.21±0.12）%。SDS-PAGE 分析可知，LCP 與Dex 生成共聚物，并且分子量較大，電泳時(shí)，滯留在濃縮膠頂端以及濃縮膠與分離膠接縫處；SEM 分析可知，生成的共聚物表面結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)疏松多孔，蜂窩狀；通過(guò)特征吸收峰不同程度的變化可知，LCP 二級(jí)結(jié)構(gòu)有所改變。通過(guò)對(duì)自由基清除能力的測(cè)定，GLCP 相比原蛋白其抗氧化能力均有提升。綜上所述，采用濕熱法糖基化改性LCP，LCP 溶解度得到改善，從而抗氧化性提高，可能是該過(guò)程引入了糖分子。本研究結(jié)果顯示，GLCP 具有良好的抗氧化能力，并且為天然植物蛋白，具有安全、無(wú)刺激、無(wú)毒副作用的優(yōu)勢(shì)，本研究可為其在抗氧化研究方面提供參考。