離子色譜HPAEC-PAD法測定楊樹細胞壁非纖維素單糖組分

金小玲 吳慧敏 楊潮鋒 張 進 盧孟柱 曾 為

（浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，亞熱帶森林培育國家重點實驗室，杭州 311300）

離子交換色譜-脈沖安培檢測法（HPAECPAD）是目前檢測單糖的主要分析方式之一［1］，單糖的電化學(xué)活性以及在強堿中呈離子化狀態(tài)特征，使其較好保留在離子色譜柱上，無需衍生即可被離子型檢測器識別及準(zhǔn)確測定［2-3］，因此建立一次進樣測定植物細胞壁中9 種單糖的研究方法具有重要意義。

楊樹（Populus）作為一種世界廣泛分布的木本植物［4］，有生長迅速、容易擴繁、基因組測序完成、容易轉(zhuǎn)化等特征，被用于木本植物研究的模式植物。我國楊樹人工林面積已達757 萬hm2，位居世界第一［5］。作為速生豐產(chǎn)、應(yīng)用廣泛的樹種，楊樹在城市綠化、防風(fēng)固沙和工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著不可替代的巨大作用［6］。木材的主要結(jié)構(gòu)是樹木的次生細胞壁。植物細胞壁是植物細胞外富含多糖的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，是細胞的第一道屏障，在提供機械支撐、維持細胞形狀、控制細胞生長、調(diào)節(jié)物質(zhì)運輸和信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用［7］。植物細胞的初生壁主要由多糖（纖維素、半纖維素和果膠）以及少量的糖蛋白組成，多糖占到了植物細胞壁的70%以上［8］。非纖維素多糖很大程度決定了細胞壁的理化性質(zhì)，對于植物生長發(fā)育至關(guān)重要，而快速分析非纖維素細胞壁多糖也成為植物較為關(guān)鍵的研究之一。目前，檢測植物中的單糖方法包括氣相色譜、液相色譜、離子色譜等方法。但氣相色譜法需要對樣品進行衍生，操作復(fù)雜，且容易產(chǎn)生副衍生物而造成多峰、重疊峰等現(xiàn)象，造成定量不準(zhǔn)確且衍生化的程度不完全使得檢測準(zhǔn)確性差、重現(xiàn)性差［9］。液相色譜則需要將單糖衍生為具有紫外或者熒光吸收的物質(zhì)［10］。衍生過程操作繁瑣，結(jié)果誤差較大。靈敏度低，如果樣品中單糖的含量不高，樣品的雜質(zhì)可能會掩蓋單糖的峰［11］，因此液相色譜也難以滿足實際需求。本研究采用離子色譜脈沖積分安培檢測法，檢測5種不同的楊樹細胞壁中非纖維素的單糖組成，以期為植物細胞壁功能基因組和糖生物學(xué)相關(guān)研究提供高效、可靠的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Dionex-ICS-6000+型離子色譜，安培檢測器，Au 工作電極，pH-Ag/AgCl 復(fù)合參比電極，Chromeleon 7 色譜工作站，AS-AP 自動進樣器，CarboPac?（4 mm×50 mm），Dionex CarboPac? PA100（4 mm×250 mm），默 克MilliQ 超 純 水 機，德 國Retsch MM400 混合型碾磨儀，50%NaOH 液體購自美國Thermo Fisher 公司，巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和α-淀粉酶購自Sigma-Aldrich 公司，無水乙醇購自上海滬試，三氟乙酸購自麥克林公司。

1.2 材料的選擇

5種代表性楊樹：84K楊（Populus alba×P.glandulosa）、山新楊（P.davidiana×P.bolleana）、銀中楊（P.alba×P.berolinensis）、717 楊（P.tremula×P.alba）、南林895楊（P.deltoides×P.euramericana）材料來自浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室林木木材品質(zhì)研究團隊，南林895楊為南方種植樹種，山新楊、銀中楊、84K 楊為北方種植樹種，717楊常用于功能基因組研究，均由組培苗擴繁而來。楊樹幼苗培養(yǎng)條件為16 h/8 h（光照/黑暗），溫度25 ℃，不同種類的楊樹在同一時間和相同培養(yǎng)條件下進行擴繁，組培苗一般在Murashige-Skoog（MS）培養(yǎng)基中生長2 個月左右轉(zhuǎn)移至土培，然后取莖段用于細胞壁單糖分析。

1.3 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別配制巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的儲備液，4 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)混合溶液：分別用超純水配制9種單糖系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，巖藻糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖醛酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg·L-1，葡萄糖混合系列質(zhì)量濃度為2、5、10、12、15 mg·L-1，半乳糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列質(zhì)量濃度為5、10、15、20、30 mg·L-1，木糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列質(zhì)量濃度為10、15、20、25、40 mg·L-1，阿拉伯糖混合標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25 mg·L-1，半乳糖醛酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列質(zhì)量濃度為40、60、80、100、150 mg·L-1。

1.4 色譜條件及淋洗液的選擇

由于中性糖和糖醛酸在色譜柱中的保留強弱不同，采用梯度淋洗的方式洗脫。巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖，這7種中性糖保留性較弱且保留時間相似，試驗開始時選擇較低質(zhì)量濃度的淋洗液進行洗脫。由于半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的保留性較強，因此將淋洗液的質(zhì)量濃度提高，增強洗脫能力，最后的最佳淋 洗 程 序 為0～24.00 min 2 mmol·L-1NaOH 淋 洗液，24.01～40.00 min 450 mmol·L-1NaOH 淋洗液。在該淋洗條件下7 種中性糖和2 種糖醛酸一次進樣均可得到基線分離。圖1 為9 種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。9 種單糖質(zhì)量濃度均為5 mg·L-1，流動相為NaOH，流速為1.00 mL·min-1，安培檢測器檢測，進樣量25 μL。淋洗梯度程序為0～24.00 min 2 mmol·L-1NaOH 淋 洗 液，24.01～40.00 min 450 mmol·L-1NaOH淋洗液。

圖1 9種不同單糖的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖1.巖藻糖；2.鼠李糖；3.阿拉伯糖；4.半乳糖；5.葡萄糖；6.木糖；7.甘露糖；8.半乳糖醛酸；9.葡萄糖醛酸Fig.1 Standard chromatograms of 9 different monosaccharides 1.Fucose；2.Rhamnose；3.Arabinose；4.Galactose；5.Glucose；6.Xylose；7.Mannose；8.Galacturonic acid；9.Glucuronic acid

1.5 樣品的前處理

分別取84K 楊、南林895 楊、山新楊、銀中楊、717 楊的莖段，置于烘箱中121 ℃殺青30 min，50 ℃烘干至恒質(zhì)量，利用球磨儀機械性粉碎后過425 μm 目篩［12］。80%乙醇洗滌3 次至樣品變?yōu)榧兩?，丙酮洗? 次，去上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除多余丙酮，所得產(chǎn)物為不溶于醇物（AIR）。將AIR 懸浮于50 mmol·L-1pH=5.2乙酸鈉中，加入α-淀粉酶（15 unit）于40 ℃酶解12 h 以去除淀粉［13］。加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇，-20 ℃沉淀2 h以上。4 ℃，13 000×g，離心5 min，去上清，斜置干燥。加入2 mL 2 mol·L-1三氟乙酸于烘箱中120 ℃水解90 min，氮氣吹干。加入500 μL 超純水，過0.45 μm 微孔濾膜，迅速上機進樣。

1.6 數(shù)據(jù)處理

依次按照1.4 中的色譜條件進行分析，并進行線性關(guān)系、精密度、檢出限和定量限的考察，每個質(zhì)量濃度樣品分別測定3 次，取3 次所得峰面積的平均值，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，物質(zhì)質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)建立9種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，另外分別取各表現(xiàn)的最低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進樣6 次測定峰面積，計算RSD，并以3倍基線噪音（S/N=3）計算得到檢出限，標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系、精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

楊樹細胞壁單糖組分包括多種中性糖和糖醛酸，采用PA20 或PA100 進行分離，通過試驗分析可知，PA100在分離鼠李糖和阿拉伯糖2種中性糖的分離效果較優(yōu)于PA20 分離柱，同時其他7 種中性糖均可達到基線分離的效果。因此采用PA100分析柱作為分離柱。

2.1.2 柱溫的選擇

由于柱溫會影響色譜柱的分離效果，試驗分別考察20、25、30、35、40 ℃在內(nèi)的5 個不同柱溫，對9種單糖分離的影響。試驗結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為30 ℃時，色譜峰達到最理想的分離效果（見圖2）。

圖2 9種單糖在不同柱溫下的分離色譜圖A.20 ℃；B.25 ℃；C.30 ℃；D.35 ℃；E.40 ℃Fig.2 Separation chromatograms of 9 monosaccharides at different column temperatures A.20 ℃；B.25 ℃；C.30 ℃；D.35 ℃；E.40 ℃

2.1.3 淋洗液濃度的選擇

由于7 種中性糖的保留性較弱且保留時間相似，試驗采用低濃度的淋洗液進行洗脫，因此考察淋洗液NaOH 濃度分別為2、5、8、10 mmol·L-1，對7 種中性糖分離的影響，試驗結(jié)果表明，淋洗液濃度為2 mmol·L-1時，7 種中性糖均達到基線分離（見圖3）。

圖3 7種中性糖在不同淋洗液濃度下的分離色譜圖A.2 mmol·L-1；B.5 mmol·L-1；C.8 mmol·L-1；D.10 mmol·L-1Fig.3 Separation chromatograms of 7 neutral sugars under different eluent concentrations A.2 mmol·L-1；B.5 mmol·L-1；C.8 mmol·L-1；D.10 mmol·L-1

2.2 方法學(xué)研究

分別對9 種單糖的線性關(guān)系、檢出限、重現(xiàn)性及保留時間進行分析，結(jié)果如表1 所示，相關(guān)系 數(shù) 為0.999 0～0.999 3，最 低 檢 出 限1.57×10-3～1.41×10-2mg·L-1，重現(xiàn)性為1.09%～3.96%。表明9種單糖中相關(guān)系數(shù)及重現(xiàn)性良好，最低檢出限符合試驗需求。

表1 9種單糖線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限及重現(xiàn)性Table 1 Regression equations correlation，linear，limits of detection（LOD），quantification limits（LOQ）and reproducibility（RSD）of IC determination of 9 monosaccharides

2.3 加標(biāo)回收率及其標(biāo)準(zhǔn)偏差

選擇5 種楊樹中的南林895 進行加標(biāo)回收率的測定，驗證方法的可行性。加標(biāo)試驗結(jié)果見表2，南林895 楊細胞壁中9 種單糖均被檢出，同時通過加標(biāo)回收率在91.32%～109.25%，重現(xiàn)性在1.69%～4.86%，表明該方法重現(xiàn)性、加標(biāo)回收率滿足基本實驗要求。

表2 南林895楊加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 recovery and relative standard deviation of Nanlin 895 poplar sample spike

2.4 5種楊樹細胞壁中單糖含量

5 種不同楊細胞樹壁中9 種單糖含量測定結(jié)果如表3 所示，結(jié)果表明，5種不同楊樹細胞壁中9種單糖均被檢測出，但不同楊樹細胞壁中單糖含量具有一定差異。

表3 5種不同楊樹細胞壁中9種單糖含量Table 3 Contents of 9 monosaccharides in 5 different poplar cell walls

2.5 5種不同楊樹細胞壁中單糖含量的分析

試驗數(shù)據(jù)表明，5種楊樹細胞壁單糖主要為巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，其中半乳糖醛酸占比最高，木糖次之，葡萄糖醛酸占比最少（見表4）。

表4 5種不同楊樹中9種單糖含量占總糖的相對比例Table 4 The proportion of 9 monosaccharides in 5 different poplars

3 討論

植物細胞壁一般分為初生壁和次生壁2類［14］，不同組織和種類的細胞壁多糖組成差別很大。而本試驗取材為生長約2個月的組培苗莖段，正處于初生壁階段向次生壁轉(zhuǎn)化的階段，此時莖段的樹皮和髓部以初生細胞壁為主。雙子葉植物楊樹初生壁多糖的主要成分為纖維素、木葡聚糖和果膠，果膠包括同型半乳糖醛酸聚糖（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ（RGI）和鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ（RGII），主要成分HG 由多個α-1，4 半乳糖醛酸殘基連接形成的線性聚糖，占果膠的65%左右［15-16］，由此推測這是半乳糖醛酸含量占比最高的原因之一。植物在生長過程初生生長結(jié)束以后，莖段逐漸木質(zhì)化形成次生細胞壁。木聚糖是莖段次生壁主要的半纖維素［17］。木糖含量僅次之的部分原因是莖段木質(zhì)部中含有較多的木聚糖，另外初生壁細胞中木葡聚糖也含有木糖［18］。細胞壁中的纖維素高度結(jié)晶化，不能被2M 三氟乙酸水解，因此樣品中的葡萄糖單糖占比不高，不能反映出纖維素的含量。阿拉伯糖和半乳糖是RGI 和阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGP 的主要組成成分），所以細胞壁中單糖組分占據(jù)一定比例。甘露聚糖主要存在于裸子植物細胞壁中，而楊樹是被子植物，因此甘露糖在楊樹細胞壁中占比較低。巖藻糖和鼠李糖存在于木葡聚糖、AGP、RGII 的末端［19］，在單糖分析中占比較低。葡萄糖醛酸主要存在于木聚糖的側(cè)鏈中且高度甲基化，在圖4 中可見，葡萄糖醛酸之前的峰（約34 min）可能為甲基化的葡萄糖醛酸，為造成葡萄糖醛酸檢測較低的部分原因。由于缺乏甲基化葡萄糖醛酸標(biāo)樣，今后的研究中可以進一步改進分析方法。

圖4 樣品色譜圖A.84K 楊；B.銀中楊；1.巖藻糖；2.鼠李糖；3.阿拉伯糖；4.半乳糖；5.葡萄糖；6.木糖；7.甘露糖；8.半乳糖醛酸；9.葡萄糖醛酸Fig.4 Chromatogram of sample A.Populus alba×P. glandulosa 84K poplar；B.Populus alba×P. berolinensis；1.L-fucose；2.L-rhamnose；3.L-arabinose；4.D-galactose；5.Dglucose；6.D-xylose；7.D-mannose；8.D-galacturonic acid；9.D-glucuronic acid

4 結(jié)論

為測定楊樹細胞壁中的單糖組成，本研究建立了離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定7種中性糖（巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖）和2 種酸性糖（半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸）的方法。該方法通過使用NaOH的單一淋洗液就能實現(xiàn)9 種單糖在40 min 之內(nèi)達到基線分離的效果，同時前處理簡單且無需任何衍生化處理。檢測限為1.57×10-3～1.41×10-2mg·L-1，樣品加標(biāo)回收率在91.32%～109.25%，達到離子色譜加標(biāo)回收率80%～120%的要求。本方法將為進一步研究細胞壁非纖維素多糖建立基礎(chǔ)，并為其他木本植物細胞壁糖生物學(xué)研究利用提供參考。