野生菌中鵝膏毒肽和鬼筆毒肽檢驗方法及樣品處理技術(shù)研究進展

譚建林，曾明梅，趙秀琳，趙小林，彭珍華，張雪媛，陳明瑤，王吉祥，牛之瑞，馬雪濤

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，國家熱帶農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心，昆明 650223）

我國野生菌資源豐富，相關(guān)研究共鑒定出1020種可食用、692 種藥用和480 種有毒野生菌[1]。許多有毒野生菌與可食用物種的外觀形態(tài)特征相似，人們不易對其進行區(qū)分，因誤食有毒野生菌而導(dǎo)致中毒的事件時有發(fā)生[2?6]。野生菌中毒是我國食源性疾病的主要原因，2019～2020 年，我國有記載的野生菌中毒總體病死率為1.89%，其中，急性肝毒性中毒的病死率為12.6%，占總死亡人數(shù)的78.7%[6?7]。我國野生菌中毒事件表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性，5～10月為高發(fā)，12～次年2月為低發(fā)。2004～2009年6～9月野生菌中毒事件在當(dāng)年所有野生菌中毒事件中占比達到84.88%；2010～2020 年5～10 月中毒事件在當(dāng)年所有中毒事件中占比達到94.1%。除西藏自治區(qū)外，中國其它31 個省/直轄市/自治區(qū)均有野生菌中毒事件，其中云南、湖南、貴州、四川和江西5個省占野生菌中毒事件的79.7%[6,8]。

目前普通民眾對于有毒野生菌的識別方法仍停留于形態(tài)學(xué)分類等粗略的識別方式。很多野生菌形態(tài)極為相似，難以分辨，利用外觀形態(tài)鑒別新鮮野生菌尚有一定的可能性，但無法用于鑒別經(jīng)過干燥包裝成商品的野生菌。野生菌中毒事件嚴(yán)重危害人們的生命和健康安全，制約著野生菌產(chǎn)業(yè)的升級和發(fā)展。野生菌中毒具有發(fā)病快、臨床表現(xiàn)多樣等特點，而且目前治療手段單一，療效不理想，因此野生菌中毒后及時進行毒素檢測，對中毒事者的治療能起到關(guān)鍵的作用。隨著通用檢測技術(shù)的發(fā)展，蘑菇毒素的檢測技術(shù)也在不斷的推陳出新，出現(xiàn)了一些成本低、快速的檢測方法，為防范野生菌中毒以及野生菌中毒患者的治療提供了可靠的技術(shù)支撐。

1 鵝膏毒肽和鬼筆毒肽的中毒機理

目前，約90%野生菌中毒死亡由誤食鵝膏肽類毒素的鵝膏菌引起[9?10]，引起急性肝毒性中毒的致命蘑菇毒素主要為鵝膏毒肽和鬼筆毒肽等環(huán)狀多肽類毒素，其中，鵝膏毒肽是一類雙環(huán)八肽，化學(xué)結(jié)構(gòu)及化學(xué)信息見圖1a 和表1[11]，鵝膏毒肽主要包括α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽；鬼筆毒肽為雙環(huán)七肽，化學(xué)結(jié)構(gòu)及化學(xué)信息見圖1b和表2[11]，主要包括羧基二羥基鬼筆毒肽、羧基三羥基鬼筆毒肽和二羥基鬼筆毒肽[12?13]。上述毒素毒性最強的是α-鵝膏毒肽，對人的半數(shù)致死量(LD50)為0.1 mg/kg[14]。該類毒肽毒耐高溫、干燥和酸堿環(huán)境，一般的烹飪加工不會破壞其毒性，不幸誤食后，毒肽會通過消化系統(tǒng)進入肝臟，對肝臟造成難以修復(fù)的損傷，最終可能引發(fā)多器官功能衰竭死亡[15]。鵝膏毒肽的作用機理是通過結(jié)合和抑制肝細胞中的真核RNA 聚合酶II 來干擾DNA 轉(zhuǎn)錄。抑制mRNA 合成會通過抑制蛋白質(zhì)合成導(dǎo)致細胞壞死，從而導(dǎo)致肝衰竭和腎損傷。鬼筆毒肽可專一性與纖維狀肌動蛋白絲結(jié)合，形成穩(wěn)定的絲狀肌動蛋白毒肽復(fù)合物，破壞微絲的聚合和解聚的動態(tài)平衡；也能使肝臟重量急劇增加，體積增大，幾乎占體腔體積的一半，晚期肝臟較硬[16]。

表1 鵝膏毒肽類化學(xué)信息

表2 鬼筆毒肽類化學(xué)信息

圖1 鵝膏毒肽類和鬼筆毒肽類蘑菇毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 鵝膏毒肽和鬼筆毒肽檢測樣品處理技術(shù)

2.1 蛋白沉淀法

蛋白沉淀法是毒素檢測分析過程中對生物樣品進行前處理的一種常用凈化方式，對于富含蛋白質(zhì)的樣品，在進行分離和提取時將大量干擾檢測的蛋白質(zhì)進行沉淀除去，使待測毒素仍留存于提取溶液。張秀堯等[17]比較了乙腈、甲醇和丙酮作為蛋白沉淀劑的效果，乙腈沉淀效果最好，蛋白沉淀完全，易于離心和分離，并在乙腈中加入乙酸可以提高β-鵝膏毒肽的回收率。該方法適用于尿液和血漿中3種鵝膏毒肽和2種鬼筆毒肽的確證分析。

2.2 固相萃取技術(shù)

固相萃取(SPE)技術(shù)是利用固體吸附劑將樣品提取液中的目標(biāo)化合物吸附，與提取液中的基體和干擾物等分離，再用洗脫液進行洗脫或加熱解吸附，達到雜質(zhì)分離和目標(biāo)化合物富集的目的。固相萃取作為檢測的前處理技術(shù)，由于其成本低、效果好等特點，在化學(xué)檢測中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。BJS 202008[18]采用親水-親油平衡(HLB)固相萃取技術(shù)對樣品提取液進行凈化，測定蘑菇中3 種鵝膏毒肽和3 種鬼筆毒肽，這也是目前我國檢測機構(gòu)普遍使用的蘑菇毒素檢測方法。ZHANG S 等[19]首次使用PRiME HLB的樣品處理技術(shù)，用于血液中3種鵝膏毒肽和2種鬼筆毒肽的檢測分析。并比較了WAX、WCX、HLB和PRiME HLB四種固相萃取技術(shù)，HLB和PRiME HLB 都能達到令人滿意的回收率，但是，對于血液樣本來說，PRiME HLB 可以去除基質(zhì)中90%以上的賴氨酸甘油磷酸膽堿，如果采用96位的孔板，效率和成本控制可以得到很大的提升，同時也能降低血液樣本的基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 在線凈化技術(shù)

常規(guī)固相萃取凈化法存在溶劑使用量大、使用成本高等缺陷。在線凈化通過擴散溶解和尺寸排阻等技術(shù)可以將蛋白質(zhì)等生物大分子去除，保留小分子化合物；利用串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，可極大簡化樣品處理步驟，在實現(xiàn)在線凈化的同時，可保證檢測方法的準(zhǔn)確度和靈敏度[20]。徐小民等[21]和方力[22]基于在線固相萃取的精準(zhǔn)凈化技術(shù)，研究尿液中痕量α-鵝膏毒肽檢測時基質(zhì)效應(yīng)的消除方法，建立了尿液中痕量α-鵝膏毒肽的在線SPE-LC-MS/MS檢測技術(shù)，以解決野生菌中毒患者生化指標(biāo)異常前72 h (甚至96 h)內(nèi)毒素鑒定難的問題，為野生菌中毒患者的早診斷、早治療，有效降低患者死亡率提供檢測技術(shù)支撐。

2.4 免疫親和技術(shù)

免疫親和技術(shù)(IAC)是一種利用抗原和抗體特異性可逆結(jié)合特性的SPE 技術(shù)，利用抗原抗體的高選擇性，可以從復(fù)雜樣品中選擇并富集目標(biāo)化合物。普通的固相萃取均為非特異性的凈化方法，選擇性和去除干擾物的效果不好，而生物樣品成分非常復(fù)雜，樣品中基質(zhì)成分會影響檢測方法的準(zhǔn)確性。張秀堯等[23]采用鵝膏毒肽免疫親和技術(shù)對尿液和血漿樣品進行凈化，該技術(shù)對α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽的平均吸附率分別為83.6%、89.6%和86.4%，且對羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽的平均吸附率均為0，說明免疫親和柱的特異性吸附較強。該方法3種鵝膏毒肽的檢出限和定量限分別為0.004、0.01 ng/mL，方法的靈敏度比其它方法有了10倍以上的提升。

3 鵝膏毒肽和鬼筆毒肽檢測技術(shù)進展

3.1 快速檢測法

傳統(tǒng)的檢測方法耗時久，在實際應(yīng)用中會受到一定限制?？鞕z方法作為傳統(tǒng)檢測方法的補充，在食品安全檢測中可以起到基本保障的作用，在基層實驗室或現(xiàn)場檢測中發(fā)揮著重要的作用。蘑菇毒素的檢測一般采用儀器法，但該類方法存在檢測時間長、操作繁瑣以及儀器昂貴等問題，其應(yīng)用受到限制。Bever 等[24]報道了新型單克隆抗體(mAbs、AMA9G3 和AMA9C12)的產(chǎn)生以及競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗(cELISA)的開發(fā)，簡化了蘑菇樣品的提取程序，基于mAbs的cELISA可以簡單而快速檢測蘑菇樣品的鵝膏毒肽。劉河冰等[25]成功合成了α-鵝膏毒肽半抗原，制備了α-鵝膏毒肽單克隆抗體，建立了一種檢測蘑菇中鵝膏毒肽的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附方法，該方法的50% 抑制濃度(IC50)為2.8 μg/kg，檢出限為0.88 μg/kg。

3.2 毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)法

CE-MS聯(lián)用技術(shù)是20世紀(jì)90年代末期發(fā)展起來的一種將毛細管電泳的高分辨率和質(zhì)譜的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù)。Rittgen等[26]開發(fā)了一種CE方法，可以對3種鵝膏毒肽和2種鬼筆毒肽進行有效分離，在正離子模式和負離子模式下，研究了它們在MSn實驗中的碎裂模式和所用接口的鞘液混合物對信噪比的影響，經(jīng)過優(yōu)化方法和方法驗證，檢出限為13～79 ng/mL(17～87 nmol/L)。

3.3 高效液相色譜(HPLC)法

HPLC法廣泛應(yīng)用于毒素的檢測分析。張秀堯等[27]用立超高效液相色譜-二極管陣列檢測法分離檢測蘑菇中3種鵝膏毒肽和2種鬼筆毒肽，流動相為10 mmol/L乙酸銨水溶液和乙腈，梯度洗脫，二極管陣列檢測器波長為210～400 nm，方法準(zhǔn)確、靈敏、選擇性強。鐘加菊等[28]采用反相高效液相色譜法對采自云南楚雄雙柏縣的致命鵝膏菌在3個不同生長期中不同部位的6種環(huán)肽毒素含量進行了檢測和分析。生長期毒素總量最高(9.3 mg/g)，從成熟期(7.5 mg/g)到衰老期(6.5 mg/g)逐漸降低，但鬼筆毒肽(羧基三羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽)的相對含量隨著年齡增長而逐漸增加，鵝膏毒肽(α-，β-鵝膏毒肽)與鬼筆毒肽比值從生長期、成熟期到衰老期分別為2.6 mg/g、1.4 mg/g和0.9 mg/g。

3.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法

3.4.1 液相色譜-離子阱質(zhì)譜(LC-IT-MS)法

離子阱質(zhì)譜(IT-MS)利用高電場使質(zhì)譜進樣端的毛細管柱流出的液滴帶電，使分析物離子化并以帶單電荷或多電荷的離子形式進入質(zhì)量分析器，可實現(xiàn)多級質(zhì)譜MSn。該技術(shù)最早主要應(yīng)用在代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)的研究，也適用于鵝膏毒素的測定，如Filigenzi 等[29]采用液相色譜-多級線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用(LC-IT-MSn)法對中毒后人和動物的血清和肝臟蕈菌毒素進行定性與定量分析，以MS/MS/MS模式測定血清和肝臟中α-鵝膏毒肽的含量，方法的檢出限為0.5 ng/g，首次對人和動物中毒患者血清和肝臟中α-鵝膏素進行陽性質(zhì)譜鑒定并作出定量研究報告。

3.4.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法

液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜是一種先進的分析技術(shù)，液相色譜的分離能力能使樣本中復(fù)雜的基質(zhì)組分得到分離，利用三重四極桿質(zhì)譜的靈敏度高和特異性強的質(zhì)量分析能力能對樣本中目標(biāo)物進行準(zhǔn)確的定性及定量分析。趙麗等[30]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定蘑菇中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽等5種毒肽的含量，檢出限為0.100～0.300 mg/kg。郎樂等[31]建立了LC-MS/MS法測定野生菌中6中鵝膏肽類毒素的含量，采用固相萃取柱凈化和多反應(yīng)監(jiān)測模式監(jiān)測，檢出限達到20 μg/kg，方法靈敏度高，重復(fù)性好。周貽兵等[32]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對人血漿中6種蘑菇毒肽進行檢測，6種蘑菇毒肽的線性范圍均在3.12～125 μg/L，測定下限為2.0～5.0 μg/L。Abbott[33]首次采用同位素標(biāo)記的15N10-α-鵝膏毒肽作為內(nèi)標(biāo)，開發(fā)了一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法來檢測尿液中的α-鵝膏毒素、β-鵝膏毒素和γ-鵝膏毒素，采用內(nèi)標(biāo)定量的α-鵝膏毒素測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于5.49%，回收率為100%～106%。

3.4.3 液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(LC-QTOF-MS)法

柳潔等[34?35]建立了血清和尿液中α-鵝膏毒肽，β-鵝膏毒肽，二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽毒素的超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，以及基于超高效液相色譜-電噴霧離子化-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-ESI-Q-TOF)的4種鵝膏肽類毒素特征信息的色譜和質(zhì)譜指紋圖譜和分析鑒定方法。UPLC-ESI-Q-TOF 可以準(zhǔn)確測定鵝膏肽類蘑菇毒素的分子離子及其同位素的質(zhì)量數(shù)和豐度比，與二級質(zhì)譜的分子結(jié)構(gòu)碰撞裂解特征比較分析，在對樣本中未知化合物的鑒定比常規(guī)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)更為精準(zhǔn)和可靠，而且有較好的靈敏度，兩種方法目標(biāo)毒肽的檢出限為5～10 ng/mL。血清樣品采用乙腈沉淀蛋白，野生菌樣本使用OasisHLB固相柱進行凈化，方法簡便，準(zhǔn)確，可靠，利用色譜技術(shù)和質(zhì)譜指紋圖譜能夠鑒定化合物的結(jié)構(gòu)特性，進行定性分析，也能使用離子對進行準(zhǔn)確的定量，在突發(fā)事件中毒檢測鑒定中能夠發(fā)揮重要的作用。

4 總結(jié)與展望

目前，約90%野生菌中毒死亡由誤食鵝膏肽類毒素的鵝膏菌引起，由于野生菌樣本、尿液和血漿等基質(zhì)復(fù)雜，越來越多的樣品處理技術(shù)被應(yīng)用，同時檢測方法也呈多樣化發(fā)展趨勢。隨著科學(xué)技術(shù)的進步，檢測儀器和檢測技術(shù)的不斷革新，鵝膏毒肽蘑菇毒素的檢測前處理技術(shù)不斷簡化，檢測方法靈敏度、穩(wěn)定性和精密度不斷提高，檢驗所需時間不斷縮短。目前的方法都是針對一種或者兩種樣本，無法覆蓋所有的樣本基質(zhì)。此外，目前的方法存在儀器和耗材昂貴、檢測時間長以及操作繁瑣等問題，限制著其應(yīng)用，無法實現(xiàn)在初級實驗室、超市、農(nóng)貿(mào)市場、酒店、餐館等場所都可進行鵝膏毒肽蘑菇毒素的現(xiàn)場檢測。因此，在關(guān)注大型儀器方法不斷精準(zhǔn)的同時，更加需要簡便、準(zhǔn)確的現(xiàn)場檢測方法，彌補目前蘑菇毒素快速檢測方法的空缺，促進我國食品監(jiān)管機構(gòu)對于蘑菇及其制品中鵝膏毒肽類蘑菇毒素的監(jiān)管。同時，蘑菇生產(chǎn)企業(yè)或從業(yè)人員也能應(yīng)用快速檢測方法保證產(chǎn)品的質(zhì)量安全，普通消費者亦能利用自檢保障所采購的蘑菇或蘑菇制品的安全性，為消費者的生命安全保駕護航，有助于防范該類食品安全問題。