細(xì)葉百合Catalase基因的克隆及表達(dá)分析

宋 煜 林文昊 荊一博 董 懿 金淑梅

（1.東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)奧林學(xué)院，哈爾濱150040；3.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

在鹽堿等逆境脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生H2O2，而過量的H2O2導(dǎo)致蛋白質(zhì)、膜脂、DNA等細(xì)胞組分受到嚴(yán)重的損傷，從而對植物產(chǎn)生很強(qiáng)的毒害作用［1-2］，植物中抗氧化防御體系主要由抗氧化酶組成。其中，過氧化氫酶是抗氧化酶中首先被發(fā)現(xiàn)的，Loew［3］將其命名為Catalase（CAT），Sumner 等［4］從牛肝中首次純化并結(jié)晶得到純度較高的過氧化氫酶。CAT 主要作用是清除脅迫中產(chǎn)生的過量過氧化氫，避免植物的過氧化損傷，在逆境條件下維持植物體的氧化平衡［5-8］，在植物中編碼過氧化氫酶CATs 基因家族是一類成員較少的基因家族，并在不同的物種中已有報(bào)道，洋蔥（Allium cepa）耐鹽品種比敏鹽品種積累較高的CAT基因轉(zhuǎn)錄水平［9］，Gondim 等［8］發(fā)現(xiàn)，用H2O2噴霧進(jìn)行預(yù)處理，H2O2誘導(dǎo)CAT 活性提高，從而降低鹽堿對玉米（Zea mays）幼苗生長的有害影響。Nagamiya 等［10］將大腸桿菌（Escherichia coli）的過氧化氫酶基因在水稻（Oryza sativa）中過表達(dá)，有效增強(qiáng)了水稻耐鹽堿性。Mittova 等［11］研究表明，鹽堿脅迫下耐鹽番茄（Lycopersicon pennellii）根部的線粒體中CAT的含量及活性大幅升高。因此作為H2O2清除劑的CAT在植物中起著非常重要的作用。

細(xì)葉百合（Lilium pumilum）花朵綺麗，花色鮮紅，具有抗鹽堿的特性具有很高的園林應(yīng)用價(jià)值。我國東北地區(qū)土地鹽堿化的問題日益嚴(yán)重，在一定程度上限制了植物的廣泛種植與應(yīng)用，對細(xì)葉百合中CAT基因在植物抗鹽堿功能上的研究，有助于提高商業(yè)百合的應(yīng)用價(jià)值。本研究以細(xì)葉百合為研究對象，克隆細(xì)葉百合與抗逆性有關(guān)的基因CAT，對其進(jìn)行同源序列比對及進(jìn)化樹分析，檢測其在不同逆境處理下的表達(dá)特性，表達(dá)純化其蛋白，并進(jìn)一步構(gòu)建LpCat過表達(dá)基因煙草，研究其在鹽堿脅迫下的表達(dá)情況和發(fā)揮的生物學(xué)功能，不僅能為培育耐鹽堿的新品種百合提供可利用的基因資源，還能在一定程度上為改善部分地區(qū)的土地鹽堿化問題提供研究方向。

1 材料與方法

植物材料細(xì)葉百合采自松嫩鹽堿草地安達(dá)野外試驗(yàn)站（44°45′N，123°45′E）。采摘后的植株利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行植物組織的快繁，產(chǎn)成組培苗，作為試驗(yàn)材料。本氏煙草（Nicotiana plumbaginifolia）為東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存材料。

1.1 Catalase基因開放閱讀框的克隆

利用植物提取試劑盒（TaKaRa 公司，北京，中國）提取細(xì)葉百合葉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司，北京，中國）對其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得細(xì)葉百合的cDNA，以細(xì)葉百合的cDNA為模板，根據(jù)細(xì)葉百合的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫序列，設(shè)計(jì)出1對特異性的上、下 游 引 物（上 游 引 物CatalaseF：5′-ATGGATCCCTACAAGTAC-3′，下 游 引 物CatalaseR：5′-TCACATGCTCGGCTTCAC-3′），進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的大小正確后，利用膠回收試劑盒（康為世紀(jì)公司，泰州，中國）回收目的片段。膠回收的目的片段與pMD18-T 載體在16 ℃過夜進(jìn)行連接后，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取長勢良好的陽性單克隆菌落，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行鑒定，測序，命名為LpCat（L.pumilumCatalase）。

1.2 同源序列比對及進(jìn)化樹分析

測序結(jié)果在NCBI 官網(wǎng)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查詢出對應(yīng)基因的ORF 區(qū)，利用NCBI官網(wǎng)上的BLAST 功能對獲得的氨基酸序列進(jìn)行分析，得到具有高相似度的其他物種Catalase 氨基酸序列，使用軟件DNAMAN 8進(jìn)行Catalase蛋白的同源氨基酸序列比對與分析。借助MEGA 7 軟件構(gòu)建細(xì)葉百合Catalase 蛋白與其同源蛋白的進(jìn)化樹，觀察LpCat蛋白與其他物種Catalase蛋白的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

1.3 LpCAT 基因在逆境處理后細(xì)葉百合的表達(dá)特性

將利用鱗片作為外植體生長6 個(gè)月的狀態(tài)良好、長勢一致的細(xì)葉百合組培苗移入到1/2 MS 培養(yǎng)基（對照組）和分別含有 20 mmol·L-1NaHCO3和11 mmol·L-1H2O2的1/2 MS 培養(yǎng)基（各處理組），分別脅迫處理6、12、24、36、48 h。利用Trizol 法提取各處理的細(xì)葉百合葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 為模 板，利 用qPCRCATF：5′-CTATTCCCCCTCGCGTTCTC-3′ 和 qPCRCATR：5′-AGCTTCTGACCGAGAGACCT-3′兩對引物，Ultra SYBR mixture 熒光染料對CAT基因的表達(dá)量進(jìn)行qPCR 檢測：反應(yīng)體系為20 μL（2×SYBR Green Mix 10.0 μL；10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL；cDNA 模板1.0 μL；ddH2O 8.0 μL）；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。進(jìn)qPCR 檢測LpCat基因在鹽堿脅迫及氧化脅迫的表達(dá)量變化。細(xì) 葉 百 合 內(nèi) 參 基 因 擴(kuò) 增 引 物［12］Lpactin F：5′-GCATCACACACCTTCTACAACG-3′和Lpactin R：5′-GAAGAGCATAACCCTCATAGA-3′。每 個(gè) 樣 品重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析其相對表達(dá)量。

1.4 細(xì)葉百合中CAT基因的蛋白表達(dá)與純化

細(xì)葉百合中LpCat基因的蛋白表達(dá)：在CAT基因ORF 區(qū)的上游加上BamH I，下游加上Xhol Ⅰ酶切位點(diǎn)（CAT BamHⅠ F：5′-ggatcCATGGGTGACCTTGCAGT-3′，CAT XholⅠ R：5′-gtcgacTTACAGATCAAAGCTGT-3′），結(jié)合到pQE-30 蛋白表達(dá)載體BamHⅠ和XholⅠ的酶切位點(diǎn)之間，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌蛋白表達(dá)菌株M15 進(jìn)行蛋白的表達(dá)與純化。菌液在37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)至OD600=0.5，加入1 mmol·L-1IPTG 蛋白誘導(dǎo)劑后培養(yǎng)不同時(shí)間（0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h），培養(yǎng)后的菌液經(jīng)13 000 r·min-1瞬時(shí)離心，沉淀用200 μL PBS 緩沖液重懸，30 Hz 超聲，9 s 使細(xì)胞裂解破碎后，20 μL 樣品溶液加20 μL 2×Loading Buffer 緩沖液混勻，煮沸10 min，冰 浴 放 置5 min。4 ℃，13 000 r·min-1，1 min 取20 μL 上清液進(jìn)行12% SDS-PAGE 蛋白質(zhì)電泳，電泳結(jié)束后經(jīng)染色、脫色至凝膠透明。

細(xì)葉百合中LpCat蛋白純化：在純化柱中添加Ni-NTA agarose 純化樹脂，用無菌去離子水清洗。分別在pQE-LpCat的蛋白上清液中加入10 mmol·L-1咪唑，再倒入純化柱中，置于冰上搖晃充分結(jié)合1 h，過濾后保存為復(fù)性蛋白。加入2 mL 蛋白清洗緩沖液，充分混勻后過濾保存純化蛋白加入1 mL 蛋白洗脫緩沖液，充分混勻后過濾保存，重復(fù)一次。將以上pQE-CAT的復(fù)性蛋白、2 次清洗過濾液、2次洗脫過濾液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測純化蛋白。

細(xì)葉百合中CAT蛋白抗性：利用pQE-LpCat轉(zhuǎn)化M15的蛋白表達(dá)菌液，以pQE-30空載體菌株為對照，待菌液OD600均達(dá)到0.5 時(shí)，測定在50 mmol·L-1NaHCO3處理下，分別誘導(dǎo)不同時(shí)間（0、1、2、3、4、5 h）時(shí)，測量攜帶pQE-LpCat和pQE-30 的M15 菌液的OD600值。

1.5 細(xì)葉百合LpCat 基因在過表達(dá)煙草植物中的抗性分析

1.5.1 LpCat基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化和鑒定

添加BamHⅠ/XholⅠ雙酶切位點(diǎn)的LpCat質(zhì)粒和改造后的pBI121 植物表達(dá)載體，分別回收相應(yīng)的片段，T4 連接酶16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取重組質(zhì)粒pBI121-LpCat，用電擊轉(zhuǎn)化法將雙酶切鑒定成功的pBI121-LpCat質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EH105中，葉盤法侵染煙草的葉片，選取生長狀況良好的Kana 抗性篩選后的轉(zhuǎn)基因煙草葉片提取DNA，使用CatalaseF和CatalaseR進(jìn)行PCR鑒定。

1.5.2 LpCat 過表達(dá)基因煙草的抗鹽性分析（表型測定與生理指標(biāo)）

取長勢大小一致的野生型和LpCAT過表達(dá)煙草，觀 察 在 脅 迫（1 mol·L-1NaHCO3、2.5 mol·L-1H2O2）處理下，LpCat過表達(dá)煙草分別與野生型相比生長情況的變化。利用葉綠素計(jì)SPAD-502 Plus分別測定在一系列脅迫處理下，野生型、LpCat過表達(dá)煙草的葉綠素含量；利用小籃子法測定植物呼吸速率［13］；利用過氧化氫試劑盒（南京建成，南京，中國）測定過氧化氫含量；利用硫代巴比妥溶液與紫外風(fēng)光光度計(jì)測定丙二醛的含量［14］。便攜式光合作用測定系統(tǒng)（Li-cor 6400XT，美國）被用來測定在一系列的鹽堿脅迫處理下，野生型、LpCat過表達(dá)煙草的凈光合速率，氣孔導(dǎo)度，胞間二氧化碳濃度，蒸騰速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Catalase基因開放閱讀框的克隆

采用改良CTAB 法提取的細(xì)葉百合總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，其18S 條帶和28S條帶完整且清晰。使用核酸蛋白分析儀檢測出總RNA 的濃度為1 023 mg·L-1，OD260/280為1.80，說明提取的總RNA 純度好，無蛋白污染，濃度高，可以用于反轉(zhuǎn)錄。以細(xì)葉百合的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，經(jīng)電泳檢測，得到了1 條明亮清晰的長約1 500 bp 的特異性擴(kuò)增條帶（圖1），其結(jié)果與預(yù)期基本一致。將鑒定正確的菌液送至金唯智公司測序，得到LpCat基因的測序長度為1 479 bp。

圖1 LpCat基因開放閱讀框的克隆M.DL2000；1.克隆出的LpCat基因Fig.1 Cloning of the open reading frame of LpCat gene M.DL2000；1.Cloned LpCat gene

2.2 生物信息學(xué)分析

在NCBI 官 網(wǎng) 上 使 用Open Reading Frame Finder 在線軟件獲得測序基因序列的ORF 區(qū)，Lp-Cat 蛋白的Blast 分析結(jié)果表明，細(xì)葉百合LpCat 蛋白與其他植物Catalase 蛋白的氨基酸序列有較高的相似性，其中與通江百合（L.sargentiae）的Catalase蛋白同源性高達(dá)99.39 %。

使用DNAMAN 8 軟件將細(xì)葉百合Catalase基因的氨基酸序列與通江百合（L.sargentiaeANH22606.1，99.39%）、菠蘿（Ananas comosusXP_020084722.1，93.09%）、中國蓮（Nelumbo nuciferaOAY65449.1，92.89%）、胡 桃（Juglans regiaXP_018836411.1，91.87%）、油棕（Elaeis guineensisXP_010918244.1，91.87%）、博落回（Macleaya cordataOVA00608.1，92.07%）、西班牙栓皮櫟（Quercus suberXP_023920387.1，91.26%）等植物的Catalase 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行對比（圖1）。細(xì)葉百合Catalase蛋白的氨基酸序列與其它植物Catalase蛋白的一致性高達(dá)94.94%，據(jù)此推測本試驗(yàn)成功克隆出了細(xì)葉百合的LpCat基因。

2.3 細(xì)葉百合LpCat的qPCR表達(dá)分析

利 用qPCR 檢 測20 mmol·L-1NaHCO3和11 mmol·L-1H2O2誘導(dǎo)的5 個(gè)時(shí)間段中細(xì)葉百合葉片組織中LpCat基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LpCat基因在20 mmol·L-1NaHCO3逆境處理?xiàng)l件下，12 h時(shí)段達(dá)到最高峰4.42 后開始下調(diào)。該基因在11 mmol·L-1H2O2處理中也有一定表達(dá)，表現(xiàn)為于24 h達(dá)到最高水平2.64（圖2）。

圖2 NaHCO（3A）和H2O（2B）誘導(dǎo)細(xì)葉百合葉片組織中LpCat基因的表達(dá)水平“*”表示顯著差異，通過Student’s t-test 檢驗(yàn)（P＜0.05），±SEM，“*”越多表示差異越大；ns表示不顯著差異Fig.2 Expression level of LpCat induced by NaHCO3 and H2O2 in L. pumilum leaf tissues“*”indicated a significant difference，analyzed by Student’s t-tes（tP＜0.05），±SEM，“*”indicated a greater difference；ns indicated no significant difference

2.4 Catalase蛋白與同源蛋白的進(jìn)化樹分析

借助NCBI 官網(wǎng)的數(shù)據(jù)庫支持，使用軟件MEGA 7構(gòu)建細(xì)葉百合LpCat與其同源蛋白的進(jìn)化樹（圖3），發(fā)現(xiàn)細(xì)葉百合Catalase蛋白與通江百合、菠蘿、油棕、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等植物的Catalase具有非常相近的親緣關(guān)系。

圖3 LpCat基因開放閱讀框生物信息學(xué)分析A.LpCat蛋白的同源氨基酸序列比對分析；B.LpCat與其同源蛋白的進(jìn)化樹分析Fig.3 Bioinformatics analysis of the open reading frame of LpCat gene A.Homologous amino acid sequence alignment analysis of LpCat protein；B.Evolutionary tree analysis of Catalase and its homologous proteins

2.5 重組蛋白pQE30-LpCat的原核表達(dá)

挑單克隆過夜搖菌，取2 μL 菌液加入到1 mL LB 培養(yǎng)基中，活化2 h，使菌液OD600的值為0.5 左右。在28 ℃條件下，向菌液中添加終濃度為1.0 mmol·L-1的IPTG 分別誘導(dǎo)0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h后收集菌體，利用SDS-PAGE 電泳和考馬斯亮藍(lán)染色等方法檢測蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明在50 kDa附近有明顯的誘導(dǎo)條帶，s成功誘導(dǎo)表達(dá)了細(xì)葉百合的LpCat蛋白（圖4）。

圖4 重組蛋白pQE-LpCat蛋白純化及pQE-LpCat和pQE-30轉(zhuǎn)化菌株的生長曲線A.M.雙色預(yù)染蛋白分子質(zhì)量Marker；1～7 分別是誘導(dǎo)0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h；B.M.雙色預(yù)染蛋白分子質(zhì)量Marker；1～3.復(fù)性蛋白1，復(fù)性蛋白2 和復(fù)性蛋白3；4～5.pGEX-LpCat 純化蛋白1 和純化蛋白2；C.對照條件下pQE-LpCat 或pQE-30 蛋白表達(dá)的菌液的生長曲線；D.50 mmol·L-1 NaHCO3處理下pQE-LpCat或pQE-30蛋白表達(dá)的菌液的生長曲線Fig.4 Purification of recombinant protein pQE-LpCat and growth curves of pQE-LpCat and pQE-30 transformed bacterial strains A.M.Pre-stained broad molecular weight protein Marker；1-7 were induced 0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 h；B.M.Pre-stained broad molecular weight protein Marker；1-3.Recombinant proteins 1-3；4-5.pQEX-LpCat purified proteins 4-5；C.Growth curve of pQE-LpCat or pQE-30 protein expression bacterial solution under control conditions；D.Growth curve of pQE-LpCat or pQE-30 protein expression bacterial solution under 50 mmol·L-1 NaHCO3 treatment

為得到pGEX-LpCat純化蛋白，將裂解后的蛋白置于有Ni-NTA agarose 純化樹脂的純化柱中純化，輕搖1 h 后靜置得過濾液“pGEX-LpCat復(fù)性蛋白”，重復(fù)3次，分別得到復(fù)性蛋白1-3，蛋白清洗緩沖液洗脫2 次，蛋白洗脫液緩沖液洗脫2 次得pQE-LpCat純化蛋白，分別為純化蛋白1 和純化蛋白2。最后經(jīng)SDS-PAGE 電泳后顯示，成G 功純化出目的條帶。

在未處理?xiàng)l件下（CK），pQE-LpCat和pQE-30誘導(dǎo)5 h后的OD600值分別等于1.482和1.510相差無幾；在50 mmol·L-1NaHCO3處理下，pQE-LpCat和pQE-30 誘導(dǎo)5 h后的菌液OD600值分別等于1.325 和1.113（圖4），在50 mmol·L-1NaHCO3脅迫下，LpCAT 蛋白的表達(dá)使菌液與對照相比具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力。

2.6 pCXSN-CAT植物表達(dá)載體的鑒定

為了進(jìn)一步觀察細(xì)葉百合的過表達(dá)基因Lp-CAT對于逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，首先要構(gòu)建pBI121-LpCAT植物表達(dá)載體，將鑒定成功的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后，提取出質(zhì)粒，之后用XbaI/SalI 雙酶切鑒定，結(jié)果顯示與目的基因片段相吻合，為1 479 bp。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，浸染煙草植株，以此獲得細(xì)葉百合LpCAT基因的過表達(dá)植株，經(jīng)共培養(yǎng)及篩選培養(yǎng)后獲得待鑒定的LpCAT過表達(dá)細(xì)葉百合植株，提取過表達(dá)細(xì)葉百合植株的總DNA 為模板，進(jìn)行PCR 后，發(fā)現(xiàn)株系1～6 都有PCR 產(chǎn)物，說明過表達(dá)株系轉(zhuǎn)化成功（圖5）。

圖5 pCXSN-CAT植物表達(dá)載體PCR鑒定結(jié)果M.DL2000；CK.非轉(zhuǎn)基因植物（陰性對照）；P.質(zhì)粒（陽性對照）；1～6.轉(zhuǎn)基因植物Fig.5 PCR identification of pCXSN-CAT plant expression vector M.DL2000；CK.Non-transgenic plan（tnegative control）；P.Plasmid（spositive control）；1-6.Transgenic plants

2.7 煙草植株在鹽堿脅迫處理下的表型分析

取土壤中長勢相同的野生型和過表達(dá)LpCAT基因的煙草植株株系#1-3，使用逆境（1 mol·L-1NaHCO3、2.5 mol·L-1H2O2）溶液對土壤中生長的煙草進(jìn)行澆灌，48 h 后觀察。結(jié)果表明，在逆境脅迫下，煙草開始萎蔫。與野生型相比，過表達(dá)LpCAT基因煙草植株枯萎程度相對較低（圖6）。據(jù)此分析，過表達(dá)LpCAT基因煙草植株比野生型煙草植株在表型上更耐逆境。

圖6 Catalase基因?qū)?種逆境脅迫下煙草生長情況的影響#1，#2，#3表示LpCAT基因過表達(dá)煙草株系1，2，3Fig.6 Effect of Catalase on the growth of tobacco under two stresses#1，2 and 3 indicated LpCAT gene overexpressing tobacco lines 1，2 and 3 respectively

2.8 鹽堿脅迫下LpCAT 轉(zhuǎn)基因煙草的生理指標(biāo)分析

為了探究LpCAT基因和煙草中葉片氣體交換參數(shù)是否存在關(guān)聯(lián)，使用LI-6400光合儀分別測定對照組 和 經(jīng) 不 同 處 理（1 mol·L-1NaHCO3、2.5 mol·L-1H2O2）處理48 h 的條件下，野生型和LpCAT過表達(dá)煙草的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2（Ci）和蒸騰速率（Tr）的變化（圖7）。結(jié)果顯示，在正常條件下野生型和轉(zhuǎn)基因株系的氣體交換參數(shù)沒有顯著區(qū)別。鹽脅迫處理下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系煙草葉片中凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2和蒸騰速率均下降，野生型的凈光合速率下降尤為顯著，在H2O2脅迫下下降了72.1%，由圖7 可知與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2和蒸騰速率均高于野生型，這說明Lp-CAT基因過表達(dá)能夠有效減緩鹽脅迫誘導(dǎo)的葉片氣體交換功能降低的現(xiàn)象。

圖7 野生型和LpCAT 過表達(dá)煙草的凈光合速率（A）、氣孔導(dǎo)度（B）、胞間CO2（C）和蒸騰速率（D）的變化Fig.7 Changes in net photosynthetic rate（A），stomatal conductance（B），intercellular CO2（C）and transpiration rate（D）in wild-type and LpCAT overexpressing tobacco

使用SPAD 葉綠素測量儀測量，得對照組和經(jīng)不同鹽脅迫下的煙草的葉綠素含量（圖8）。結(jié)果顯示，在植株大小相似，從上到下取相同部位葉片測量時(shí)空白對照組的野生型與轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量相近，經(jīng)鹽處理后的野生型植株葉綠素下降顯著，且H2O2和NaHCO3脅迫結(jié)果均顯示轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量高于野生型，說明過表達(dá)LpCAT植株耐鹽性高于野生型植株。

圖8 鹽脅迫下野生型和LpCAT 過表達(dá)煙草的葉綠素SPAD值（A），H2O（2B）及丙二醛（C）質(zhì)量摩爾濃度SPAD 值表示用SPAD 儀得到的葉綠素相關(guān)的讀數(shù)，SPAD 值與提取出的葉綠素含量之間存在線性相關(guān)關(guān)系Fig.8 Chlorophyll SPAD value（sA），H2O（2B）and MDA（C）molality of wild-type and Lp-CAT overexpressing tobacco under salt stress SPAD values represented chlorophyll-related readings obtained by a SPAD meter.There was a linear correlation between SPAD values and extracted chlorophyll content

為確定LpCAT基因?qū)}脅迫下活性氧的積累的影響，使用試劑盒測量得到了野生型和轉(zhuǎn)基因植株在對照和鹽脅迫下的H2O2含量（圖8）。結(jié)果表明，在未經(jīng)鹽脅迫時(shí)野生型和轉(zhuǎn)基因株系中的H2O2含量相似；經(jīng)過鹽脅迫后的株系中H2O2含量均有增加，且野生型株系H2O2含量都高于轉(zhuǎn)基因株系，野生型株系在鹽脅迫下H2O2積累量顯著高于轉(zhuǎn)基因株系，對鹽脅迫較為敏感；轉(zhuǎn)基因株系積累了較少的H2O2，對鹽脅迫具有抗性。

為確定高活性氧（ROS）積累是否與細(xì)胞損傷有關(guān)，本研究檢測了煙草不同株系在鹽脅迫下產(chǎn)生的丙二醛（MDA）含量（圖8）。結(jié)果表明，ROS水平較高的野生型MDA 顯著積累，而ROS 含量較低的轉(zhuǎn)基因株系MDA 表達(dá)量也較低。這表明鹽脅迫可引起植物體內(nèi)活性氧的大量積累，LpCAT基因的存在可降低活性氧的積累，減輕植物損傷。

3 討論

CAT 是清除H2O2的酶中最快且表達(dá)最強(qiáng)的，在不同的生理過程和不同的發(fā)育階段參與H2O2的清除［15］。植物過氧化氫酶被分為3類，Ⅰ類過氧化氫酶在光合組織中表達(dá)，Ⅱ類過氧化氫酶與維管組織有關(guān)，Ⅲ類過氧化氫酶在種子和生殖組織中顯著表達(dá)［16-17］。擬南芥中的過氧化氫酶基因分別為CAT1、CAT2、CAT3，分別對應(yīng)于Ⅲ類、Ⅰ類和Ⅱ類過氧化氫酶［17-18］。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST 的程序，發(fā)現(xiàn)LpCAT蛋白與擬南芥的CAT2親緣關(guān)系較近，說明LpCAT基因?qū)儆冖耦愡^氧化氫酶。

ZmCAT1、ZmCAT2和ZmCAT3在玉米生長發(fā)育階段有較高表達(dá)量［19］，CAT2基因在煙草NC89的根、莖、葉、花瓣、花萼和種子中均有表達(dá)，其中在花中相對表達(dá)量最高，其次為葉、莖、種子和根［20］。LoCAT1基因在長白落葉松（Larix olgensis）的根、莖、葉中均有表達(dá)其中在莖部表達(dá)量最低，在葉中相對表達(dá)量最高［21］。本研究就選擇了觀察細(xì)葉百合葉片的LpCAT基因在植物受到脅迫處理后的表達(dá)方式。

在NaCl處理后，根和莖中LoCAT1基因均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，在12 h 時(shí)表達(dá)量最低，而葉中Lo-CAT1基因表達(dá)在24 h 明顯受抑制，隨后被上調(diào)表達(dá)，脅迫96 h 時(shí)表達(dá)量最高。LoCAT1 可參與催化葉片光呼吸中產(chǎn)生的H2O2的分解作用，使機(jī)體免受H2O2毒害［21］。大豆（Glycine max）CAT家族成員在葉和開放的花中的表達(dá)量較高；熒光定量PCR分析表明，在鹽、干旱及缺氧脅迫后GmCATS基因表達(dá)量升高，且鹽和干旱脅迫下根中的響應(yīng)較葉片更顯著［22］。煙草和銀杏（Ginkgo biloba）在高鹽和干旱的脅迫下，CAT1基因表達(dá)量上調(diào)，參與植物抵御逆境脅迫［23-24］。高羊茅（Festuca arundinacea）FaCAT1 基因在植株葉片受到高鹽處理4 h 后時(shí)，F(xiàn)aCAT1基因的表達(dá)量增加到最大，來清除活性氧造成的損害［25］，說明CAT基因會在植物受到鹽脅迫的情況下，表達(dá)量有所變化，LpCAT受到鹽脅迫后，表達(dá)量會有怎么樣的變化呢，通過研究發(fā)現(xiàn)，LpCAT在受到脅迫12或24 h 后，表達(dá)量達(dá)到最大值，說明在逆境處理的很短時(shí)間，LpCAT就發(fā)揮了作用。

CAT基因的過量表達(dá)會提高植物的抗逆性，如過量表達(dá)的水稻過氧化氫酶基因OsCATb提高大腸桿菌對不同重金屬逆境脅迫的耐受性［26］。轉(zhuǎn)鹽穗木（Halostrachys caspica）過氧化氫酶基因Hc-CAT1的大腸桿菌，可明顯提高其耐鹽性［27］。本研究過量表達(dá)細(xì)葉百合LpCAT基因的大腸桿菌相對于對照的菌株，也明顯地提高了菌液的抗鹽性。這初步說明LpCAT基因與鹽堿有一定的應(yīng)答關(guān)系。擬南芥CAT基因中，只有缺少CAT2會導(dǎo)致生長抑制和葉片中H2O2的顯著積累。CAT2突變體的根系生長受到抑制，而CAT1或CAT3的突變則沒有類似的表型［28］。這說明Ⅰ類過氧化氫酶對葉片中的H2O2清除作用相對其他2 類的作用要大些。CAT 作為信號分子介導(dǎo)多種植物的鹽脅迫反應(yīng)［29］，植物受到傷害，會抑制CAT 活力，使植物體內(nèi)過氧化氫的含量升高，此時(shí)過氧化氫能夠放大脅迫信號，是植物體對脅迫產(chǎn)生快速反應(yīng)的基礎(chǔ)［30］。藍(lán)藻（AnabaenaPCC 7120）CAT基因的過量表達(dá)可提高植物的抗高鹽能力［31］。水稻幼苗受到鹽脅迫后促使H2O2積累，而過表達(dá)OsCatC可提高其CAT活性，降低體內(nèi)H2O2的含量，從而提高其鹽和氧化脅迫的耐受性［32］。鹽脅迫對桉樹（Eucalyptus robusta）活性氧代謝和CAT基因表達(dá)的影響，6個(gè)CAT基因在不同鹽脅迫強(qiáng)度下的轉(zhuǎn)錄變化差異顯著，響應(yīng)機(jī)制不盡相同［33］。這些研究說明，CAT基因在植物中發(fā)揮重要的作用。為了驗(yàn)證LpCAT基因同樣對細(xì)葉百合的耐鹽堿性發(fā)揮重要的功能，構(gòu)建了過表達(dá)植物表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法在煙草中過表達(dá)LpCAT基因，通過表型觀察和測量生理指標(biāo)，過表LpCAT基因的煙草的逆境耐性要高于野生型煙草，這表示LpCAT基因具有一定的提高植物的耐逆境脅迫能力。本研究將為揭示細(xì)葉百合對鹽堿逆境的分子機(jī)制及百合抗鹽分子育種奠定一定的理論基礎(chǔ)。

附錄：

細(xì)葉百合Catalase基因序列及氨基酸序列Gene Sequence and Amino Acid Sequence of L. pumilum Catalase