發(fā)酵辣椒中的微生物及其風味物質(zhì)研究進展

賀子玉，何心，胡楠，易有金*，夏菠*，朱樹清，朱利紅，朱妮娜

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南長沙 410128）（2.汝城縣繁華食品有限公司，湖南郴州 424100）（3.汝城縣鑫利食品有限公司，湖南郴州 424100）（4.張家界洞溪七姊妹辣椒開發(fā)有限公司，湖南張家界 427209）

發(fā)酵辣椒即利用微生物在無氧條件下的分解作用產(chǎn)生各種有機酸、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性香氣等風味物質(zhì)，使得新鮮辣椒逐漸熟化，從而獲得一種具有獨特發(fā)酵風味的辣椒制品。按照原料和制作方法的不同，發(fā)酵辣椒可分為剁辣椒（湖南）、泡辣椒（四川）、糟辣椒（貴州、云南、重慶）、辣椒醬（湖南、廣西、貴州）、鲊辣椒（湘西、張家界）、鹽漬辣椒（湖南、河北）等；剁辣椒主要是將新鮮脆嫩的朝天椒洗凈去蒂、晾干水分后，剁碎成1~2 cm的小段，加入適量食鹽、白酒等拌勻后裝壇，厭氧發(fā)酵一月以上。泡辣椒是將新鮮辣椒洗凈放入壇中，添加或不添加輔料，于食鹽水泡漬發(fā)酵而成。糟辣椒是將肉質(zhì)厚實、辣味適中的新鮮紅辣椒洗凈晾干，輔以姜、蒜在干凈木盆中用刀反復剁碎至米粒大小，再加入鹽、糖、白酒等拌勻，裝壇密封，自然發(fā)酵15 d即可作為調(diào)料用。辣椒醬是將成熟紅辣椒或干辣椒剁成碎末，按照喜好加入食用油、蒜末、姜末、白酒以及其他調(diào)味香辛料等，攪拌均勻進行發(fā)酵或非發(fā)酵工藝制備而成。鲊辣椒是將新鮮的紅辣椒洗凈剁碎，與玉米粉或大米粉按照2:1的比例混合，添加食鹽、生姜調(diào)味，裝壇液封自然發(fā)酵而成。鹽漬辣椒是需要在紅辣椒中加入大量食鹽腌制，食鹽量一般在15%以上，腌制發(fā)酵一段時間后再進行脫鹽重新調(diào)味而成。發(fā)酵辣椒又分為自然發(fā)酵和接種發(fā)酵兩種方法，由于傳統(tǒng)自然發(fā)酵過程中的菌群不明、易產(chǎn)生不良風味物質(zhì)，導致發(fā)酵結(jié)果不可控，接種發(fā)酵成為了目前研制發(fā)酵辣椒的熱點方法。人工接種可以有效避免雜菌的污染，使發(fā)酵菌種快速成為優(yōu)勢菌，明確發(fā)酵辣椒中主要的微生物群落，是制備具有優(yōu)良風味發(fā)酵辣椒的關(guān)鍵。因此本文簡述了發(fā)酵辣椒中的微生物多樣性及其檢測方法，重點介紹了發(fā)酵辣椒中的風味物質(zhì)及其影響因素，并指出了目前研究過程中存在的問題及對未來的展望，以期為該行業(yè)的發(fā)展提供參考。

1 發(fā)酵辣椒中的微生物及其檢測方法

1.1 發(fā)酵辣椒中的微生物多樣性

微生物貫穿辣椒發(fā)酵的整個過程，發(fā)酵菌群的結(jié)構(gòu)和演替決定了代謝物的類型和數(shù)量，以及發(fā)酵辣椒中所含揮發(fā)性物質(zhì)的多樣性和組成，從而形成了特定的風味。所以，充分了解辣椒發(fā)酵過程中的微生物群落演替對于明確接種發(fā)酵菌種是至關(guān)重要的。

1.1.1 發(fā)酵辣椒中的細菌

發(fā)酵辣椒中細菌種類豐富，數(shù)量繁多，由于原料、發(fā)酵方法以及季節(jié)和地域的不同，發(fā)酵辣椒中的優(yōu)勢細菌屬會存在部分差異性，主要由乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leucanostoc）、片球菌屬（Pediococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）等厚壁菌門（Firmicutes），腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）、Rosenbergiella、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鹽單胞菌屬（Halomonas）等變形菌門（Proteobacteria）及隸屬于放線菌門（Actinobacteria）的棒狀桿菌屬（Corynebacterium）構(gòu)成[1,2]，它們彼此之間相互競爭成為不同發(fā)酵時期的優(yōu)勢菌。

采用454焦磷酸測序技術(shù)研究不同品種鹽漬辣椒（15%以上鹽度）中的細菌多樣性，從門的水平上講，鹽漬辣椒主要都是以厚壁菌門和變形菌門為主，擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門等占比較少，其中占比較大的藍藻菌門（Cyanobacteria）只存在切碎辣椒樣品中，可能主要源于辣椒本身；從屬的水平上講，鹽漬線椒中優(yōu)勢菌屬為乳球菌屬（Lactococcus）和根瘤菌屬（Rhizobium），鹽漬米椒中優(yōu)勢菌屬為鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）、海螺菌屬（Marinospirillum）、色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）、鹽單胞菌屬、乳球菌屬等占80%以上[3]。研究表明，鹽漬辣椒隨著保存時間的延長，細菌群落逐漸被嗜鹽單胞菌屬、嗜鹽弧菌屬、假單胞菌屬、色鹽桿菌屬等菌屬代替，鹽度和發(fā)酵總酸可能是影響微生物群落變化的關(guān)鍵因素[4]。

中低鹽度的辣椒為乳酸菌提供了有利的發(fā)酵環(huán)境，辣椒鹽度與乳酸菌的相對豐度呈負相關(guān)，有研究采用IlluminaHiseq技術(shù)檢測了10%低鹽度的辣椒，在發(fā)酵過程中，變形菌門數(shù)量逐漸減少，厚壁菌門成為優(yōu)勢菌門，其中魏斯氏菌屬在開始發(fā)酵的階段起著重要作用，能夠快速積累乳酸達到一個微酸的環(huán)境，從而抑制了低鹽環(huán)境下雜菌的生長，其中假單胞菌和腸桿菌等一些腐敗致病菌也隨著發(fā)酵酸度的增加而減少，隨后乳酸桿菌屬成為優(yōu)勢細菌屬[5]。

1.1.2 發(fā)酵辣椒中的真菌

由于厭氧和酸性條件，發(fā)酵辣椒中的真菌在數(shù)量和種類上明顯少于細菌，主要由隸屬于子囊菌門（Ascomycota）的假絲酵母屬（Candida）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、畢赤酵母屬（Pichia）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）、鏈格孢屬（Alternaria）、枝孢屬（Cladosporium）、曲霉菌屬（Aspergillus）以及隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）的漢納酵母屬（Hannaella）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、紅酵母菌屬（Rhodotorula）等構(gòu)成[6,7]。發(fā)酵過程中的優(yōu)勢真菌以酵母菌為主，在發(fā)酵第三天有孢漢遜酵母屬成為優(yōu)勢菌屬，第七天達到高峰，發(fā)酵20 d后有孢漢遜酵母屬、德巴利氏酵母屬、畢赤酵母成為主要優(yōu)勢真菌[8]。此外，有研究通過Illumina Miseq檢測發(fā)現(xiàn)朝天椒中存在鏈格孢菌和枝孢菌，這可能是辣椒中的內(nèi)生真菌，這類真菌會隨發(fā)酵的競爭抑制而含量下降[9]。

1.2 發(fā)酵辣椒中的微生物檢測方法

1.2.1 PCR-DGGE技術(shù)

起初的一代測序為聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradientgel Electrophoresis，PCR-DGGE），是通過擴增樣品基因組DNA，再利用聚丙烯酰胺凝膠中變性劑濃度梯度的不同，有效分離DNA序列，然后通過測序、相似性比對對菌群指紋圖譜中的條帶進行物種鑒定[10]。有研究用PCR-DGGE技術(shù)對發(fā)酵辣椒樣品中的乳酸桿菌屬進行多樣性物種解析，發(fā)現(xiàn)了植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、耐酸乳桿菌和短乳桿菌等五種菌[11]。該方法成本低、靈敏度高、簡單快速。

1.2.2 高通量測序技術(shù)

近些年，隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測序作為新一代測序技術(shù)，廣泛應用于微生物多樣性的分析。高通量測序分為16S rDNA、18S rDNA和ITS測序，18S rDNA和ITS測序主要應用于樣品中真核微生物的檢測，目前用于檢測發(fā)酵辣椒菌屬最常用的16S rDNA主要是以Illumina中的MiSeq和HiSeq測序平臺以及454焦磷酸測序為主的二代測序[12]。利用Illumina Miseq測序技術(shù)檢測鹽水（0.5%~3.5%鹽度）自然發(fā)酵10 d的辣椒，發(fā)現(xiàn)其中藍藻菌門（40.6%）、厚壁菌門（37.0%）和變形菌門（16.6%）占90%以上[13]，充分揭示了自然發(fā)酵辣椒中的主要細菌門類占比。采用Illumina Hiseq技術(shù)研究可知，魏斯氏菌屬在第三天大幅度增長至62.85%，隨后比例下降，乳酸桿菌屬成為發(fā)酵辣椒中主要的細菌屬，占比76.55%[5]，深入剖析了辣椒發(fā)酵過程中的細菌群落動態(tài)。

1.2.3 宏基因組測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)促進了組學技術(shù)的發(fā)展，相較于高通量測序，宏基因組測序技術(shù)可對每個測序樣本進行功能基因注釋、樣本間差異分析、代謝途徑預測等[12]。利用宏基因組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)，15%~20%鹽度發(fā)酵辣椒中的抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARG(s)）（主要宿主是腸桿菌科）和組氨酸激酶（與耐鹽性相關(guān)）更多[14]，表明高鹽樣本中可能存在更多的腸桿菌菌株，從宏基因組角度建議了消費者選擇低鹽辣椒醬更有利于人體健康。

綜上所述，目前PCR-DGGE技術(shù)、高通量測序技術(shù)、宏基因組測序技術(shù)等是從基因?qū)用嫒鏅z測分析發(fā)酵辣椒中菌群多樣性的常見方法，相較于傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)，能很好地分析不能在培養(yǎng)基上生長的微生物，直觀地體現(xiàn)了發(fā)酵辣椒微生物多樣性。但不同方法之間各有優(yōu)缺點，如PCR-DGGE技術(shù)能夠同時檢測大量發(fā)酵辣椒樣品中的微生物，Li等[15]采用PCR-DGGE技術(shù)同時檢測了九個自然發(fā)酵四個月的辣椒樣品，主要為乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、嗜鹽葡萄球菌屬（Tetragencoccus halophilus）和腸桿菌科等菌群，揭示了發(fā)酵辣椒中的核心菌屬類型，但PCR-DGGE技術(shù)對于豐度較低的物種未檢測出來。而Zhao等[8]用18S rDNA和454焦磷酸測序技術(shù)精確分析了辣椒發(fā)酵過程中的真菌菌群比例變化，其中有孢漢遜酵母屬占比69.25%、畢赤酵母占比8.95%、漢斯德巴氏酵母菌占比6.22%、紅酵母屬（Rhodotorula）占比1.31%、未分類菌屬占比12.23%（＜1%的類群），且毛孢子菌屬從起初的24.11%下降到最小的0.1%，高通量測序技術(shù)對于豐度低于0.000 1%的痕量菌也能夠準確檢出，被廣泛應用于檢測發(fā)酵辣椒中的微生物多樣性。二代測序因檢測區(qū)域的局限性只能鑒定到微生物屬水平，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，目前三代測序可以進行16S rDNA基因全長序列檢測，完成種水平的鑒定。宏基因組測序技術(shù)在定義和算法上還不夠完善，對于數(shù)據(jù)處理技術(shù)要求較高[16]，需要投入大量人力財力，所以目前運用該方法進行發(fā)酵辣椒微生物多樣性及功能基因分析的研究較少。在實際應用中該如何選擇這些檢測方法，需要考慮測序預期達到的種屬水平，是否需要進行功能基因注釋以及性價比等因素。

2 發(fā)酵辣椒中的風味物質(zhì)及其影響因素

2.1 發(fā)酵辣椒中的風味物質(zhì)

2.1.1 發(fā)酵辣椒中的滋味物質(zhì)

發(fā)酵辣椒中的滋味物質(zhì)：有機酸、辣椒素類物質(zhì)、氨基酸態(tài)氮、糖類、鹽等，體現(xiàn)了酸、辣、鮮、甜、咸五種味感。乳酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸等有機酸賦予了發(fā)酵辣椒獨特的酸感，不同有機酸的組成及比例之間的差異導致了酸味的異同，這部分酸味主要來源于乳酸菌、產(chǎn)酸芽孢桿菌等微生物[17]；辣椒素類物質(zhì)隨辣椒的熟化而逐漸降低；氨基酸態(tài)氮在微生物和酶的作用下增多，相關(guān)研究表明，棒狀桿菌可以產(chǎn)生谷氨酸等鮮味物質(zhì)[18]；辣椒本身及加工中添加的糖在發(fā)酵時被消耗而減少；食鹽含量體現(xiàn)了咸味，在發(fā)酵時基本無變化或稍降低（成分滲透釋放水分所致）[19]。

2.1.2 發(fā)酵辣椒中的揮發(fā)性成分

發(fā)酵辣椒中的揮發(fā)性風味物質(zhì)主要來源于不同的辣椒原料以及菌種的代謝產(chǎn)物，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Headspace-Solid Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry，HS-SPME-GC-MS）可檢測出，小米辣椒發(fā)酵90 d后共有66種揮發(fā)性成分，主要為酯類、萜類，分別為28種、17種，其中己酸乙酯、乙酸己酯、庚酸乙酯、β-石竹烯、（Z）-4-癸烯酸乙酯等是該發(fā)酵辣椒特征香氣成分，呈菠蘿香、甜果香、青香等，并表明這些香氣物質(zhì)與辣椒發(fā)酵中的乳酸菌屬和假絲酵母屬有顯著相關(guān)性[20]。張毅等[21]檢測了十五個市售剁辣椒中的風味物質(zhì)，共得出81種風味成分，主要為酯、醇、酸類，結(jié)合電子鼻技術(shù)發(fā)現(xiàn)風味好的剁辣椒中乙酸乙酯、乳酸乙酯以及芳香類等物質(zhì)較高，且乙醇、醋酸以及有機硫化物等的含量偏低?？梢姴煌陌l(fā)酵辣椒樣品中風味物質(zhì)大同小異，對發(fā)酵辣椒香氣貢獻較大的是酯類化合物，主要為發(fā)酵辣椒提供了部分的清香，其次包括醇類、酸類、烯烴類、醛類、烷烴類、酮類等眾多復雜的香氣成分，每種成分所產(chǎn)生的香氣閾值不同，有的成分含量十分低，但閾值高，所以單從相對含量不能完全反映發(fā)酵辣椒風味特征，而是各種物質(zhì)之間相互平衡，它們的協(xié)同作用構(gòu)成了發(fā)酵辣椒的特殊風味。由于發(fā)酵菌種、溫度和時間、鹽度、發(fā)酵的方法以及原料的不同，會使得揮發(fā)性物質(zhì)在種類和含量上產(chǎn)生一定的差異，制備優(yōu)良風味的發(fā)酵辣椒需要考慮這些關(guān)鍵因素。

2.2 影響發(fā)酵辣椒中風味物質(zhì)的因素

2.2.1 發(fā)酵原料

發(fā)酵底物為微生物提供了所需要的代謝物質(zhì)，原料本身富含大量營養(yǎng)物質(zhì)和風味成分，選擇產(chǎn)生風味物質(zhì)較多較好的辣椒品種有利于發(fā)酵辣椒特征風味的形成。通過研究，10%鹽度自然發(fā)酵的朝天椒和線椒中的香氣物質(zhì)分別為74種、36種，證實以朝天椒為原料做剁辣椒，所得的揮發(fā)性成分化合物數(shù)量比線椒更多；其次發(fā)現(xiàn)以朝天椒為原料發(fā)酵4周的剁辣椒主要香氣成分是萜烯烴類、酯類、醛類等，愈創(chuàng)木酚、肉豆蔻醛、反-2-辛烯醛等是主要的特征風味物質(zhì)，以線椒為原料發(fā)酵4周的剁辣椒主要香氣成分為醇類、烯烴類、酮類、酯類等，芳樟醇、乙醇等是主要的特征風味物質(zhì)[22]。發(fā)酵辣椒風味特征雖有類似，但各組分的強度因品種差異而有所不同，如以成都二荊條、貴州黃平縣線椒為原料發(fā)酵辣椒中酯類物質(zhì)含量較高，成都野山椒、小米辣、美人椒、墨西哥辣椒等發(fā)酵以烴類物質(zhì)含量為較高[23]，貴州大方縣皺椒、施秉縣線椒等以醇類物質(zhì)含量較高[24,25]，內(nèi)蒙古北京紅、千斤紅和金塔辣椒等以烯烴類物質(zhì)含量較高[26]，為發(fā)酵辣椒品種的選擇提供了實踐參考。

對于同一品種不同產(chǎn)地的發(fā)酵辣椒，在感官和風味物質(zhì)上也有一定的差異。以陜西、四川、云南等不同產(chǎn)地種植的小米椒為對象，發(fā)酵后四川辣椒的辣椒素含量顯著高于陜西和云南辣椒，發(fā)酵結(jié)束時陜西辣椒的揮發(fā)性成分與種類最多（54種），口感最佳，其中醇類和酯類物質(zhì)含量顯著增加，在第15天達到最大值[27]。此差異性可能是因為不同區(qū)域的地理氣候造成，如豐富的光照可以促進辣椒紅素的積累，充足的降水量有利于辣椒植株的生長和辣椒素的合成，以及土壤所含的磷、氮和鉀等微量元素均影響著辣椒本身風味的形成[26]。有研究證實了不同地區(qū)的農(nóng)家剁辣椒在揮發(fā)性成分上差異顯著，如異己酸乙酯是安化樂安（LA）、懷化洪江（HJ）、寧鄉(xiāng)（NX）剁辣椒主要香氣成分，異戊酸乙酯是安化東坪（DP）剁辣椒中主要香氣成分，2-甲基丁酸是瀏陽（LY）剁辣椒的主要香氣成分，乙酸乙酯是邵陽（SY）剁辣椒主要香氣成分[28]，具有一定的地方特色。

2.2.2 發(fā)酵方法

辣椒發(fā)酵主要分為自然發(fā)酵和接種發(fā)酵兩種，接種發(fā)酵可以明顯縮短辣椒發(fā)酵的時間。同一發(fā)酵時間下，接種發(fā)酵加快了發(fā)酵速率，游離氨基酸含量高于自然發(fā)酵[29]。有研究接種6%的植物乳桿菌發(fā)酵辣椒能快速降低pH值，更快產(chǎn)生較多的有機酸，如乳酸、甲酸、乙酸、蘋果酸等，尤其乳酸含量的大幅度升高，而自然發(fā)酵具有較高含量的檸檬酸和琥珀酸、草酸[30]。檸檬酸作為發(fā)酵辣椒產(chǎn)生青氣味的主要來源之一，在自然發(fā)酵中常因為發(fā)酵時間不夠、發(fā)酵遲緩，導致這類有機酸在未成熟的發(fā)酵辣椒中較高，而在接種發(fā)酵中這類有機酸會被微生物代謝降低，使發(fā)酵辣椒逐漸熟化[31]。

自然發(fā)酵的風味會較為單一，接種發(fā)酵通過菌種代謝可以加強發(fā)酵辣椒中揮發(fā)性物質(zhì)的釋放。研究證明乳酸菌發(fā)酵辣椒的風味物質(zhì)較自然發(fā)酵中多，風味物質(zhì)分別有48種、43種，且乳酸菌發(fā)酵中酮類的種類和含量高于自然發(fā)酵，如2-甲基環(huán)戊酮、3-羥基-2-丁酮、乙酸、水楊酸甲酯等相對含量較多[32]，增添了干酪奶香和果香。

接種發(fā)酵不僅可以提高發(fā)酵辣椒的營養(yǎng)風味品質(zhì)，還可以通過抑制雜菌的生長從而抑制亞硝酸鹽、生物胺等的生成。相關(guān)研究表明，接種植物乳酸桿菌制備的發(fā)酵辣椒，與自然發(fā)酵辣椒相比，pH值和總酸會顯著降低，亞硝酸鹽含量比對照組低15.36%，生物胺含量在接種發(fā)酵中顯著降低，其中組胺和酪胺分別降低了29.98%和35.11%[33,34]。

2.2.3 發(fā)酵菌種

接種不同的菌種，對于發(fā)酵辣椒中風味物質(zhì)的形成起著決定性作用。如同型發(fā)酵菌乳酸鏈球菌、植物乳桿菌等發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸，異型發(fā)酵菌腸膜明串珠菌、短乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌等發(fā)酵糖類可以產(chǎn)生乙醇、乙酸，從而影響著有機酸的積累；發(fā)酵辣椒中的假單胞菌屬與大多數(shù)醛密切相關(guān)，尤其與3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、苯乙醛、2-乙酰吡咯、5-甲基糠醛和5-甲基-2-苯基-2-己烯醛顯著相關(guān)[15]。相關(guān)研究人員通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了發(fā)酵辣椒中的植物乳桿菌、戊糖片球菌、戊糖乳桿菌的產(chǎn)香代謝通路，戊糖片球菌合成乙偶姻、雙乙酰及2,3-丁二醇能力較強，而乙醛、乙酸及脂肪酸代謝相關(guān)基因在戊糖乳桿菌中表達很高，植物乳桿菌具有高產(chǎn)乙醛能力，將其接種于辣椒中，乙偶姻含量高于同期自然發(fā)酵辣椒[35]，使得發(fā)酵辣椒風味更醇厚。

但有研究發(fā)現(xiàn)，接種植物乳桿菌會使發(fā)酵辣椒中的微生物多樣性下降，導致其與多數(shù)揮發(fā)性化合物呈負相關(guān)關(guān)系，使得發(fā)酵辣椒產(chǎn)品風味單一，但乳酸克魯維酵母與植物乳桿菌共發(fā)酵對發(fā)酵辣椒的風味影響很大，其中有24種揮發(fā)性化合物的香氣活度值（Odour Activity Value，OAV）＞1，其中OAV大于100的有12種，乳酸克魯維酵母的加入使發(fā)酵辣椒的感官品質(zhì)得到了提升，乙酸苯乙酯（濃郁的甜香和玫瑰香氣）、2-甲基丁酸乙酯（強烈的蘋果香氣）等是其在發(fā)酵辣椒中的特征風味物質(zhì)[36]。總的來說，目前用于接種發(fā)酵的菌種主要是以不同乳桿菌為優(yōu)勢菌的純種或復配發(fā)酵，輔以添加酵母菌、芽孢桿菌等菌種提高發(fā)酵辣椒風味和改善發(fā)酵品質(zhì)，不同菌種接種發(fā)酵辣椒中的相關(guān)揮發(fā)性香氣物質(zhì)如下表1所示。

表1 不同菌種接種發(fā)酵辣椒中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)Table 1 Main volatile compounds in fermented pepper inoculated with different strains

此外，不同菌純種發(fā)酵在產(chǎn)酸量、抑菌性、亞硝酸鹽含量以及產(chǎn)γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）能力等方面也有所差異，如發(fā)酵乳桿菌與食果糖乳桿菌的產(chǎn)酸量最高，乳鏈球菌和戊糖乳桿菌抑菌效果最好，食果糖乳桿菌與乳酸片球菌產(chǎn)GABA能力最強，純種接種乳酸菌亞硝酸鹽含量均低于空白組，乳酸片球菌產(chǎn)亞硝酸鹽含量最低，為1.7 mg/kg[37]，該研究在發(fā)酵辣椒菌種的選擇和品質(zhì)穩(wěn)定性上提供了實驗基礎(chǔ)。

2.2.4 發(fā)酵鹽度

添加的鹽度過低會導致風味不足，過高則澀味明顯。采用HS-SPME-GC-MS分析不同鹽度發(fā)酵辣椒中的風味物質(zhì)，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)：10%鹽度（22種）＞15%鹽度（21種）＞20%鹽度（18種）＞25%鹽度（15種）[44]，可見鹽度越高揮發(fā)性風味物質(zhì)種類越少，其中二甲基硫醚、乙酸正丙酯、丙醇、2-丙烯-1-醇等是10%鹽度發(fā)酵辣椒中獨有的揮發(fā)性成分，感官評價表現(xiàn)為酸甜香，風味品質(zhì)突出，而15%鹽度發(fā)酵辣椒體現(xiàn)在色澤較好、醬香濃郁，20%~25%鹽度發(fā)酵辣椒則鮮咸味較為突出，可能是因為食鹽可與氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸作用形成鈉鹽，增強了發(fā)酵辣椒鮮味[45]。發(fā)酵作用隨鹽度的增加而變得緩慢，食鹽的添加量決定著發(fā)酵辣椒中微生物的數(shù)量和種類，是影響風味物質(zhì)形成的關(guān)鍵因素之一，研究表明不同鹽度（5%、10%、15%、20%）辣椒發(fā)酵一個月，酸類物質(zhì)相對含量高低順序為5%鹽度（4.94%）＞10%鹽度（2.56%）＞15%鹽度（2.55%）＞20%鹽度（2.02%），20%高鹽發(fā)酵辣椒中酸類物質(zhì)較低，但隨發(fā)酵時間的延長也有所增加，存在輕微的發(fā)酵作用[46]。

傳統(tǒng)的發(fā)酵辣椒是以高鹽高滲環(huán)境、酸性環(huán)境、厭氧環(huán)境抑制微生物生長為主，當添加食鹽量大于20%以上時，是一種發(fā)酵非常緩慢的腌漬方法。食鹽質(zhì)量分數(shù)高會抑制乳酸菌和部分微生物的生長發(fā)酵，隨著發(fā)酵辣椒食鹽質(zhì)量分數(shù)的增加，總酸和有機酸含量下降，且發(fā)酵辣椒食鹽質(zhì)量分數(shù)越高，揮發(fā)出的乙醇越多[47]。這與蔣立文等[48]研究的高鹽辣椒品質(zhì)結(jié)果一致，其表明醇類、酯類是構(gòu)成高鹽辣椒（16%~29%）主要香氣物質(zhì)，酸類、醛類和酮類物質(zhì)含量均較低，乙醇含量超過總香氣物質(zhì)的一半以上，可能與酵母菌和耐鹽微生物發(fā)酵有關(guān)；如酵母菌可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙醇和二氧化碳外，還能產(chǎn)生甘油、戊醇、異戊醇、丁醇、異丁醇等醇和各種酯類[49]。高鹽和乙醇的生成起到了抑制雜菌的生長，避免了產(chǎn)酸過多，防止辣椒品質(zhì)變差，增強了辣椒制品的耐藏性。

2.2.5 發(fā)酵時間

隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵辣椒中的風味物質(zhì)如辣椒素、有機酸、還原糖、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性香氣等，會在微生物和酶的作用下而變化[50]。如辣椒素含量的下降，可能與發(fā)酵過程中鏈格孢菌受乳酸菌產(chǎn)酸抑制有關(guān)，鏈格孢菌是一類能產(chǎn)生辣椒素的辣椒內(nèi)生真菌[51]，而辣椒素又是一種堿性物質(zhì)，隨著有機酸的生成逐漸被中和，使得最終發(fā)酵的產(chǎn)品變得柔和、誘人、不那么刺鼻[52]。

大多數(shù)乳酸菌具有產(chǎn)生乳酸或乙酸的能力，有研究將10%鹽度紅辣椒在30 ℃暗處發(fā)酵32 d，經(jīng)高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測發(fā)現(xiàn)，乙酸占總有機酸的43.37%[53]，可能是自然發(fā)酵過程中異型乳酸發(fā)酵菌和酵母菌為優(yōu)勢菌產(chǎn)生，蘋果酸和草酸含量隨發(fā)酵時間先上升后下降，而檸檬酸的含量則呈波動趨勢，檸檬酸和蘋果酸可能來自曲霉屬和酵母菌屬，菌群之間相互作用導致了有機酸在發(fā)酵過程中不斷變化。發(fā)酵過程中有機酸的釋放不僅會降低pH值，還可參與乳酸乙酯、乙酸乙酯和其他芳香化合物的形成，也是導致部分有機酸含量變化的原因之一[31]。

發(fā)酵24 d的辣椒經(jīng)頂空-氣相色譜-離子遷移譜（Headspace-gas Chromatography-Ion Mobility Spectrometry，HS-GC-IMS）檢測發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵的進行，己酸異戊酯、辛酸甲酯、γ-丁內(nèi)酯、苯乙醛、甲磺酸和E-2己烯醇含量明顯減少，可能是發(fā)酵酸度的升高使得這些酯類水解，2-甲基丁酸、2-甲基丙酸、芳樟醇、乙醇和乙酸乙酯等揮發(fā)性化合物增加[54]，減少了辛辣刺激味的同時增加了菠蘿果香、花香氣味。相關(guān)分析表明，畢赤酵母屬可產(chǎn)生2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、苯乙醇和亞油酸乙酯等酸、醇、酯類風味物質(zhì)，產(chǎn)生的甜香可以顯著改善發(fā)酵辣椒質(zhì)量[8]。

以二荊條辣椒作為原料發(fā)酵40 d，該發(fā)酵辣椒的pH值隨發(fā)酵時間從5.21降至3.81，總酸含量隨發(fā)酵第0天的4.53 g/kg升高到第40天的7.86 g/kg，亞硝酸鹽含量從開始時的35.10 mg/kg降到第40天的7.54 mg/kg[55]。還有研究利用嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌于辣椒中25 ℃發(fā)酵15 d，發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽的含量在發(fā)酵末期含量遠低于國家標準，但在第7天時達到峰值，呈先上升后下降的趨勢[56]；因此，確定發(fā)酵終點時，應綜合考慮滋味物質(zhì)的累積、揮發(fā)性風味物質(zhì)的形成以及亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的含量。

2.2.6 發(fā)酵溫度

溫度的高低主要影響發(fā)酵菌種的生長活性，從而間接影響發(fā)酵辣椒風味物質(zhì)的形成。經(jīng)研究，乳桿菌在先高溫后低溫發(fā)酵模式（35 ℃ 5 d~30 ℃ 5 d~25 ℃5 d）發(fā)酵效果最好，其中pH值和酸度下降趨勢較明顯，由于前期35 ℃較25 ℃更適合乳桿菌生長發(fā)酵，使得乳酸菌快速成為優(yōu)勢菌，在前3天pH值就降到了3.4，第15天亞硝酸鹽含量最低，維生素C含量最高，而先低溫后高溫發(fā)酵模式（25 ℃ 5 d~30 ℃5 d~35 ℃ 5 d）第12天才達到成熟要求[57]。發(fā)酵的溫度會直接影響微生物體內(nèi)的酶活力及生長代謝，應根據(jù)菌種特性，選擇合適的發(fā)酵溫度才有利于風味物質(zhì)的形成。

3 總結(jié)與展望

國內(nèi)外集中對發(fā)酵辣椒中的微生物多樣性及其風味物質(zhì)進行了研究分析，雖然取得了一些成績，但目前發(fā)酵辣椒主要集中在傳統(tǒng)手工制作或工業(yè)化風味調(diào)配、高鹽發(fā)酵辣椒（微發(fā)酵辣椒）的生產(chǎn)較多，未見菌種應用于發(fā)酵辣椒制品大規(guī)模生產(chǎn)的相關(guān)報道，菌種的應用生產(chǎn)還需要綜合考慮菌種選擇、菌制劑制備以及生產(chǎn)成本、運輸儲存等問題，希望在今后的研究中能得到應用技術(shù)上的突破。

其次，高鹽發(fā)酵辣椒加工后脫鹽處理會產(chǎn)生大量的鹽漬辣椒水，通常以廢液的形式排放，不僅對環(huán)境造成了嚴重的污染，還造成了辣椒本身營養(yǎng)物質(zhì)的損失以及食鹽的浪費。另外，經(jīng)高鹽腌漬的辣椒水洗脫鹽后風味物質(zhì)損失嚴重，需要再次使用添加劑調(diào)配風味。因此，在保護環(huán)境安全、減小水資源浪費、節(jié)約成本和保證風味品質(zhì)的基礎(chǔ)上，選擇中低鹽度發(fā)酵辣椒是辣椒加工技術(shù)發(fā)展的方向和重點。

此外，目前接種發(fā)酵主要集中在菌種調(diào)配、工藝優(yōu)化、感官影響、風味物質(zhì)檢測等方面的研究，未來可以從基因組、代謝組、轉(zhuǎn)錄組的角度，研究不同辣椒品種發(fā)酵、不同菌之間的配比變化等，對發(fā)酵辣椒中揮發(fā)性風味產(chǎn)生的直接影響。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析不同發(fā)酵辣椒樣品mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，研究特定生物學過程中差異基因的表達情況并通過軟件進行功能注釋，進一步了解不同菌株在代謝途徑中相關(guān)基因的表達情況，結(jié)合多組學聯(lián)用對代謝產(chǎn)物進行比較分析，從而深入解析微生物共生互作產(chǎn)生風味物質(zhì)的機制，為開發(fā)菌種強化發(fā)酵和精準調(diào)控發(fā)酵辣椒風味品質(zhì)提供重要依據(jù)。