• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    龍牙楤木Aeβ-AS基因的表達(dá)對(duì)煙草中皂苷含量的影響

    2023-09-09 08:01:24霍清清夏雨新李佳樂張書雅張哲夏美玲郭雯華由香玲
    植物研究 2023年5期
    關(guān)鍵詞:三萜株系皂苷

    霍清清 夏雨新 李佳樂 韓 薇 張書雅 張哲 夏美玲 郭雯華 由香玲

    (東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150040)

    龍牙楤木(Aralia elata(Miq.)Seem),又名遼東楤木,屬五加科(Araliaceae)楤木屬落葉小喬木或灌木。龍牙楤木主要分布在我國東北地區(qū),以及俄羅斯、朝鮮和日本等地[1]。龍牙楤木具有較高的藥、食兩用價(jià)值,在保肝[2]、抗腫瘤[3-4]、抗炎[5]、降血糖[6-7]等方面有不同程度的藥理作用。近年來已從龍牙楤木的根、莖、葉、芽等部位中分離出大量活性成分,其中研究最多的為楤木皂苷[8],其結(jié)構(gòu)主要為齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷。

    齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷主要是通過甲羥戊酸(MVA)途徑合成[9-12],而β-香樹素合成酶(β-AS)是皂苷合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶,其作用位點(diǎn)為三萜皂苷生物合成途徑的下游階段[13],是生物合成三萜皂苷的第一步,將2,3-氧化鯊烯催化合成β-香樹素。現(xiàn)已從人參(Panax ginsengC.A.Mey)[14]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[15]、甘草(Glycyrrhiza uralensis)[16]、竹節(jié)參(Pana japonica)[17]等植物中克隆得到編碼β-香樹素合成酶基因的cDNA 序列。Wu等[18]首次從遼東楤木中克隆得到Aeβ-AS基因,并在酵母中成功表達(dá),但Aeβ-AS在植物中的表達(dá)尚鮮見報(bào)道。

    本研究以龍牙楤木體胚苗為材料,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆齊墩果烷型皂苷生物合成途徑中一個(gè)關(guān)鍵限速酶β-AS基因,并構(gòu)建植物表達(dá)載體對(duì)煙草進(jìn)行異源轉(zhuǎn)化。該研究為進(jìn)一步解析龍牙楤木中三萜代謝合成途徑,利用基因工程手段來提高齊墩果烷型三萜皂苷的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與試劑

    1.1 材料

    本研究所用材料為龍牙楤木(Aralia elata)體胚苗,由東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室龍牙楤木愈傷組織接種在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到,培養(yǎng)基配方為SH+3.0 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖;野生型煙草(Nicotiana tabacum)組培苗。

    1.2 試劑

    通用植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自北京BioFlux 公司;DNA marker、PCR 相關(guān)試劑、限制性內(nèi)切酶、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 均購自大連寶生物科技公司;TransStart?FastPfuDNA Polymerase,Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell,TransStart? Green qPCR SuperMix 均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;農(nóng)桿菌(Agrobacterium)GV3101 由東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;植物表達(dá)載體pROKⅡ質(zhì)粒由山東師范大學(xué)張慧教授惠贈(zèng);試驗(yàn)所用引物合成、測序服務(wù)由北京擎科生物科技有限哈爾濱分公司完成。

    2 方法

    2.1 目的基因的克隆

    參照BioTeKe 公司RNA 提取試劑盒說明書,提取龍牙楤木體胚苗的總RNA,檢測純度和濃度后,以0.5 μg 總RNA 為材料,利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)龍牙楤木Aeβ-AS基因序列[19](GenBank:HM219225)并結(jié)合植物表達(dá)載體pROKⅡ序列的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增目的片段,所用引物見表1。PCR 反應(yīng)體系為模板2 μL,引 物Aeβ-AS-F 1 μL、Aeβ-AS-R 1 μL、5×buffer 10 μL、FastPfu1 μL、dNTP 4 μL,用ddH2O 補(bǔ)足至50 μL,反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,58 ℃20 s,72 ℃ 2 min 40 s,共40 個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后,取2 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

    表1 試驗(yàn)中所用的引物Table 1 Primer sequences used in this study

    2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

    利用同源重組的方法將質(zhì)粒與pROKⅡ載體按一定比例混合,在重組酶的催化下,37 ℃反應(yīng)30 min,完成表達(dá)載體的構(gòu)建,具體方法參照說明書。利用液氮凍融法將pROKⅡ-Aeβ-AS質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR 檢測,擴(kuò)增引物pROKⅡ-F 和pROKⅡ-R序列見表1。

    2.3 轉(zhuǎn)基因煙草獲得及PCR檢測

    參照李爽等的煙草遺傳轉(zhuǎn)化方法,并進(jìn)行修改。將生長狀態(tài)良好的無菌野生型煙草葉片切成長寬1.0 cm 大小的葉片,浸泡到制備好的菌液中(OD 值為0.2~0.3)侵染10 min,共培養(yǎng)2 d 后,轉(zhuǎn)移到含有40 mg·L-1卡那霉素和200 mg·L-1特美汀的分化培養(yǎng)基中,每隔1 d更換1次培養(yǎng)基直至無菌。待長出不定芽后,將不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng),得到再生植株。

    對(duì)抗性植株進(jìn)行分子檢測,用CTAB法提取煙草葉片DNA,以pROKⅡ-F 和pROKⅡ-R 為引物進(jìn)行PCR 反應(yīng),并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,篩選出陽性轉(zhuǎn)基因株系。

    2.4 Aeβ-AS 基因在煙草中不同組織器官的表達(dá)模式分析

    利用通用植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)提取煙草轉(zhuǎn)基因株系的T0 代純合體葉片、莖和根的總RNA,以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板,以Ntactin基因?yàn)閮?nèi)參基因,利用北京全式金生物技術(shù)有限公司的熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系:模板cDNA 2 μL,2×Mix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,Dye 0.4 μL,用ddH2O補(bǔ)足至總體積為20 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃34 s,40 個(gè)循環(huán)。利用2-ΔΔCt法對(duì)Aeβ-AS基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

    2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Aeβ-AS基因表達(dá)量

    提取轉(zhuǎn)基因株系的T0 代純合體及野生型煙草葉片的總RNA。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 為模板,以Ntactin基因?yàn)閮?nèi)參基因,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。具體步驟參照2.4。利用2ΔCt法分析定量數(shù)據(jù),計(jì)算不同株系中Aeβ-AS基因的相對(duì)表達(dá)量。

    2.6 總?cè)坪糠治?/h3>

    以香草醛-冰醋酸法檢測轉(zhuǎn)基因煙草總?cè)频暮浚?9-20]。將收獲的T1 代純合體煙草植株烘干并研磨,稱取0.05 g 樣品,以4 mL 95%乙醇浸泡24 h 后超聲40 min,70 ℃水浴萃取1 h,精密移取100 μL 上清,70 ℃水浴蒸干,加入200 μL 新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液及800 μL 高氯酸,搖勻,70 ℃水浴15 min,流水冷卻至室溫,加入4 mL乙酸乙酯,于551 nm 處測量吸光值。以齊墩果酸為對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程Y=4.9235X-0.002 3,R2=0.990 3(Y表示三萜含量,X表示A值),線性范圍為0.002 5~0.080 0 mg。

    2.7 轉(zhuǎn)基因煙草關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析

    根據(jù)煙草FPS基因序列(GenBank:GQ410573.1)、SS基因序列(GenBank:MG770310.1)、SE基因序列(GenBank:XM016579303.1),并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)煙草關(guān)鍵酶FPS、SS、SE基因的引物(表1),Actin為內(nèi)參基因。

    利用qRT-PCR 的方法檢測煙草野生型與轉(zhuǎn)基因煙草關(guān)鍵酶基因FPS、SS、SE的表達(dá)情況,其反應(yīng)體系參照2.4,在調(diào)整計(jì)算域值和調(diào)整基線循環(huán)后,與Aeβ-AS基因一同進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)的分析。

    2.8 數(shù)據(jù)處理

    用SPSS 22.0 對(duì)Aeβ-AS基因在轉(zhuǎn)基因煙草中不同部位之間的表達(dá)量、各個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系中Aeβ-AS基因及其上下游的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量以及各個(gè)株系中的三萜含量進(jìn)行差異顯著性分析(Duncan),用Excel 2019作圖。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 龍牙楤木Aeβ-AS基因全長cDNA的克隆

    基于NCBI 已知的龍牙楤木Aeβ-AS基因序列(GenBank:HM219225),以龍牙楤木體胚苗cDNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到2 300 bp 左右的產(chǎn)物,與預(yù)期片段大小一致(圖1)。

    圖1 龍牙楤木Aeβ-AS基因的克隆M.Marker;1~3.PCR產(chǎn)物;4.陰性對(duì)照Fig.1 Cloning of DNA of Aeβ-AS gene from A.elata M.Marker;1-3.PCR product;4.Negative control

    3.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

    利用同源重組的方法將上述PCR 產(chǎn)物與pROKⅡ載體按一定比例混合,在重組酶的催化下,37 ℃反應(yīng)30 min,將其轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中,在抗性板上挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證(圖2A),并提取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒送測序。最終結(jié)果表明,Aeβ-AS基因成功整合到植物表達(dá)載體pROKⅡ中,至此植物表達(dá)載體構(gòu)建完成。

    圖2 植物表達(dá)載體pROKⅡ-Aeβ-AS的構(gòu)建A.pROKⅡ-Aeβ-AS菌液PCR 檢測(M.Marker;1~6.pROKⅡ-Aeβ-AS單菌落;7.陰性對(duì)照);B.農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化子的菌液PCR檢測(M.Marker;1~6.GV3101農(nóng)桿菌菌液PCR檢測;7.陰性對(duì)照)Fig.2 Construction of plant expressional vector pROKⅡ-Aeβ-AS A.PCR identification of pROKⅡ-Aeβ-AS bacterial solution(M.Marker;1-6.pROKⅡ-Aeβ-AS single colony;7.Negative control);B.PCR identification of Agrobacterium GV3101 transforman(tM.Marker;1-6.PCR detection of GV3101 Agrobacterium;7.Negative control)

    將測序正確的植物表達(dá)載體pROKⅡ-Aeβ-AS質(zhì)粒,以凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,涂含相應(yīng)抗性的平板,隨機(jī)挑選6 個(gè)單克隆經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證,得到6個(gè)目的條帶(圖2B),表明pROKⅡ-Aeβ-AS質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中,可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

    3.3 pROKⅡ-Aeβ-AS 載體在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化及PCR檢測

    用含有pROKⅡ-Aeβ-AS的農(nóng)桿菌GV3101 侵染煙草葉片,共培養(yǎng)2 d(圖3A)后,將其放于選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 周左右,選擇從葉片周圍長出的抗性芽(圖3B),切割分離后,接入含有卡那的生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)4周(圖3C)。非轉(zhuǎn)基因的煙草會(huì)受到卡那霉素的抑制而生長緩慢,逐漸死亡,轉(zhuǎn)基因煙草則會(huì)有抗性而正常生長。提取野生型和7個(gè)已獲得抗性的轉(zhuǎn)基因株系的基因組DNA,利用表1 中pROKⅡ-F 和pROKⅡ-R 為引物對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(圖3D),結(jié)果顯示抗性植株中均含有目的基因,說明外源基因已經(jīng)整合入煙草基因組中。

    圖3 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得A.共培養(yǎng)煙草;B.篩選培養(yǎng)20 d;C.轉(zhuǎn)基因植株;D.轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測(M.Marker;P.陽性對(duì)照;WT.野生型;2、8、14、21、25、27、30.轉(zhuǎn)基因株系;CK-.陰性對(duì)照)Fig.3 Identification of transgenic tobacco A.Co-cultured tobacco;B.Selected cultured for 20 d;C.Transgenic plant;D.PCR identification of different transgenic plants(M.Marker;P.Positive control;WT.Wild type;2,8,14,21,25,27,30.The transgenic plants with target gene;CK-.Negative control)

    3.4 Aeβ-AS 基因在煙草不同組織器官表達(dá)差異分析

    為了探究Aeβ-AS基因在煙草不同組織的表達(dá)差異,分別提取葉片、莖和根的總RNA,利用qRTPCR 檢測Aeβ-AS基因的表達(dá)水平,同時(shí)以煙草Ntactin基因作為內(nèi)參。結(jié)果如圖4所示,結(jié)果表明Aeβ-AS基因在檢測的不同組織中均有表達(dá),且在葉片部位具有高表達(dá),在根和莖部表達(dá)較低,存在明顯的組織特異性。

    圖4 Aeβ-AS基因在轉(zhuǎn)基因煙草中不同器官中的表達(dá)分析采用Duncan多重比較,不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);下同F(xiàn)ig.4 Expressional analysis of Aeβ-As gene in different organs of transgenic tobacco Duncan multiple comparison was used,and different lowercase letters indicated significant difference(sP<0.05);The same as below

    3.4 轉(zhuǎn)基因煙草Aeβ-AS 基因表達(dá)量及三萜含量檢測

    為了研究Aeβ-AS基因在不同轉(zhuǎn)基因煙草株系中的表達(dá)情況,提取煙草葉片總RNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測。結(jié)果如圖5 所示:與野生型煙草相比,7 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均有Aeβ-AS基因的表達(dá),基因相對(duì)表達(dá)量從高到低排序依次為:L30、L2、L8、L14、L25、L21、L27。隨機(jī)選取4 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系及野生型煙草,并檢測總?cè)坪浚▓D6),轉(zhuǎn)Aeβ-AS基因煙草中三萜含量顯著高于野生型煙草。

    圖5 Aeβ-AS基因在煙草中的相對(duì)表達(dá)量*表示與同期對(duì)照相比達(dá)顯著水平(P<0.05);下同F(xiàn)ig.5 Relative expression level of Aeβ-AS gene in tobacco* Referred to a significant level compared with control group(P<0.05);The same as below

    圖6 煙草中三萜含量Fig.6 Triterpenoid content of tobacco lines

    3.5 轉(zhuǎn)基因煙草中關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析

    利用qRT-PCR 的方法檢測了野生型與轉(zhuǎn)基因煙草Aeβ-AS、NtFPS、NtSS、NtSE基因相對(duì)表達(dá)量,結(jié) 果 如 圖7 所 示:轉(zhuǎn) 基 因 煙 草Aeβ-AS、NtFPS、NtSS、NtSE基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型,其中株系L21 和L30 相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他株系及對(duì)照,株系L21 的NtFPS、NtSS基因的相對(duì)表達(dá)量最高;株系L30 的NtSE、Aeβ-AS基因的相對(duì)表達(dá)量最高。

    圖7 煙草關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of key enzyme genes in tobacco

    4 討論

    β-香樹素合成酶(β-AS)為齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶,催化2,3-氧化角鯊烯合成β-香樹素,進(jìn)而影響植物體中三萜的含量。本研究旨在探討龍牙楤木中Aeβ-AS基因?qū)θ圃碥蘸铣傻挠绊?。查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn):張玉文等[21]通過RT-PCR 方法從藤茶(AmpeLopsis grossedentata)葉片cRNA 中擴(kuò)增到香樹脂醇合成酶基因,發(fā)現(xiàn)其在不同部位表達(dá)量不同。Jo 等[22]克隆得到了刺五加(Acanthopanax senticosus)Esβ-AS基因,并將其轉(zhuǎn)入煙草中得到了β-香樹素。本研究也將該基因轉(zhuǎn)入煙草中,得到的轉(zhuǎn)基因煙草也體現(xiàn)出了不同部位的表達(dá)差異,其中葉片中的表達(dá)量最高。將甘草和桔梗(Platycodon grandiflorus)β-AS基因分別轉(zhuǎn)入酵母中,也可得到β-香樹素[23-24],為提高三萜皂苷產(chǎn)量提供了新思路和參考。孫化鵬等[25]利用RACE 克隆技術(shù)克隆得到了洋常春藤(Hedera helix)中的β-AS基因,并通過qRT-PCR 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)了Hhβ-AS基因與常春藤皂苷含量之間存在明顯的正相關(guān)性。部分研究發(fā)現(xiàn),β-AS基因的表達(dá)量可以影響植物中三萜皂苷的含量。Zhao 等[26]對(duì)人參中Pgβ-AS基因進(jìn)行干擾,發(fā)現(xiàn)β-香樹素和齊墩果烷型皂苷的含量降低。陳勤等[27]在珠子參(Panax japonicus)細(xì)胞中同時(shí)過表達(dá)PjFPS和Pjβ-AS基因,發(fā)現(xiàn)了過表達(dá)PjFPS和Pjβ-AS的細(xì)胞系中,PJS 合成途徑相關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平有不同程度的提高,且PJS的含量最高為普通細(xì)胞系的2.4 倍。雖然單獨(dú)過表達(dá)PjFPS也可增加PJS的合成,但雙基因(PjFPS和Pjβ-AS)協(xié)同調(diào)控PJS 合成的效果更好。本研究中獲得的轉(zhuǎn)基因煙草也可在β-AS基因的作用下利用其自身含有的β-香樹素合成酶的前體物質(zhì)2,3-氧化角鯊烯,合成相應(yīng)的產(chǎn)物。對(duì)煙草總?cè)坪窟M(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)與野生型煙草相比,轉(zhuǎn)基因煙草的總?cè)坪匡@著升高,證明了合成Aeβ-AS基因并在煙草中進(jìn)行異源轉(zhuǎn)化,可以使轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)的總?cè)坪匡@著升高。此結(jié)果為進(jìn)一步將Aeβ-AS基因在龍牙楤木中過表達(dá),研究其對(duì)產(chǎn)物含量的影響奠定基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    三萜株系皂苷
    過表達(dá)NtMYB4a基因增強(qiáng)煙草抗旱能力
    澤瀉原三萜、降三萜和倍半萜的分離及其抗炎活性研究
    嫦娥5號(hào)返回式試驗(yàn)衛(wèi)星小麥育種材料研究進(jìn)展情況
    HPLC-MS/MS法同時(shí)測定三七花總皂苷中2種成分
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:19:04
    HPLC法測定大鼠皮膚中三七皂苷R1和人參皂苷Rb1
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:40
    HPLC法同時(shí)測定熟三七散中13種皂苷
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:34
    佩氏靈芝中三個(gè)新三萜
    茯苓皮總?cè)频瓮柚苽涔に嚨膬?yōu)化
    中成藥(2016年4期)2016-05-17 06:08:05
    衢州椪柑變異株系—黃皮椪柑相關(guān)特性研究
    浙江柑橘(2016年1期)2016-03-11 20:12:31
    高效液相色譜梯度洗脫法同時(shí)測定三七總皂苷中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1和三七皂苷R1含量
    欧美乱码精品一区二区三区| 欧美日韩精品网址| 老司机影院成人| 国产精品久久久久成人av| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲精品第二区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 少妇精品久久久久久久| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲国产中文字幕在线视频| 午夜福利视频精品| 久久久久久人人人人人| 五月开心婷婷网| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 老司机午夜十八禁免费视频| 69精品国产乱码久久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲av电影在线进入| 热99久久久久精品小说推荐| 国产成人啪精品午夜网站| 老司机福利观看| 久久久久视频综合| 一本色道久久久久久精品综合| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 91大片在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 99九九在线精品视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 12—13女人毛片做爰片一| videos熟女内射| 欧美午夜高清在线| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 免费高清在线观看日韩| 性色av乱码一区二区三区2| 日本精品一区二区三区蜜桃| 午夜福利,免费看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 免费观看人在逋| 国产福利在线免费观看视频| 免费看十八禁软件| 在线观看免费午夜福利视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 一级毛片电影观看| 国产av国产精品国产| netflix在线观看网站| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产在线一区二区三区精| 国产免费av片在线观看野外av| 久久女婷五月综合色啪小说| 大型av网站在线播放| 中文欧美无线码| av一本久久久久| 亚洲国产精品一区三区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 麻豆国产av国片精品| 99热网站在线观看| www.熟女人妻精品国产| 久久国产亚洲av麻豆专区| 色播在线永久视频| 亚洲专区国产一区二区| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品熟女久久久久浪| 韩国高清视频一区二区三区| 国产日韩欧美亚洲二区| 他把我摸到了高潮在线观看 | 欧美在线一区亚洲| 精品熟女少妇八av免费久了| 老司机午夜福利在线观看视频 | 大码成人一级视频| 黄色a级毛片大全视频| 国产精品久久久久成人av| 妹子高潮喷水视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲国产精品999| 国产伦人伦偷精品视频| 久久九九热精品免费| 欧美黄色淫秽网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 另类精品久久| 日本欧美视频一区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美精品一区二区大全| 午夜老司机福利片| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 亚洲精品美女久久av网站| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 99久久精品国产亚洲精品| 成人影院久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产视频一区二区在线看| 国产野战对白在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 欧美精品一区二区大全| 免费观看av网站的网址| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美97在线视频| 岛国毛片在线播放| 亚洲黑人精品在线| 久久九九热精品免费| 日本vs欧美在线观看视频| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日韩 亚洲 欧美在线| 嫩草影视91久久| 日韩视频在线欧美| 99精品欧美一区二区三区四区| 黄色视频,在线免费观看| 欧美日本中文国产一区发布| 99国产精品一区二区蜜桃av | 欧美激情 高清一区二区三区| 天堂中文最新版在线下载| 免费在线观看黄色视频的| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 嫩草影视91久久| 深夜精品福利| av网站免费在线观看视频| 99久久精品国产亚洲精品| 脱女人内裤的视频| 日韩一区二区三区影片| 美女中出高潮动态图| 丝袜美腿诱惑在线| 99香蕉大伊视频| 搡老乐熟女国产| 97人妻天天添夜夜摸| 午夜影院在线不卡| 叶爱在线成人免费视频播放| 美女主播在线视频| 精品一区在线观看国产| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 黑丝袜美女国产一区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲情色 制服丝袜| 水蜜桃什么品种好| 欧美在线黄色| 91av网站免费观看| 少妇人妻久久综合中文| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 91大片在线观看| 久热爱精品视频在线9| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 少妇人妻久久综合中文| 色播在线永久视频| 成人国产一区最新在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 大香蕉久久成人网| 国产片内射在线| 97人妻天天添夜夜摸| av欧美777| 亚洲黑人精品在线| av网站在线播放免费| 一本大道久久a久久精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 精品国产乱码久久久久久小说| 一级毛片女人18水好多| 老汉色∧v一级毛片| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久久久国内视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 免费高清在线观看日韩| 一级,二级,三级黄色视频| 69精品国产乱码久久久| 淫妇啪啪啪对白视频 | 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产伦理片在线播放av一区| 国产伦人伦偷精品视频| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久av网站| 亚洲五月婷婷丁香| 中国国产av一级| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产主播在线观看一区二区| 男女之事视频高清在线观看| e午夜精品久久久久久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 秋霞在线观看毛片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 悠悠久久av| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产高清视频在线播放一区 | 欧美另类一区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产一区有黄有色的免费视频| 91av网站免费观看| 成人国语在线视频| 亚洲av片天天在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 青草久久国产| 午夜免费鲁丝| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| www.av在线官网国产| 国产一区二区在线观看av| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| av视频免费观看在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 99国产精品99久久久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美变态另类bdsm刘玥| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 大片免费播放器 马上看| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产在线视频一区二区| 99香蕉大伊视频| 国产av国产精品国产| 一区二区三区精品91| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品一区二区精品视频观看| av视频免费观看在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 日本av手机在线免费观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲国产av新网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产成人欧美| 欧美激情 高清一区二区三区| 91国产中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频 | 日韩三级视频一区二区三区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久综合国产亚洲精品| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲人成电影免费在线| 热re99久久国产66热| 日本91视频免费播放| 亚洲九九香蕉| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 高清欧美精品videossex| 国产在线观看jvid| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久青草综合色| 99久久人妻综合| 黄频高清免费视频| 国产精品免费大片| 又紧又爽又黄一区二区| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美精品一区二区免费开放| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 老熟女久久久| 黄频高清免费视频| 免费av中文字幕在线| 不卡一级毛片| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产男女内射视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 成人免费观看视频高清| 久久久久视频综合| 国产亚洲av高清不卡| 黄色视频不卡| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 两人在一起打扑克的视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 一进一出抽搐动态| 中文字幕高清在线视频| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美在线一区亚洲| 脱女人内裤的视频| 亚洲第一av免费看| 午夜福利在线观看吧| 黄色怎么调成土黄色| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产片内射在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产三级黄色录像| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久久国产精品人妻一区二区| av在线app专区| 99re6热这里在线精品视频| 两人在一起打扑克的视频| 免费日韩欧美在线观看| 在线永久观看黄色视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 丝袜美足系列| av欧美777| 日本av免费视频播放| 黑人操中国人逼视频| 日韩电影二区| 黄片大片在线免费观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 他把我摸到了高潮在线观看 | 国产一区二区在线观看av| 色老头精品视频在线观看| 黄片小视频在线播放| 午夜老司机福利片| 色老头精品视频在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 日韩制服骚丝袜av| 下体分泌物呈黄色| 久久久久精品人妻al黑| 最新在线观看一区二区三区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产一区二区激情短视频 | 午夜免费观看性视频| 在线观看免费午夜福利视频| 男人爽女人下面视频在线观看| www.999成人在线观看| 成人国语在线视频| 在线观看www视频免费| 欧美激情高清一区二区三区| 久久综合国产亚洲精品| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产一区二区三区av在线| 高清欧美精品videossex| 男女床上黄色一级片免费看| 成人国语在线视频| 国产精品久久久久久精品古装| 51午夜福利影视在线观看| 久久久久久久精品精品| 精品一区二区三卡| 99热国产这里只有精品6| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产免费现黄频在线看| 男女高潮啪啪啪动态图| 老熟女久久久| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 十八禁网站免费在线| 久久久国产一区二区| 自线自在国产av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 99久久人妻综合| 欧美精品一区二区大全| 久久久久久久久免费视频了| 婷婷色av中文字幕| 香蕉丝袜av| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 日本91视频免费播放| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 久久精品国产综合久久久| 国产一卡二卡三卡精品| 日本vs欧美在线观看视频| 麻豆乱淫一区二区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 搡老乐熟女国产| 91成人精品电影| 一区二区三区精品91| 一本久久精品| 久久毛片免费看一区二区三区| 午夜老司机福利片| 久久人人爽人人片av| 一个人免费在线观看的高清视频 | 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 人妻人人澡人人爽人人| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 看免费av毛片| 久久久国产欧美日韩av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 淫妇啪啪啪对白视频 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 大香蕉久久成人网| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 91麻豆av在线| 亚洲精品在线美女| 91av网站免费观看| 免费在线观看日本一区| 成年动漫av网址| 人人妻人人澡人人看| 日韩 亚洲 欧美在线| 最近中文字幕2019免费版| xxxhd国产人妻xxx| 啦啦啦免费观看视频1| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产免费一区二区三区四区乱码| 他把我摸到了高潮在线观看 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 不卡一级毛片| 国产成人精品无人区| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 成人手机av| 亚洲专区字幕在线| 欧美日本中文国产一区发布| www.精华液| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美另类一区| 美女午夜性视频免费| 热99re8久久精品国产| 97精品久久久久久久久久精品| 视频在线观看一区二区三区| 淫妇啪啪啪对白视频 | 亚洲成人免费av在线播放| 波多野结衣一区麻豆| av免费在线观看网站| 国产男女超爽视频在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 久久狼人影院| 日韩中文字幕视频在线看片| 涩涩av久久男人的天堂| 国产国语露脸激情在线看| 性色av一级| 在线天堂中文资源库| av国产精品久久久久影院| 99国产精品免费福利视频| 国产一区二区 视频在线| 日韩精品免费视频一区二区三区| 各种免费的搞黄视频| 在线观看人妻少妇| av片东京热男人的天堂| 成年av动漫网址| 久久香蕉激情| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜福利在线观看吧| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 波多野结衣av一区二区av| 国产免费av片在线观看野外av| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 不卡一级毛片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美日韩av久久| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲av片天天在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 91麻豆av在线| 一区二区日韩欧美中文字幕| 桃花免费在线播放| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人影院久久av| 美女国产高潮福利片在线看| 日本a在线网址| netflix在线观看网站| 久久久国产精品麻豆| 欧美精品av麻豆av| 一区福利在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 后天国语完整版免费观看| 亚洲专区国产一区二区| 天堂中文最新版在线下载| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产在线免费精品| 精品少妇久久久久久888优播| 久久av网站| 精品一区在线观看国产| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 丝瓜视频免费看黄片| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产成人欧美| 亚洲天堂av无毛| 性色av一级| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲欧美日韩另类电影网站| av网站免费在线观看视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲国产日韩一区二区| 天堂8中文在线网| 久久中文看片网| 男女高潮啪啪啪动态图| 日韩欧美一区视频在线观看| svipshipincom国产片| 啦啦啦免费观看视频1| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日韩黄片免| 免费不卡黄色视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 男女床上黄色一级片免费看| 91九色精品人成在线观看| cao死你这个sao货| 999精品在线视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日本欧美视频一区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 大香蕉久久网| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产av又大| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费在线观看完整版高清| 咕卡用的链子| 亚洲精品自拍成人| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日本av手机在线免费观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 美女午夜性视频免费| 一级毛片女人18水好多| 亚洲七黄色美女视频| 欧美日韩黄片免| 69精品国产乱码久久久| 嫩草影视91久久| 99久久精品国产亚洲精品| 久久久精品免费免费高清| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费在线观看完整版高清| 9色porny在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 性色av一级| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲av美国av| 国产亚洲精品一区二区www | 美女大奶头黄色视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 人妻久久中文字幕网| 在线天堂中文资源库| 老司机亚洲免费影院| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久国产欧美日韩av| 国产高清国产精品国产三级| 俄罗斯特黄特色一大片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产麻豆69| 考比视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 麻豆av在线久日| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产人伦9x9x在线观看| 91av网站免费观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 老司机福利观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美日韩福利视频一区二区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品少妇内射三级| 欧美日韩成人在线一区二区| tube8黄色片| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美xxⅹ黑人| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 色综合欧美亚洲国产小说| 大香蕉久久网| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 性色av一级| 91麻豆av在线| 性高湖久久久久久久久免费观看| 97精品久久久久久久久久精品| e午夜精品久久久久久久| 亚洲男人天堂网一区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 精品人妻在线不人妻| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲黑人精品在线| 18禁观看日本| 欧美大码av| 男女之事视频高清在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产精品av久久久久免费| 超碰97精品在线观看| 国产精品免费大片| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 桃花免费在线播放| 99re6热这里在线精品视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 三级毛片av免费| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费日韩欧美在线观看| 一进一出抽搐动态| 1024香蕉在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 麻豆乱淫一区二区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产一区二区激情短视频 | bbb黄色大片| 国产一卡二卡三卡精品| www日本在线高清视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久中文看片网| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 国产精品一二三区在线看| 国产男人的电影天堂91| 老司机影院毛片| 韩国高清视频一区二区三区|