沙門氏菌核酸適配體的篩選、生物傳感與抑菌應(yīng)用

李宸葳，李天順，王佳，朱龍佼，許文濤*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 營(yíng)養(yǎng)與健康系，北京 100190）

沙門氏菌（Salmonella）屬于變形菌門腸道桿菌科沙門氏菌屬，包括腸道沙門氏菌（Salmonella enterica）和邦戈?duì)柹抽T氏菌（Salmonella bongori），其中腸道沙門氏菌下有6 個(gè)亞種，包括2 600 多種血清型；邦戈?duì)柹抽T氏菌由邦戈?duì)杹喎N單獨(dú)構(gòu)成。沙門氏菌是1 種桿狀的革蘭氏陰性菌，好氧或兼性厭氧，周生鞭毛，表現(xiàn)出較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力。沙門氏菌是最常見的食源性病原體之一[1]，常在雞蛋、奶制品、肉類、海產(chǎn)品等富含蛋白質(zhì)的食物中檢出，對(duì)環(huán)境具有良好的抵抗能力，在食物、植物表面、水中能存活超過(guò)3 個(gè)月。沙門氏菌對(duì)人體健康具有嚴(yán)重的危害，攝入的病原菌在胃的酸性環(huán)境存活后，會(huì)進(jìn)入小腸，跨越小腸的黏液層黏附于腸上皮細(xì)胞，誘發(fā)一系列腸道炎癥，甚至全身系統(tǒng)性感染，表現(xiàn)為腹瀉、發(fā)燒、胃痙攣、嘔吐等癥狀[2]，對(duì)于免疫功能低下的人群，沙門氏菌的感染甚至可能威脅生命。目前，為了降低沙門氏菌對(duì)人類、家畜、家禽的危害，主要從以下兩個(gè)方面展開研究：一是開發(fā)沙門氏菌的檢測(cè)方法，及時(shí)規(guī)避沙門氏菌可能引起的風(fēng)險(xiǎn)，降低攝入病原菌的可能；二是開發(fā)防控沙門氏菌感染的新型藥物或抗感染策略，對(duì)已感染的患者進(jìn)行有效地治療，降低病原菌對(duì)宿主的危害。

傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)方法是平板計(jì)數(shù)法：稱取一定質(zhì)量的樣品，利用非選擇性的培養(yǎng)基進(jìn)行菌株的復(fù)蘇和富集，最后通過(guò)選擇性培養(yǎng)基分離出沙門氏菌，進(jìn)行計(jì)數(shù)及血清型鑒定。這類方法操作簡(jiǎn)單、成本低、結(jié)果可靠，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，通常需要數(shù)天的培養(yǎng)才可得到檢測(cè)結(jié)果，耗時(shí)耗力，不適用于多樣本檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。隨著細(xì)菌基因組學(xué)的不斷發(fā)展，分子檢測(cè)技術(shù)受到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。對(duì)沙門氏菌的特異性靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，大大提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，也縮短了檢測(cè)時(shí)間。目前，許多商品化的檢測(cè)試劑盒已經(jīng)用于沙門氏菌的篩查和檢測(cè)中[3]。但這類方法仍需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，裂解細(xì)菌細(xì)胞、提取DNA，在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些局限；另外，引物與非靶標(biāo)序列的結(jié)合、擴(kuò)增子在檢測(cè)環(huán)境中的氣溶膠污染，都可能產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果，需要克服和解決。另外，基于抗體的免疫方法[4]能夠特異性分離和檢測(cè)食源性病原體，通過(guò)特異性的捕獲，無(wú)需擴(kuò)增，即可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。但抗體作為一種蛋白質(zhì)，存在不穩(wěn)定、成本高、難儲(chǔ)存、生產(chǎn)程序復(fù)雜的不足，限制了該類方法的實(shí)際應(yīng)用。

在沙門氏菌感染的治療方面，同樣存在著亟待解決的困難。目前，抗生素仍然是治療沙門氏菌感染的主流藥物，但病原菌對(duì)抗生素耐藥性不斷產(chǎn)生，對(duì)疾病的防治提出了挑戰(zhàn)?？股氐难邪l(fā)需要較長(zhǎng)的周期，且過(guò)程復(fù)雜，需要耗費(fèi)較大的人力物力，因此，近年來(lái)很少有新型的抗生素上市。越來(lái)越多的研究更傾向于新型藥物的開發(fā)，尋找新型的治療、抑菌策略已經(jīng)成為防治沙門氏菌感染的關(guān)鍵。

適配體具有優(yōu)異的特異性和靶向性，其在沙門氏菌的檢測(cè)和防治兩個(gè)方面，可作為有力的工具，顯示出了巨大的發(fā)展?jié)摿?。適配體是通過(guò)配體指數(shù)富集的系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands exponential enrichment，SELEX）技術(shù)篩選獲得的一段單鏈寡合苷酸序列，能夠特異性地與靶標(biāo)分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物。適配體被公認(rèn)為“化學(xué)抗體”，其親和力和選擇性與抗體相當(dāng)，同時(shí)具有穩(wěn)定性高、易復(fù)制、易修飾等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。在檢測(cè)方面，適配體可作為識(shí)別元件，在檢測(cè)體系中對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行“抓取”，觸發(fā)各類生物傳感器的輸出信號(hào)，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。在治療方面，適配體可作為藥物遞送載體的靶向識(shí)別模塊，搭建協(xié)同抗菌體系；另外，特異性結(jié)合細(xì)菌表面功能結(jié)構(gòu)的適配體可以對(duì)活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉，發(fā)揮抑菌功能，降低細(xì)菌對(duì)人體的危害。

本文對(duì)沙門氏菌的適配體進(jìn)行匯總，介紹目前已有適配體的篩選方法，闡述適配體與沙門氏菌的結(jié)合機(jī)制，整理了目前檢測(cè)沙門氏菌的各類生物傳感器，另外，總結(jié)沙門氏菌適配體在抑菌方面的應(yīng)用，旨在為適配體在檢測(cè)領(lǐng)域和生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 沙門氏菌適配體的篩選策略

在SELEX 篩選過(guò)程中，最核心的關(guān)鍵點(diǎn)是提高所篩選適配體的特異性和親和力。目前，已開發(fā)多種細(xì)菌適配體的篩選策略，包括基于離心的細(xì)胞-SELEX（Cell-SELEX）；固定靶標(biāo)的篩選策略，如磁珠-SELEX（magnetic beads-SELEX,MB-SELEX）、瓊脂糖珠-SELEX（agarose beads-SELEX,AB-SELEX）、石英晶體微天平-SELEX（quartz crystal microbalance-SELEX,QCMSELEX）等；固定文庫(kù)篩選策略，如捕獲-SELEX（Capture-SELEX）等。另外，根據(jù)適配體的應(yīng)用需求，可對(duì)細(xì)菌表面的功能成分進(jìn)行特異性的篩選。目前，已篩選出的沙門氏菌適配體及其篩選策略如表1 所示。

表1 沙門氏菌適配體匯總Table 1 Aptamers against Salmonella

1.1 全細(xì)胞-SELEX

全細(xì)胞-SELEX（Cell-SELEX）是篩選細(xì)菌適配體最常用的方法[5-7]。Cell-SELEX 使用全細(xì)胞作為靶標(biāo)，篩選前不需要對(duì)菌表的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取或純化，且攜帶真實(shí)的物質(zhì)分布信息的細(xì)胞比單一物質(zhì)作為靶標(biāo)更能保證所得核酸適配體在結(jié)合中的穩(wěn)定性，適配體能夠與真實(shí)的折疊構(gòu)象結(jié)合，具有簡(jiǎn)單、高效的優(yōu)點(diǎn)。Cell-SELEX 的通用流程：將單鏈DNA 文庫(kù)與靶細(xì)胞共孵育，洗脫非結(jié)合序列，95 ℃下加熱細(xì)胞-ssDNA 復(fù)合物使其變性，然后離心，從細(xì)胞中回收結(jié)合序列。通過(guò)引入其他細(xì)菌作為反篩靶標(biāo)育，可以確保所選的適配體對(duì)目標(biāo)沙門氏菌保持高特異性。然后利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增獲得的序列通過(guò)不對(duì)稱PCR、酶消化技術(shù)等方法制備單鏈次級(jí)文庫(kù)[29]，再進(jìn)行下一輪的篩選。Liu 等[27]報(bào)道了采用Cell-SELEX 篩選的識(shí)別沙門氏菌O8 細(xì)胞的適配體，但篩選靶標(biāo)是滅活的沙門氏菌，所篩選的適配體是否可以識(shí)別活的沙門氏菌尚未得到驗(yàn)證。為了能夠讓適配體在檢測(cè)、診斷及治療等方面更好地應(yīng)用，在后續(xù)的研究中，往往更多采用活的沙門氏菌作為靶標(biāo)[8]。

通過(guò)Cell-SELEX 技術(shù)所選擇的適配體不僅與靶菌具有更穩(wěn)定的結(jié)合，而且，可用于探究細(xì)胞上未知表面蛋白和新的生物標(biāo)志物，這是使用單一物質(zhì)作為靶標(biāo)不能實(shí)現(xiàn)的[30]。但在互作分析時(shí)，因?yàn)榛プ靼袠?biāo)的未知性，Cell-SELEX 所篩選的適配體需要與菌表成分進(jìn)行逐一互作探究，需要耗費(fèi)較大的工作量，這也成為了Cell-SELEX 的應(yīng)用局限。

1.2 固定靶標(biāo)的篩選策略

固定靶標(biāo)的篩選策略是指將需要篩選的靶菌或特異性成分固定在可分離的固定載體上，再與DNA 或RNA 文庫(kù)進(jìn)行孵育，通過(guò)分離載體實(shí)現(xiàn)與靶標(biāo)有親和力和沒有親和力的核酸序列的區(qū)分。早在2009 年，Joshi 等[14]將鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白固定在硝酸纖維素膜上，利用側(cè)流色譜裝置篩選出了特異性結(jié)合鼠傷寒沙門氏菌的適配體。目前，已經(jīng)被應(yīng)用于沙門氏菌適配體篩選的固定載體包括瓊脂糖珠[13，15]、磁珠[28]和載玻片[16]等。Wang 等[2]采用了一種較為新穎的方法，利用石英晶體的壓電效應(yīng)，將電極表面的質(zhì)量變化轉(zhuǎn)換為電信號(hào)輸出，成功研發(fā)了基于QCM 的篩選策略。QCMSELEX 能夠有效檢測(cè)晶體表面的分子相互作用，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)適配體池的親和力變化，具有快速、高效和低勞動(dòng)成本的顯著優(yōu)勢(shì)。

固定載體可能存在非特異性吸附，因此，需要選擇合適的封閉劑對(duì)載體進(jìn)行化學(xué)改性。Shatila 等[28]在利用谷胱甘肽功能化的磁珠進(jìn)行篩選時(shí)，添加0.1 mg/mL牛血清白蛋白和0.025 mg/mL 鮭魚精子DNA 作為結(jié)合緩沖液，避免了非特異性相互作用，成功獲得了沙門氏菌侵襲蛋白SipA 的高親和力適配體。

1.3 固定文庫(kù)的篩選策略

Capture-SELEX 是最主要的固定核酸文庫(kù)的篩選方法，使用捕獲探針將文庫(kù)固定到基質(zhì)上，只有序列與靶標(biāo)相互作用并發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)才能夠從基質(zhì)上洗脫。Capture-SELEX 無(wú)需修飾或改變靶標(biāo)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，保持了靶標(biāo)的天然結(jié)構(gòu)，并且靶標(biāo)以游離狀態(tài)與文庫(kù)結(jié)合，可以暴露所有潛在的結(jié)合位點(diǎn)[31]，在結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換型適配體的篩選中發(fā)揮了重要作用。Ye 等[17]通過(guò)Capture-SELEX 的方法，篩選到針對(duì)革蘭氏陰性菌的廣譜適配體，能夠同時(shí)識(shí)別來(lái)自傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌055：B5、銅綠假單胞菌的脂多糖。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也稱為內(nèi)毒素，由脂質(zhì)A、核心多糖和O-特異性多糖組成。其中脂質(zhì)A 是LPS 的高度保守成分。將ssDNA 文庫(kù)首先固定在抗生物素蛋白包被的磁性納米粒子（avidin-coated magnetic nanoparticles，aMNPs）上，加入傷寒沙門氏菌進(jìn)行了6 輪“預(yù)篩選”，對(duì)與傷寒沙門氏菌有親和力的適配體進(jìn)行了富集，然后利用其他革蘭氏陰性菌進(jìn)行廣譜型適配體的選擇，得到了可以識(shí)別LPS 的脂質(zhì)A 的廣譜型適配體。因此，在多重靶標(biāo)適配體的篩選中，利用Capture-SELEX 不需要對(duì)每一個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行固定，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)流程，提高了篩選效率，當(dāng)需要篩選廣譜型適配體時(shí)，Capture-SELEX 更具優(yōu)勢(shì)。

1.4 后篩選策略（Post-SELEX）對(duì)適配體的優(yōu)化

通常情況下，適配體序列中并非每一個(gè)核苷酸都發(fā)揮作用，只有少數(shù)核苷酸與靶標(biāo)結(jié)合并誘導(dǎo)構(gòu)象改變。因此，越來(lái)越多的研究者會(huì)在篩選完成后對(duì)獲得的適配體序列進(jìn)行優(yōu)化，將其裁剪到最小的緊湊結(jié)構(gòu)，獲得親和力更高、特異性更強(qiáng)、組織穿透率更高的適配體。Kolovskaya 等[8]在去除原始適配體兩端的引物結(jié)合區(qū)域后，截短的適配體表現(xiàn)出更好的結(jié)合能力，同時(shí)抗菌活性從9%增加至42%。這可能是因?yàn)椴粎⑴c結(jié)合識(shí)別的引物結(jié)合位點(diǎn)的去除降低了序列的負(fù)電荷（細(xì)胞壁同樣帶負(fù)電）和空間位阻。Chinnappan 等[20]基于適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)進(jìn)一步截短適配體SE54。首先研究?jī)蓚€(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，證明其沒有與靶標(biāo)結(jié)合后，從兩個(gè)發(fā)夾的中間截?cái)?，得?9mer 的截短適配體。與原始SE54 適配體相比，對(duì)腸炎沙門氏菌的親和力高兩倍，證實(shí)截短的適配體與腸炎沙門氏菌形成更穩(wěn)定的復(fù)合物。

優(yōu)化后的適配體更加簡(jiǎn)潔、高效，有助于打破其應(yīng)用的局限，優(yōu)化的過(guò)程中，需要深入了解適配體和靶標(biāo)的結(jié)合機(jī)理，為適配體的裁剪和工程化提供指導(dǎo)。

2 基于沙門氏菌適配體的生物傳感策略

2.1 光學(xué)生物傳感器

利用適配體與菌體之間特異性結(jié)合后引起的光吸收、熒光、散射等光學(xué)信號(hào)的變化，可實(shí)現(xiàn)光學(xué)生物傳感器的構(gòu)建。光學(xué)生物傳感器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)快速，吸引了越來(lái)越多的關(guān)注。目前，用于沙門氏菌檢測(cè)的光學(xué)生物傳感器主要分為5 種：基于比色、熒光、化學(xué)發(fā)光、表面增強(qiáng)拉曼散射和光熱效應(yīng)的生物傳感器。

2.1.1 比色生物傳感器

比色生物傳感器具有直觀讀出方便、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在分析傳感領(lǐng)域廣受歡迎。其中，比色方法中最常見的工具是金納米顆粒（gold nanoparticles，AuNPs）[32-33]。Xu 等[32]基于AuNPs 共軛雙功能寡核苷酸探針和適配體，開發(fā)了一種快速、可視化的鼠傷寒沙門氏菌檢測(cè)方法。AuNPs 與雙功能寡核苷酸探針和適配體綴合后，加入靶標(biāo)細(xì)菌一起孵育。適配體與靶標(biāo)結(jié)合并發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致AuNPs 被釋放。釋放的AuNPs 會(huì)在NaCl作用下聚集，使溶液的顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色。該方法的檢測(cè)限為10 CFU/mL。另外，基于納米材料的模擬過(guò)氧化物酶活性的比色傳感器應(yīng)用也十分廣泛[33]，適配體能夠封閉納米酶的催化活性，在與分析物結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致納米酶活性的恢復(fù)。Tarokh 等[34]制備了石墨氮化碳納米片和氧化銅納米晶體的新型復(fù)合材料，具有良好的類過(guò)氧化物酶活性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)。該方法的紙質(zhì)設(shè)備檢測(cè)時(shí)間僅需6 min，實(shí)現(xiàn)了無(wú)酶、無(wú)標(biāo)記的快速檢測(cè)。此外，pH 響應(yīng)比色傳感原理簡(jiǎn)單、成本更低，也具有良好的應(yīng)用前景。Yan 等[35]通過(guò)加入酚酞指示劑和百里酚酞指示劑構(gòu)建了pH 響應(yīng)的納米粒子，開發(fā)了雙適配體夾心策略，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的同時(shí)檢測(cè)，并且還研發(fā)了病原菌雙重檢測(cè)自動(dòng)裝置，可以通過(guò)機(jī)械臂自動(dòng)完成樣品吸收、孵育、洗脫等試驗(yàn)操作，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需要通過(guò)NEMO 軟件進(jìn)行編輯，可實(shí)現(xiàn)按鍵檢測(cè)。該系統(tǒng)有望應(yīng)用于病原菌監(jiān)測(cè)的早期防控，推動(dòng)檢測(cè)行業(yè)向自動(dòng)化、便捷、高通量方向發(fā)展。

2.1.2 熒光生物傳感器

目前，基于適配體的熒光生物傳感器的熒光標(biāo)記主要分為兩類：一類是熒光素5-異硫氰酸酯（fluores cein isothiocyanate isomer I，F(xiàn)ITC）和吲哚三碳菁（cyanine 3，CY3）等特定化學(xué)修飾[36]，一類是合成的熒光多功能納米顆粒，如量子點(diǎn)[26]、碳點(diǎn)[37]、上轉(zhuǎn)換納米顆粒[38]、銅納米顆粒[39]和銀納米簇[40]等。按照傳感策略可將其劃分為單標(biāo)記型熒光傳感器[35，37]和基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的雙標(biāo)記型熒光傳感器。Du 等[37]開發(fā)了一種基于量子點(diǎn)和四面體DNA 的生物傳感器，通過(guò)在磁珠表面修飾適配體捕獲鼠傷寒沙門氏菌，并將其從復(fù)雜基質(zhì)中分離出來(lái)，另一條適配體與熒光碳點(diǎn)偶聯(lián)形成熒光微球。這些微球能夠主動(dòng)識(shí)別鼠傷寒沙門氏菌并與靶標(biāo)結(jié)合發(fā)出熒光。檢出限為9 CFU/mL，檢測(cè)范圍為10～108CFU/mL。Rm等[26]開發(fā)了一種基于適配體的FRET測(cè)定法，用于測(cè)定甲型副傷寒沙門氏菌。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）用作熒光猝滅劑，通過(guò)π-π 靜電相互作用吸附適配體標(biāo)記的量子點(diǎn)并實(shí)現(xiàn)熒光猝滅。在目標(biāo)菌存在的情況下，觀察到熒光恢復(fù)。這種方法可在15 min 內(nèi)響應(yīng)，檢出限為10 CFU/mL。另外，研究者們還開發(fā)各類信號(hào)放大方法，有助于提高檢測(cè)靈敏度，如引入核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[41]、使用多價(jià)適配體探針[37]、磁分離預(yù)濃縮目標(biāo)微生物[42]等。目前，熒光傳感器已被廣泛用于食品中的沙門氏菌檢測(cè)，隨著便攜式熒光檢測(cè)器的發(fā)展，熒光生物傳感器在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更大潛力。

2.1.3 化學(xué)發(fā)光生物傳感器

化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence，CL）信號(hào)由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生，無(wú)需激發(fā)光照射，可避免光散射、光源波動(dòng)和高背景值的干擾，是食品安全檢測(cè)中很有前途的策略。Hao 等[43]利用適配體修飾的Fe3O4磁性納米顆粒作為捕獲探針，捕獲靶菌后與滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物形成三明治復(fù)合物，N-（4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾[N-（4-aminobutyl）-N-ethylisoluminol，ABEI] 結(jié)合AuNPs 作為信號(hào)探針，與滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，構(gòu)建穩(wěn)態(tài)的化學(xué)發(fā)光體系，產(chǎn)生CL 信號(hào)。該傳感器能夠特異靈敏地檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌，線性檢測(cè)范圍為32～3.2×106CFU/mL，檢出限為10 CFU/mL。穩(wěn)態(tài)CL 系統(tǒng)可以有效避免隨機(jī)誤差，提高了檢測(cè)的選擇性和準(zhǔn)確性。Lee 等[44]將化學(xué)發(fā)光法與比色法進(jìn)行了對(duì)照，建立一種使用發(fā)夾DNA適配體傳感器檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的簡(jiǎn)單方法，發(fā)夾探針包含靶標(biāo)結(jié)合適配體和具有辣根過(guò)氧化物模擬酶活性的G-四鏈體，引入氯化血紅素和對(duì)香豆酸開發(fā)比色和化學(xué)發(fā)光傳感策略，結(jié)果證明，化學(xué)發(fā)光法的靈敏度提高了近50 倍。

2.1.4 表面增強(qiáng)拉曼散射生物傳感器

表面增強(qiáng)拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）是一種超靈敏的振動(dòng)光譜技術(shù)，當(dāng)目標(biāo)分析物吸附在貴金屬納米材料表面時(shí)，能夠通過(guò)電磁和化學(xué)相互作用放大拉曼信號(hào)。基于SERS 的生物傳感器靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的定量檢測(cè)能力，已被廣泛用于病原體檢測(cè)。在各種SERS 活性基質(zhì)中廣泛存在“熱點(diǎn)”，如單分散顆粒、核殼結(jié)構(gòu)、二聚體、三聚體和納米星等。Ma 等[45]制備了由拉曼信號(hào)分子標(biāo)記的適配體序列介導(dǎo)的金/銀納米二聚體顆粒，并用作SERS 信號(hào)探針。使用適配體功能化的磁性納米顆粒實(shí)現(xiàn)病原體的捕獲和富集，然后在細(xì)菌與其適配體之間的識(shí)別作用下形成三明治結(jié)構(gòu)復(fù)合物。由于二聚體之間產(chǎn)生的“熱點(diǎn)”效應(yīng)放大結(jié)合處的拉曼信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)牛奶樣品中鼠傷寒沙門氏菌的靈敏檢測(cè)。隨著手持式拉曼檢測(cè)平臺(tái)的發(fā)展，SERS 方法得到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。但食品中的復(fù)雜成分可能會(huì)降低所開發(fā)方法的靈敏度，目前，在復(fù)雜生物環(huán)境中提供拉曼信號(hào)的特異性和靈敏增強(qiáng)仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。

2.1.5 光熱信號(hào)生物傳感器

光熱信號(hào)是一些重金屬納米材料獨(dú)有的特性，當(dāng)重金屬納米顆粒受到特定激發(fā)光的激發(fā)，可在近紅外區(qū)表現(xiàn)出優(yōu)異的光熱性能。光熱信號(hào)可以避免檢測(cè)樣品基質(zhì)中有色物質(zhì)對(duì)檢測(cè)信號(hào)的影響，解決了背景干擾的問(wèn)題。Huang 等[46]利用Au-Pd 納米顆粒的光熱特性構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單、快速、防污、靈敏的沙門氏菌檢測(cè)方法。首先，將甲基丙烯酸磺酰鈉（sodium sulfonyl methacrylate，SBMA）通過(guò)光聚合改性，與沙門氏菌特異性適配體孵育，然后將其附著在棉簽表面。SBMA 增加了棉簽拭子的防污性，防止在取樣時(shí)沾染大量的非特異性蛋白，而適配體可對(duì)樣品中的沙門氏菌進(jìn)行捕獲。將棉簽浸入適配體修飾的Au-Pd 納米顆粒溶液中，適配體識(shí)別棉簽上的沙門氏菌，使得棉簽顏色變?yōu)樽厣?，?shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果肉眼可見。另外，利用“蛇眼”設(shè)備實(shí)現(xiàn)了定量分析。蛇眼設(shè)備由激光發(fā)射器、紅外測(cè)溫儀和智能手機(jī)組成，能夠讀取光熱信號(hào)的溫度變化數(shù)據(jù)，用于定量檢測(cè)有色食品中的沙門氏菌。在雞蛋、番茄和牛奶樣品中，這一傳感器顯示了良好的檢測(cè)效果，線性檢測(cè)范圍為102～107CFU/mL，檢出限為13.20 CFU/mL。結(jié)果表明，光熱信號(hào)傳感器對(duì)復(fù)雜的食品基質(zhì)尤其是有色食品基質(zhì)表現(xiàn)出了較高的靈敏度，易于現(xiàn)場(chǎng)使用。

2.2 電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)檢測(cè)方法因其響應(yīng)快速、高靈敏和造價(jià)低廉等優(yōu)點(diǎn)在生物診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品安全領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。將沙門氏菌適配體作為特異性捕獲探針修飾到電極表面，通過(guò)靶標(biāo)結(jié)合誘導(dǎo)的電化學(xué)信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌的定量檢測(cè)。根據(jù)信號(hào)類型可分為電流型、阻抗型、電導(dǎo)型和壓電型生物傳感器等。如Wang 等[2]利用石英晶體微天平實(shí)現(xiàn)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌適配體篩選過(guò)程的監(jiān)測(cè)，同時(shí)能夠在1 h 內(nèi)檢測(cè)到103CFU/mL 的鼠傷寒沙門氏菌。利用石英晶體電極的壓電特性，將晶體表面的質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，不需要額外的信號(hào)標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，但傳感靈敏度仍需進(jìn)一步提高。研究者們開發(fā)了多種多樣的信號(hào)放大方法：1）在電極材料中引入新型納米材料（如還原氧化石墨烯[47]、銀納米顆粒[48]、多壁碳納米管[49]、二氧化鈦[50]、金屬有機(jī)框架[51]等）和復(fù)合納米材料，起到增加表面積、加速電子轉(zhuǎn)移并有效增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)的作用。2）引入核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[52]形成大量重復(fù)序列，從而極大地放大檢測(cè)信號(hào)。3）引入辣根過(guò)氧化物酶催化系統(tǒng)增加電流響應(yīng)[53]。作為一種具有吸引力的方法，光電化學(xué)適配體生物傳感器目前尚未應(yīng)用于沙門氏菌的檢測(cè)研究之中。

3 沙門氏菌適配體的抑菌應(yīng)用

適配體除了作為識(shí)別元件，還可用于對(duì)靶標(biāo)菌的檢測(cè)，也可以作為輔助藥物，通過(guò)干擾細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)、減少生物毒素的釋放、控制菌膜的形成等作用在生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。針對(duì)感染沙門氏菌的患者，通常使用抗生素及時(shí)進(jìn)行治療，近年來(lái)，腸道沙門氏菌中抗菌素耐藥性的增加已成為全球嚴(yán)重的臨床問(wèn)題。大多數(shù)沙門氏菌屬已獲得對(duì)氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、磺胺類和四環(huán)素類藥物的多重耐藥性，自20世紀(jì)70 年代，新型抗生素的研發(fā)速度減慢，在實(shí)驗(yàn)室條件下通過(guò)微生物純培養(yǎng)的方法已經(jīng)很難從微生物代謝產(chǎn)物中獲取新的、并具有開發(fā)價(jià)值的抗生素。如今，尋找新型抑菌、殺菌策略已經(jīng)成為治療沙門氏菌感染的關(guān)鍵方向。

3.1 適配體單獨(dú)抑菌

3.1.1 抑制沙門氏菌對(duì)腸道細(xì)胞的黏附

已有大量的研究證明，對(duì)編碼細(xì)菌表面有生物功能成分的基因進(jìn)行敲除或突變，可以有效減少細(xì)菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附[54]，實(shí)現(xiàn)抑制毒性的目的。如果利用適配體與這些關(guān)鍵成分優(yōu)先進(jìn)行靶向結(jié)合，讓其不能發(fā)揮活性，也可以達(dá)到同樣的作用。例如，由三型分泌系統(tǒng)（type three secretory system，T3SS）介導(dǎo)的上皮細(xì)胞感染需要結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)子蛋白、效應(yīng)蛋白、伴侶蛋白等發(fā)揮協(xié)同作用，對(duì)某一種蛋白進(jìn)行活性抑制或突變，可能會(huì)對(duì)沙門氏菌表面的侵入效果產(chǎn)生很大影響。沙門氏菌表面的蛋白SipA 是一種效應(yīng)蛋白，侵入過(guò)程中導(dǎo)致宿主細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白聚合，進(jìn)而誘發(fā)侵入部位的細(xì)胞膜褶皺，這一過(guò)程有利于細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)化。Shatila 等[28]通過(guò)MB-SELEX 的方法篩選了SipA 的適配體Apt17，表現(xiàn)出了良好的親和力，在沙門氏菌感染人上皮結(jié)直腸腺癌細(xì)胞前加入Apt17，可以降低25%的黏附和18.03%的入侵，證明適配體具有作為抗黏附劑和抗入侵劑的潛力。提高適配體與靶標(biāo)的親和力可以進(jìn)一步提高抑制百分比，優(yōu)化藥物的治療效果。另外，菌毛是革蘭氏陰性菌菌體表面的絲狀蛋白，具有抗原性，與致病性相關(guān)。Pan 等[13]篩選了識(shí)別沙門氏菌IVB 型菌毛結(jié)構(gòu)蛋白的RNA 適配體S-PS8.4，不僅利用S-PS8.4 顯著抑制了沙門氏菌進(jìn)入人類THP-1 細(xì)胞，同時(shí)為分析細(xì)菌菌毛結(jié)構(gòu)與宿主細(xì)胞的相互作用、探究發(fā)病機(jī)制方面提供了新的思路和工具。

3.1.2 抑制生物膜的形成

生物膜也叫作菌膜，是細(xì)菌組成的群落，通過(guò)細(xì)胞外大分子黏附在固體表面。在生物膜中，細(xì)菌被包裹在由多糖、細(xì)胞外DNA、菌毛、鞭毛組成的細(xì)胞外基質(zhì)中，有助于細(xì)菌在不利環(huán)境中生存。生物膜的形成使細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了高度的耐藥性，也不利于宿主免疫防御系統(tǒng)對(duì)其的清除。作為細(xì)菌細(xì)胞重要的運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)，鞭毛介導(dǎo)的方向性和附著性在生物膜形成的初期起到了十分重要的作用。已有許多研究證明，運(yùn)動(dòng)缺陷型菌株很大程度上也會(huì)成為生物膜缺陷型菌株[55]。因此，抑制鞭毛的功能對(duì)抑制早期生物膜的形成十分重要。Ning 等[24]研究了沙門氏菌適配體的新應(yīng)用途徑，適配體可以限制鞭毛蛋白的旋轉(zhuǎn)頻率，覆蓋其結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)細(xì)胞和表面的靜電排斥，可以抑制生物膜的初始附著。首先篩選了霍亂沙門氏菌的適配體Aptamer3，利用結(jié)晶紫法測(cè)定生物膜的形成，隨著適配體濃度的增加，沙門氏菌的存活率降低至13.8%，用1.1 μmol/L 的適配體預(yù)處理后，5 μg/mL 氨芐西林鈉產(chǎn)生的活性抑制率可以達(dá)到未預(yù)處理組100 μg/mL 的抑制效果。這一結(jié)果表明，篩選細(xì)菌鞭毛的適配體可作為一種新策略，成為抑制生物膜形成的有效手段。

3.1.3 誘導(dǎo)細(xì)胞膜去極化

Kolovskaya 等[8]研究了篩選獲得的適配體對(duì)腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)適配體和沙門氏菌孵育30 min 后，會(huì)引起細(xì)菌膜去極化并抑制瓊脂平板上菌落的形成。但適配體誘導(dǎo)的細(xì)菌膜去極化的分子機(jī)制仍有待確定。此外，適配體還有望通過(guò)抑制細(xì)菌生物毒素的釋放來(lái)降低致病性。脂多糖，也稱為內(nèi)毒素，在低濃度時(shí)對(duì)免疫系統(tǒng)有益，但在高濃度時(shí)有害，可能引發(fā)各種食源性疾病或感染，例如發(fā)燒、腹瀉、感染性休克、多器官衰竭，甚至死亡。Ye 等[17]篩選獲得了針對(duì)革蘭氏陰性菌的廣譜適配體，鑒定的適配體具有作為用于分析和臨床應(yīng)用的毒性抑制劑的潛力。

3.2 適配體輔助型抗菌藥物

3.2.1 與納米材料聯(lián)用

納米材料是指至少有一維處于納米量級(jí)的新一代材料，包括無(wú)機(jī)和有機(jī)兩大類。在抑菌方面，納米材料可作為載體，封裝抑菌藥物并將其遞送至患處，實(shí)現(xiàn)保護(hù)藥物活性、增強(qiáng)藥效的目的。除此之外，許多納米材料本身也具有優(yōu)越的抗菌性能，具有抗菌譜廣、穩(wěn)定性好、抗耐藥性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，受到了廣泛的關(guān)注和研究。如Yang 等[56]設(shè)計(jì)了一種DNA 模板化銀納米團(tuán)簇（DNA-AgNCs），將其光學(xué)性能和抗菌性能巧妙地結(jié)合在一起，成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌的可視化監(jiān)測(cè)和有效清除；基于DNA-AgNCs 開發(fā)了具有優(yōu)異的選擇性和抗菌活性的熒光納米膜，在活性包裝和生物醫(yī)學(xué)工程方面表現(xiàn)了良好的應(yīng)用潛力。

大多數(shù)納米材料并不具有靶向性，非靶向的遞送機(jī)制效率低，難以通過(guò)重重屏障。通過(guò)表面修飾具有靶向性的配體，可以更好地發(fā)揮作用。適配體分子量小、親和力高，是賦予納米材料靶向抗菌特性的良好選擇。Mao 等[57]利用GO 與適配體結(jié)合，開發(fā)了一種可以除去已形成生物膜的抗菌藥物。石墨烯可以從細(xì)胞膜中提取磷脂并破壞其完整性，通過(guò)適配體與GO 的協(xié)同作用，適配體-GO 復(fù)合物表現(xiàn)出了更優(yōu)的抗菌效果，可實(shí)現(xiàn)（93.3±3.4）%的生物膜抑制率和（84.6±5.1）%的生物膜降解率，提升了GO 的抑菌效果。適配體改性的納米材料作為新型藥物，可以避免抗生素的濫用，并有助于遏制耐藥細(xì)菌數(shù)量的上升，在食品行業(yè)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域提供了新思路，具有良好的發(fā)展前景。

3.2.2 與抗菌藥物聯(lián)用

由于缺乏有效的遞送系統(tǒng)，許多抗菌藥物穿透能力差，在到達(dá)感染部位前易被降解，或被人體的免疫系統(tǒng)識(shí)別清除，在臨床應(yīng)用中受到了阻礙。為了達(dá)到治療效果，往往需要服用更高劑量的藥物，不僅可能引起嚴(yán)重的副作用，也提高了治療成本。適配體作為識(shí)別元件，不具有細(xì)胞毒性、易于修飾，被廣泛應(yīng)用于抗菌藥物的遞送系統(tǒng)中。Yeom 等[58]設(shè)計(jì)了一種基于AuNPs-DNA 適配體的共軛遞送系統(tǒng)，先前的研究證明了該系統(tǒng)可以有效將重組蛋白遞送到哺乳動(dòng)物體內(nèi)，且不具有細(xì)胞毒性。該研究實(shí)現(xiàn)了抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）的有效遞送，抗菌肽是由生物體產(chǎn)生的活性分子，是先天免疫反應(yīng)的重要組成部分。AMP 可以與脂多糖和脂磷壁酸結(jié)合，破壞細(xì)胞膜，此外，AMP 帶有正電荷的氨基酸殘基可以與帶負(fù)電的細(xì)胞膜發(fā)生靜電相互作用，這一過(guò)程可能改變AMP 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)其抗菌效果。利用適配體修飾的AuNPs裝載靶向遞送AMP，與單獨(dú)注射AMP 相比，受鼠傷寒沙門氏菌感染的小鼠從只能存活5.1～5.7 d 提高至100%存活10 d 以上，表明靶向遞送發(fā)揮了更優(yōu)的治療效果。Liu 等[59]采用硬模板法合成空心氮化碳納米球。通過(guò)修飾適配體進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的選擇性消毒。在4 h 內(nèi)，幾乎所有鼠傷寒沙門氏菌都被HCNS-Cap-Apt 滅活，而金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌僅13.3%和48.2%細(xì)胞被分別殺死。因此，HCNS 是一個(gè)很有前景的基于適配體的熒光檢測(cè)和選擇性消毒鼠傷寒沙門氏菌的生物平臺(tái)。通過(guò)在基于HCNS 的藥物遞送系統(tǒng)上裝飾適配體作為識(shí)別模塊，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了選擇性抗菌功能。

4 小結(jié)與展望

本文總結(jié)沙門氏菌適配體的篩選策略，全面匯總能夠特異性識(shí)別沙門氏菌的適配體序列，為后續(xù)的研究應(yīng)用提供了有力工具；綜述了沙門氏菌適配體生物傳感器的研究進(jìn)展，全面闡述了沙門氏菌適配體在抑菌治療中的應(yīng)用。為了更好地發(fā)揮沙門氏菌的應(yīng)用價(jià)值，仍需從多方面進(jìn)行努力和突破。1）開發(fā)更高效、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化的適配體篩選平臺(tái)，進(jìn)一步豐富適配體種類。目前沙門氏菌適配體的篩選方法較為單一，以Cell-SELEX 為主，致使多數(shù)適配體與沙門氏菌之間的互作關(guān)系尚不明確。此外，雖然開發(fā)了特異性結(jié)合沙門氏菌鞭毛蛋白、外膜蛋白、脂多糖等靶標(biāo)的適配體，但諸如莢膜等結(jié)構(gòu)性毒力因子尚未篩選獲得適配體。未來(lái)可以在提高篩選效率的基礎(chǔ)上，獲得更加全面靶標(biāo)的適配體，以期能夠發(fā)揮抑菌減毒等作用。2）更精準(zhǔn)地探究適配體與沙門氏菌結(jié)合位點(diǎn)與結(jié)合方式，為進(jìn)一步的生物學(xué)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。明確沙門氏菌上能夠被適配體特異識(shí)別的位點(diǎn)對(duì)于研究適配體在抑制生物膜形成、降低內(nèi)毒素毒性等方面具有重要作用。但目前很少有對(duì)沙門氏菌的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行解析的研究。3）適配體是檢測(cè)和防御致病菌的適用工具，并可以成為臨床醫(yī)生有價(jià)值的抗感染治療工具。目前，沙門氏菌適配體主要是用于診斷檢測(cè)，在治療效用領(lǐng)域的研究還較少。未來(lái)可以通過(guò)納米顆粒、抗菌藥物與適配體聯(lián)用，為食源性致病菌的診治提供新的思路。