肽組學(xué)分析技術(shù)及其在食品研究中的應(yīng)用進(jìn)展

范麗琪，郁曉藝，劉磊，李武，許思盈，李曉敏,*，徐巨才*

（1.五邑大學(xué)生物科技與大健康學(xué)院，江門市大健康國際創(chuàng)新研究院,廣東江門 529020）（2.完美（廣東）日用品有限公司,廣東中山 528400）

近年來，基于質(zhì)譜技術(shù)的組學(xué)研究進(jìn)展非常迅速。以蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)等為代表的組學(xué)研究正在生物、醫(yī)藥、食品等多個領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的引領(lǐng)作用[1]。多肽組學(xué)（Peptideomics）是基于蛋白質(zhì)組學(xué)衍生發(fā)展起來的一門科學(xué)。但與蛋白質(zhì)組學(xué)研究不同的是，多肽組學(xué)主要以小分子多肽為研究對象，重點(diǎn)關(guān)注樣品中多肽的組成及變化規(guī)律，而非大分子蛋白質(zhì)的組成及變化規(guī)律[2]。與多肽組學(xué)研究隨之興起的是多肽組學(xué)分析技術(shù)的快速進(jìn)步。目前，多肽組學(xué)分析技術(shù)發(fā)展了一系列包括樣品前處理、高效分離、快速鑒定、活性分析、可視化處理等[3]在內(nèi)的新興技術(shù)，為多肽組學(xué)研究提供了重要支撐。

多肽在結(jié)構(gòu)序列上的差異可使其具有不同的功能特性[4]，是多肽組學(xué)研究和關(guān)注的重點(diǎn)。早期，多肽組學(xué)主要應(yīng)用于生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域標(biāo)志物的發(fā)掘與藥品研發(fā)[5]，關(guān)注度較低。但近年隨著質(zhì)譜技術(shù)、多肽藥物和食源性生物活性肽的發(fā)展，多肽組學(xué)研究進(jìn)展迅速。尤其在食品領(lǐng)域，受益于更靈活的市場機(jī)制，基于多肽組學(xué)技術(shù)研究與制備新型食源性活性肽成為了當(dāng)下食品科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[6]。食品蛋白原料中含有豐富的活性多肽片段，利用生物酶解或發(fā)酵技術(shù)釋放這些活性多肽是制備功能性食品的重要途徑[7]。目前，國內(nèi)外科研學(xué)者報道了一系列具有抗氧化、降血糖、降血脂、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotension Converting Enzyme，ACE）和抑制二肽基肽酶IV（Dipeptidyl Peptidase-4，DPP-IV）等活性的多肽或蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物，因純天然、安全無副作用而受到消費(fèi)者的廣泛青睞[8]?；诙嚯慕M學(xué)研究食品中活性多肽的釋放機(jī)制及活性作用機(jī)理正在推動多肽產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

1 多肽組學(xué)分析技術(shù)

圖1 肽組學(xué)分析流程Fig.1 Workflow of general peptidomic analysis

多肽組學(xué)分析一般遵循以下流程：樣品前處理、色譜分離、質(zhì)譜檢測、結(jié)構(gòu)鑒定及活性評價等，對應(yīng)發(fā)展了一系列包括在線脫鹽、亞2 μm顆粒色譜柱、電噴霧質(zhì)譜檢測、多肽組學(xué)鑒定、活性匹配及構(gòu)效分析等技術(shù)，為大規(guī)模生物活性肽分析提供了一套有力的工具和方法[9]。尤其隨著高分辨質(zhì)譜的逐漸普及和相關(guān)數(shù)據(jù)處理算法和軟件的不斷發(fā)展，肽組學(xué)技術(shù)已成為食品生物分析領(lǐng)域最重要的分析技術(shù)之一[10]。

1.1 樣品的前處理

食品肽組學(xué)分析的對象常為各種蛋白質(zhì)酶促水解/發(fā)酵產(chǎn)物、動物組織/血液等樣本[11]，組成成分較為復(fù)雜，通常在上機(jī)分析前需進(jìn)行一定的前處理，包括精濾、膜分離、萃取、脫鹽等。其中，膜過濾主要是利用半透膜對不同粒徑分子的選擇性從而實現(xiàn)樣品凈化和多肽富集[12]。研究發(fā)現(xiàn)食源性多肽樣本常含有較多的小分子親水性多肽，在反相色譜中的分離表現(xiàn)欠佳，采用膜分離對樣本進(jìn)行前處理，可有助于對親水性組分實施差異化的色譜分離。萃取主要利用樣品中各組分在萃取劑或萃取頭中的溶解度或吸附性質(zhì)差異而實現(xiàn)樣品中雜質(zhì)的分離或多肽組分的富集[13]。脫鹽是多肽組學(xué)樣品分析前處理中最為重要的步驟之一，尤其對于醬油、血液等鹽分含量較高的樣品，如不經(jīng)脫鹽直接注入質(zhì)譜極易導(dǎo)致離子源污染[14]。近年來，自動閥切換在線脫鹽、柱脫鹽等技術(shù)的發(fā)展，大大提升了脫鹽和分析的效率。Wang等[15]開發(fā)了一種基于納升級高效液相色譜的在線脫鹽方法，其脫鹽率可達(dá)98.5%，高于常規(guī)離線操作83.1%的脫鹽率，大大提升了分析效率。這些前處理技術(shù)的在線化和自動化發(fā)展，極大地便利了肽組學(xué)分析技術(shù)在食品、生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用[16]。

1.2 色譜分離技術(shù)

近年來，色譜柱填料、分離設(shè)備性能、自動化程度等不斷提升，發(fā)展了包括超高壓液相（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC）、納升級液相（Nano Liquid Chromatography，Nano-LC）、亞2 μm顆粒、在線多維色譜、核殼（Core-shell）色譜柱等各型新色譜分離技術(shù)。其中，超高壓分離技術(shù)通過提升輸液泵最大耐受壓力并縮小系統(tǒng)死體積，搭配亞2 μm顆粒色譜柱，在10 min內(nèi)即可快速獲得優(yōu)于傳統(tǒng)高效液相色譜（HPLC）40 min的分離效果，性能優(yōu)異[17]。納升級液相在超高壓液相的基礎(chǔ)上，采用超低納升級流速和亞毫米內(nèi)徑色譜柱進(jìn)行分離，顯著降低進(jìn)樣量的同時大幅提升了質(zhì)譜的靈敏度，10 min即可實現(xiàn)鑒定2 600條蛋白，被譽(yù)為組學(xué)分析標(biāo)配[18]。Rocchi等[19]將配備了新型亞2 μm顆粒色譜柱的納升液相色譜用于398種對映體的分離，發(fā)現(xiàn)化合物的分離可在3 min內(nèi)完成，且分辨率高達(dá)5.11。在線二維液相色譜（Two-Dimensional Liquid Chromatography，2D-LC）主要是通過一個自動多通閥將兩種相互獨(dú)立的單維液相色譜連接在一起，使得樣品的每一個組分都能同時經(jīng)歷兩種不同的分離，從而獲得遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)單維液相色譜的分離效果[20]（圖2）。Attoma等[21]構(gòu)建在線反相色譜（RPLC）×親水性色譜（HILIC）用于多肽的分離，峰容量較傳統(tǒng)單維液相色譜提高了10倍以上。Ilario等[22]通過將二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，從意大利奶酪水解物中鑒定出了45條抗菌肽段，有效彌補(bǔ)了單一色譜柱分離的局限性。這些新型色譜分離技術(shù)在食源性蛋白酶解產(chǎn)物分析中的應(yīng)用，將有助于突破當(dāng)前復(fù)雜多肽成分分離的瓶頸。尤其，綜合利用超高壓液相、納升級液相、亞2 μm顆粒色譜柱等構(gòu)建超高效多維液相色譜，將是未來多肽分離技術(shù)的重要發(fā)展方向之一。

圖2 二維液相色譜分離示意圖Fig.2 A schematic diagram of two-dimensional liquid chromatography

1.3 質(zhì)譜檢測技術(shù)

質(zhì)譜電離技術(shù)的發(fā)展，尤其是軟電離技術(shù)的誕生，如基質(zhì)輔助激光解吸電離（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI）和電噴霧電離（Electron Spray Ionization，ESI）快速推動了蛋白質(zhì)、多肽的鑒定分析[23]。其中，MALDI離子源主要利用瞬時高強(qiáng)度激光脈沖能量作用于樣品，使分子直接呈氣態(tài)離子化進(jìn)入質(zhì)譜檢測器中，研究發(fā)現(xiàn)，這種離子源傾向于產(chǎn)生單電荷離子，且分子結(jié)構(gòu)完整性保持較好[24]。在科研實踐中，研究人員通常將MALDI離子源與高分辨質(zhì)譜檢測器，如靜電場軌道阱（Orbitrap）、飛行時間質(zhì)量分析器（Time of Flight，TOF）等聯(lián)用，應(yīng)用于蛋白、多肽的分子量測定或指紋圖譜分析[25]。與MALDI不同，ESI離子源主要在高壓下對樣品進(jìn)行噴霧，利用庫倫爆炸來實現(xiàn)分子的離子化[26]。該技術(shù)在液相色譜與質(zhì)譜檢測器之間架起了橋梁，應(yīng)用廣泛，是當(dāng)前多肽組學(xué)分析的主流方法。尤其納升級離子源（Nano-ESI）配備1～2 μm的噴霧針，以20 nL/min的超低流速對離子傳輸孔進(jìn)行水平線性噴霧（圖3），可獲得極高的靈敏度[27]。

圖3 不同軟電離技術(shù)示意圖Fig.3 Schematic diagrams of different soft ionization techniques

圖4 肽組學(xué)數(shù)據(jù)的分析與處理Fig.4 Analysis and process of peptidomic data

圖5 硅降解分析示意圖Fig.5 A schematic diagramof in-silico digestion analysis

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理技術(shù)

數(shù)據(jù)處理是質(zhì)譜組學(xué)分析中最為關(guān)鍵的步驟之一。多肽分子在經(jīng)過質(zhì)譜一級與二級信息的采集后，需將上述質(zhì)荷比信息分析轉(zhuǎn)換為多肽的序列結(jié)構(gòu)信息，即多肽的鑒定[28]。目前，科研學(xué)者利用序列搜庫、從頭測序、枚舉匹配等方法，發(fā)展了一系列蛋白質(zhì)/多肽組學(xué)分析鑒定工具，如Mascot、ProteinDiscoverer、MaxQuant、PepNovo、PEAKS、PepOS等[29]。但與蛋白質(zhì)組學(xué)聚焦于蛋白組成不同，多肽組學(xué)分析主要關(guān)注多肽的組成。對于食源性蛋白酶解物而言，因食品酶制劑通常位點(diǎn)較為廣泛且純度較低，樣品中通常包含較多的非特異性長肽與短肽，是組學(xué)分析的重點(diǎn)與難點(diǎn)[30]。Serena等[31]研究發(fā)現(xiàn)，Mascot、Proteome Discoverer、MaxQuant等蛋白質(zhì)組學(xué)工具對食品中非特異性長肽和短肽的分析效果不太理想，尤其缺乏對短肽的鑒定支持。PepNovo、PEAKS和PepOS作為專注于多肽結(jié)構(gòu)鑒定的方法和工具[32,33]，在食源性多肽分析鑒定方面的適用性更強(qiáng)。此外，ProteoWizard為各型號質(zhì)譜數(shù)據(jù)提供了格式轉(zhuǎn)換工具[34]，PeptideShaker[35]、Skyline[36]等則提供了針對Mascot、Andromeda、X!Tandem等多肽鑒定結(jié)果可視化及非標(biāo)定量分析技術(shù)的支持，進(jìn)一步豐富了質(zhì)譜數(shù)據(jù)的多元化處理。近年來，針對食源性生物活性肽，研究人員還構(gòu)建了多種活性多肽數(shù)據(jù)庫（包括BIOPEP-UWM、AHTPDB、ExPASy等），并發(fā)展了一系列多肽生物活性評價方法（如PeptideRanker、UDSMProt等）[37,38]。這些多肽活性預(yù)測分析技術(shù)與多肽鑒定技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，共同推動了多肽組學(xué)分析技術(shù)的快速發(fā)展。

表1 常見的肽組學(xué)分析鑒定工具Table 1 Common peptidomic analysis tools

2 多肽組學(xué)分析技術(shù)在食品中的應(yīng)用

多肽組學(xué)在食品中的應(yīng)用主要集中于生物活性肽的分離鑒定、引導(dǎo)制備、質(zhì)量控制、預(yù)測挖掘等方面[43]，在引領(lǐng)食源性生物活性肽的快速發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

2.1 天然活性肽及生物標(biāo)志物的分離鑒定

天然活性肽的分離鑒定一直以來是食品與藥物研究的重點(diǎn)，而肽組學(xué)技術(shù)的發(fā)展則大大加速了這一進(jìn)程。國內(nèi)外研究人員已經(jīng)成功從自然界的各種復(fù)雜樣品中獲得了多種生物活性肽，如梁佳明[44]采用一種納升級超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的組學(xué)分析技術(shù)，從牛肝菌酶解物中鑒定了3條鮮味肽：Thr-Lys-Glu-Val-Tyr-Glu-Gly-Glu-Val，Ile-Val-Pro-Arg-Phe-Glu和Phe-Gly-Leu-Asp-Phe。姜云松等[45]利用肽組學(xué)分析從酒糟發(fā)酵和酶解產(chǎn)物中鑒定出了7種新型ACE抑制肽，其中肽段AVQ呈現(xiàn)出強(qiáng)抑制活性，潛在功能價值極高。楊晨等[46]采用這種方法，發(fā)現(xiàn)了4種具有強(qiáng)ACE抑制活性的南瓜多肽（IFH、IFF、LAAF、DFHPR）。類似地，F(xiàn)ernanda等[47]將多肽組學(xué)分析與生物活性分析相結(jié)合，從開菲爾酸奶中鑒定出265條乳清肽，并發(fā)現(xiàn)這些肽可有助于改善脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的脂質(zhì)積累和代謝。肽組學(xué)技術(shù)的運(yùn)用極大地便利了樣品的高通量多肽鑒定與數(shù)據(jù)篩選分析，這對推動天然活性肽的高效挖掘起到了重要作用。

特異性多肽是食品功能特性、來源等信息的重要標(biāo)志物，肽組學(xué)分析技術(shù)在這些肽類標(biāo)志物的發(fā)掘中亦扮演了重要角色。Michelle等[48]從12種常見谷物的面筋蛋白提取物中篩選鑒定出4種谷物標(biāo)記肽，實現(xiàn)了谷物麩質(zhì)殘留的準(zhǔn)確識別和定量監(jiān)測。陸玉嬌[49]研究了AM真菌侵染后不同時期玉米根部多肽組的變化，發(fā)現(xiàn)多條肽段可作為作物受真菌侵染情況的生物標(biāo)志物，有助于了解微生物與植物體的相互作用機(jī)制。Teixeira等[50]從5種動物肉制品中發(fā)現(xiàn)了20種熱穩(wěn)定肽能夠作為熟制加工肉類的品種鑒別指標(biāo)，且其中的18種為首次報道。這些發(fā)現(xiàn)充分展示了肽組學(xué)技術(shù)在挖掘生物標(biāo)記肽方面的重要作用。未來，隨著肽組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，將有越來越多的特異性多肽被鑒定、發(fā)掘出來。

2.2 食源性生物活性肽的引導(dǎo)制備

采用不同原料或不同工藝制備的食源性活性肽，在多肽組成和生物活性方面常呈現(xiàn)較大差異。為提高活性肽的研發(fā)效率，近年來，研究人員[51]發(fā)展了基于肽組學(xué)的計算機(jī)模擬酶解分析方法（簡稱硅降解）。硅降解（In-Silico Digestion）主要是利用蛋白酶的作用位點(diǎn)信息對蛋白質(zhì)進(jìn)行模擬降解，以實現(xiàn)對活性肽的釋放預(yù)測和制備方案評估。目前，PeptideCutter、BIOPEP等均具有模擬酶解功能，可基于蛋白序列和酶等信息分析理論降解產(chǎn)物，并匹配或預(yù)測可能的活性肽段[52]。Meisam等[53]采用BIOPEP對乳蛋白原料進(jìn)行模擬分析，發(fā)現(xiàn)100 g牛奶理論上可最大產(chǎn)生6 700.241 μmol的抗消化肽，且其中1 880.434 μmol具有降血糖活性，充分表明牛奶是降血糖肽的潛在優(yōu)質(zhì)原料。Yang等[54]提出的一種基于深度學(xué)習(xí)的硅降解方法（稱為Deep Digest），該方法可計算蛋白質(zhì)序列上各潛在切割位點(diǎn)的概率并以此預(yù)測酶解產(chǎn)物，擬合系數(shù)可達(dá)0.956～0.982。這些方法為活性肽的制備提供了有力的導(dǎo)向評估支持，但值得注意的是，當(dāng)前大多數(shù)硅降解方法尚缺乏對堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等廣譜性酶制劑的支持，仍有待進(jìn)一步完善和發(fā)展[55]。此外，肽組學(xué)分析技術(shù)還可在多肽研發(fā)過程中提供實時引導(dǎo)，為活性多肽的釋放提供實踐依據(jù)。

2.3 食源性多肽產(chǎn)品的質(zhì)量控制

食源性多肽產(chǎn)品魚龍混雜，如何建立有效的質(zhì)量控制方法是近年來研究的熱點(diǎn)。指紋譜是蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物在液相或質(zhì)譜上所檢測到的具有一定分布特征的譜圖，常被用于多肽樣品的特異性鑒別區(qū)分與加工儲藏穩(wěn)定性研究[56]。Sweeny等[57]利用肽組學(xué)分析和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)研究植物蛋白酶解物分別經(jīng)過噴霧和冷凍干燥后肽譜的變化情況，發(fā)現(xiàn)二者之間相似程度極高，反映了樣品中多肽具有良好的熱穩(wěn)定性。對于發(fā)酵食品，利用肽組學(xué)技術(shù)分析產(chǎn)物中肽譜及多肽組成的變化，亦可有助于了解發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的降解機(jī)理和風(fēng)味形成機(jī)制，為關(guān)鍵發(fā)酵技術(shù)開發(fā)提供方向[58]。此外，利用肽組學(xué)技術(shù)對食品中特異性多肽的檢測分析，亦可實現(xiàn)對食品品質(zhì)的動態(tài)監(jiān)測、摻偽分析及產(chǎn)品溯源。陳李品等[59]從太平洋牡蠣中發(fā)現(xiàn)多條特異性肽段可作為其鮮活品質(zhì)評價指標(biāo)。Hu等[60]研究鑒定了22條特征性多肽可用于市售23種蝦的品質(zhì)評判和真?zhèn)巫R別。借助肽組學(xué)技術(shù)快速、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于食源性多肽產(chǎn)品的精準(zhǔn)質(zhì)控將是未來的多肽研究的重要方向之一。

2.4 新型活性肽的快速挖掘

采用體外化學(xué)分析或生物模型實驗來進(jìn)行生物活性肽的挖掘和強(qiáng)度評估是傳統(tǒng)實驗方法普遍的策略[61]，但是該流程耗時長且成本高昂。肽組學(xué)分析技術(shù)提供了一種更為經(jīng)濟(jì)高效的方案，該技術(shù)利用數(shù)據(jù)庫和構(gòu)效預(yù)測模型，不僅可進(jìn)行已知活性肽的快速篩選，還可預(yù)測未知肽的生物活性[62,63]。Peptide Ranker（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）通過整合多個活性肽數(shù)據(jù)庫的信息，并對未知肽序列的活性概率進(jìn)行評分和排序，提供了一種多肽潛在生物活性的預(yù)測方法[64]。值得注意的是，專用數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建以及檢索策略的開發(fā)是肽段構(gòu)效表征的關(guān)鍵。程凱等[65]構(gòu)建了一種包含蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)注釋信息的數(shù)據(jù)庫并開發(fā)專用的檢索方式，從組織細(xì)胞中鑒定了933條磷酸化修飾肽段，鑒定數(shù)目比采用通用數(shù)據(jù)庫的分析增加了19.4%，初步實現(xiàn)了對磷酸化肽段快速而準(zhǔn)確的鑒定。梁瀟等[66]通過提取的23種常見抗癌肽的序列特征構(gòu)建了基于序列信息的抗癌肽預(yù)測集成學(xué)習(xí)模型ACPredStackL可有效預(yù)測序列是否為抗癌肽。這些研究體現(xiàn)了肽組學(xué)技術(shù)在快速評價和挖掘未知活性肽方面的突出優(yōu)勢，有望打破現(xiàn)有傳統(tǒng)技術(shù)所面臨的瓶頸，但這一進(jìn)展過程將有賴于活性肽數(shù)據(jù)庫與構(gòu)效預(yù)測模型的不斷發(fā)展和完善。

3 總結(jié)與展望

近年來，多肽組學(xué)分析技術(shù)發(fā)展迅猛，已逐漸成為一項集樣品前處理、分離、檢測、鑒定和活性評價等為一體的綜合技術(shù)?，F(xiàn)階段，多肽組學(xué)分析技術(shù)不僅被應(yīng)用于食品中多肽組成的快速分析，還被廣泛應(yīng)用于生物活性肽的快速挖掘、引導(dǎo)制備和質(zhì)量控制等，在推動食品多肽產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。未來，隨著多肽組學(xué)分析技術(shù)在食品中的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用，尤其是肽組學(xué)鑒定方法、多肽活性預(yù)測/評價/作用機(jī)制、蛋白質(zhì)概率性降解模型、活性肽數(shù)據(jù)庫等的不斷發(fā)展和完善，生物活性肽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展前景將更為廣闊。同時，多肽組學(xué)分析技術(shù)將逐步實現(xiàn)引領(lǐng)下一代多肽產(chǎn)業(yè)技術(shù)的升級與變革，在多肽行業(yè)中占據(jù)重要地位。