小腸結腸炎耶爾森氏菌分子生物學檢測技術研究進展

鐘月明，王涓，丁郁，吳清平，張菊梅，劉鳴，汪智

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642）（2.廣東省科學院微生物研究所，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省微生物安全與健康重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物組學與精準應用重點實驗室，廣東廣州 510070）（3.暨南大學理工學院食品科學與工程系,廣東廣州 510632）

小腸結腸炎耶爾森氏菌是一種革蘭氏陰性桿菌或球桿菌[1]，主要存在于牛奶及奶制品[2]、生肉[3]、家禽[4]、雞蛋[5]、蔬菜和海鮮[6]中，具有“嗜冷性”，是在冷藏溫度下能生長的少數(shù)致病菌之一[7]。同時，小腸結腸炎耶爾森氏菌是一種胃腸道病原體，經(jīng)食物、水感染人類后可導致耶爾森氏菌病。這種致病菌的感染，不僅是導致人胃腸道疾病的因素之一，而且對呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼結締組織等相關疾病的發(fā)生和發(fā)展也有一定的影響，有時也會導致敗血癥，甚至死亡[8]。2020年，歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）和歐洲疾病預防和控制中心（European Centre for Disease Prevention and Control，ECDC）有關耶爾森氏菌的報告指出，該致病菌所引起的耶爾森氏病是僅次于彎曲桿菌和沙門氏菌感染病的第三大最常見的人畜共患性疾病[9]。此外，本研究團隊對我國食源性致病菌流行和污染的長期監(jiān)測結果表明，小腸結腸炎耶爾森氏菌在全國多地的零售食品均有檢出[10,11]，應當引起大家重點關注。

小腸結腸炎耶爾森氏菌按照生化鑒定分為六種生物型，分別是1A、1B、2、3、4和5。除了第一種生物型1A以外，其他五種生物型的菌株均含有攜帶重要毒力基因的毒力質粒（pYV）。最常見的染色體編碼毒力決定簇是ail，參與抵抗人類血清殺傷的抗性；ystA和ystB編碼的酸熱穩(wěn)定腸毒素，可能會引起腹瀉；inv對入侵宿主細胞至關重要[12]。另外，基于常規(guī)血清型分型，已鑒定出70多種小腸結腸炎耶爾森氏菌的血清型；基于脂多糖可鑒定常見的五種血清型分別是O:1,2、O:3、O:5、O:8、O:9，部分血清型如O:3、O:8、O:9被認為與人類疾病密切相關[13]。

目前，小腸結腸炎耶爾森氏菌的現(xiàn)有檢測方法主要依賴生化反應，具體檢測產(chǎn)品包括生化鑒定管、API鑒定試紙條等。常規(guī)檢測方法主要是參照食品安全國家標準《食品微生物檢驗》GB 4789.8-2016進行分離鑒定[14]。雖然常規(guī)的分離鑒定方法仍然是目前檢測該菌的主要方法，但是檢測過程耗時費力（大約1周），而且不能準確地確定分離株是否具有致病性。此外，當病原體濃度較低時很難在復雜的樣品環(huán)境中檢測到。為了克服這些局限性，急需開發(fā)出更快速、靈敏、特異的分子生物學手段對小腸結腸炎耶爾森氏菌進行檢測[12]。現(xiàn)在的分子生物學檢測方法主要是基于小腸結腸炎耶爾森氏菌分子檢測靶標來進行方法構建。已報道的小腸結腸炎耶爾森氏菌核酸檢測靶標主要分為兩類：一類是基于毒力基因的致病性小腸結腸炎耶爾森氏菌檢測靶標，包括ail[15]、ystA、ystB、inv[16]和outL[17]；另一類是基于保守基因的小腸結腸炎耶爾森氏菌種檢測靶標包括16S rDNA[18]、tufA[19]、foxA[20]、phop[21]、gyrB[22]和FR729477 locus[23]。

本文將圍繞近幾年小腸結腸炎耶爾森氏菌基于多種檢測靶標的分子生物學檢測方法進行綜述（圖1），旨在為該致病菌即時檢驗（Point-of-Care Testing，POCT）的后續(xù)研究及發(fā)展提供理論依據(jù)和技術支持。

圖1 小腸結腸炎耶爾森氏菌分子生物學檢測技術的示意圖Fig.1 Schematic diagram of the molecular biology detection technology of Y.enterocolitica

1 變溫擴增技術

1.1 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是對特定區(qū)域DNA片段進行擴增的分子生物學技術[24]。它的最顯著的特征是能夠大規(guī)模地復制微量DNA，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便等特點。鄭宇等[32]基于小腸結腸炎耶爾森氏菌靶標foxA、ail、ystA、ystB建立一種多重檢測方法，并成功利用單重PCR方法和所建立的多重PCR方法對145份實際樣品進行檢測和分析。Bui等[15]利用多重PCR方法基于4種檢測靶標（fyuA、ail、inv和virF）鑒別小腸結腸炎耶爾森氏菌致病性強弱。除鑒別該菌的致病性外，Rusak等[19]基于靶標rfbC構建雙重PCR方法來快速鑒定小腸結腸炎耶爾森氏菌血清型O:3，這極大縮短了鑒定血清型的時間。相比于分離純化和生化鑒定方法，雖然多重PCR方法能提高檢測效率，但是該檢測結果需要經(jīng)過繁瑣的電泳分析，且靈敏度有待進一步提高。

1.2 實時熒光PCR技術

熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）是利用特定熒光染色或熒光標記技術實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物，通過計算樣品模板濃度，達到定量的目的[25]。為了實時監(jiān)測小腸結腸炎耶爾森氏菌，國際ISO標準（ISO 10273:2017）規(guī)定了使用實時熒光PCR技術用于檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌[33]。Foley等[16]基于靶標yadA、ystB和inv通過多重qPCR熔解曲線分析檢測不同生物型的小腸結腸炎耶爾森氏菌，用于605個臨床樣本檢測，準確率達到99%。Shi等[34]基于抗OmpF抗體-免疫磁珠捕獲該菌（捕獲率達到80%），結合靶標foxA建立qPCR技術，能夠檢測人工污染豬肉樣品中的小腸結腸炎耶爾森氏菌，靈敏度低至64 CFU/g。Liu等[35]基于多重qPCR定量檢測包括小腸結腸炎耶爾森氏菌在內(nèi)的12種常見病原體，結果表明不同病原體之間無交叉反應，能同時快速檢測多個病原菌，具備高通量檢測的潛力。目前基于小腸結腸炎耶爾森氏菌qPCR檢測大多使用是熒光染色法（SYBR Green I）進行檢測。該方法可與所有雙鏈DNA結合，因此可能無法辨別出PCR產(chǎn)物中存在的引物二聚體等，從而給實驗結果帶來誤差。未來，研究人員可通過小腸結腸炎耶爾森氏菌檢測靶標來設計適用于qPCR檢測的特異性熒光探針。

1.3 數(shù)字PCR

為了提高檢測的靈敏度，數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）逐漸進入大眾的視線，該反應體系能夠實現(xiàn)核酸的絕對定量分析[26]。該技術將單個DNA分子分布到孤立的反應中，擴增后可以檢測和分析帶有熒光信號的產(chǎn)物。Cristiano等[36]利用qPCR和ddPCR用于評估小腸結腸炎耶爾森氏菌在不同溫度下孵育11 d中污染綠葉蔬菜中的檢測率，通過比較兩種方法，結果只有ddPCR可以在以低于1 log CFU/g接種的樣品中檢測到，說明ddPCR靈敏度遠遠優(yōu)于其它檢測方法。但常規(guī)PCR、qPCR、ddPCR等檢測方法往往需要專業(yè)的檢測儀器，因此這些方法通常只用于實驗室檢測，不能廣泛應用于現(xiàn)場檢測。

1.4 基于變溫擴增的生物傳感器

以往報道顯示，結合變溫擴增和芯片的檢測技術可以實現(xiàn)高通量可視化檢測。胡瑞[27]將PCR反應變性后的單鏈產(chǎn)物與芯片上的熒光微球探針結合，利用兩束激發(fā)光對待測物進行檢測，結合軟件分析即可直接獲得檢測結果，建立了對小腸結腸炎耶爾森氏菌等四種病原菌xMAP（Flexible Multi-Analyte Profiling）液態(tài)芯片方法。該檢測技術能夠對單通道多反應同時檢測，具有多重、重復性好以及檢測動態(tài)范圍寬等優(yōu)點。趙金毅[37]將PCR反應變性后的單鏈產(chǎn)物與芯片表面探針雜交之后，利用辣根過氧化酶（HRP）催化形成沉淀在芯片表面發(fā)生沉積，通過芯片顏色變化分析檢測結果，建立了包括小腸結腸炎耶爾森氏菌在內(nèi)的9種食源性致病菌的可視化基因芯片檢測技術。該技術具有準確、高通量等特點。為了解決芯片制備成本高且檢測過程繁瑣等缺點，張宏偉等[38]利用PCR結合試紙條建立了一種快速檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢測方法。結果表明該檢測體系靈敏度高（檢測限為100CFU/mL），準確快速，可用于樣品快篩。目前針對小腸結腸炎耶爾森氏菌的芯片制備技術尚未成熟，所以該檢測技術未能廣泛推廣使用。

2 等溫擴增技術

2.1 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一種靈敏度高、反應速度快、不受熱循環(huán)儀器限制的恒溫擴增技術[39,40]。該技術能針對靶基因的六個區(qū)域設計四種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，僅需15～60 min就能夠將核酸的擴增量達到原來的109～1010倍[41,42]。Ranjbar等[23]基于新挖掘檢測靶標FR729477 locus建立LAMP檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌的方法，結果表明該方法比PCR的靈敏度高10倍。徐云明等[43]基于靶標outL建立一種能夠肉眼可視化檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌的LAMP方法。該檢測體系只需增菌1 h，加標雞肉檢測限為700 CFU/g。雖然LAMP具有很多優(yōu)點，但該反應體系的配制對環(huán)境條件要求嚴格，需要在無菌的超凈臺中操作，否則會因為氣溶膠而導致假陽性，而且LAMP無法進行多重擴增，這限制了其在高通量檢測方面的發(fā)展[28]。

2.2 滾環(huán)擴增技術

滾環(huán)擴增（Rolling Circle Amplification，RCA）是能在DNA聚合酶的催化下使用環(huán)狀模板生成數(shù)千個重復的DNA序列[44,45]。與變溫核酸擴增相比，RCA更適合現(xiàn)場檢測[46]。張建等[31]用核酸外切酶Ι將小腸結腸炎耶爾森氏菌靶標16S rDNA序列由雙鏈變成單鏈，然后鎖式探針與模板單鏈結合延伸一周后，再進行下一個延伸。第二個延伸過程是在phi29聚合酶鏈置換條件下進行的，從模板上將擴增產(chǎn)物置換出來，用于擴增信號的檢測，進而實現(xiàn)對小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢測。該方法在穩(wěn)定性、特異性和靈敏度方面具有明顯優(yōu)勢，具有很高的應用價值。與此同時，RCA也具有一定的應用弊端，即成本高、對實驗人員的技術門檻要求高等[47]。主要原因是：①鎖式探針直接合成成本以及phi29聚合酶成本高；②在實驗的過程中，實驗人員需要優(yōu)化反應體系，以減少未成環(huán)鎖式探針和未結合探針的模板所產(chǎn)生的背景信號對實驗結果的影響。

2.3 重組酶聚合酶擴增

重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）主要有3種酶參與反應。1、重組酶：其主要作用是結合引物并對同源區(qū)域進行識別；2、單鏈結合蛋白：它能夠結合置換出來的單鏈，以便于后續(xù)反應；3、DNA聚合酶：該酶能夠在常溫下催化延伸反應，以生成新的DNA鏈[48,49]。目前，該擴增技術所需的引物以及對應的反應條件，還需要實驗人員進行摸索、設計和優(yōu)化，適用于RPA技術的相關軟件還有待于進一步開發(fā)。劉婧文等[49]建立的實時熒光RPA技術，具有成本低，操作簡單，不受人員、儀器、場地等人為和環(huán)境因素限制的特點，為致病小腸結腸炎耶爾森氏菌快速初篩定性檢測提供了數(shù)據(jù)支持和新的方向[50]。鄭宇[29]將SYBR Green I和RPA結合熒光可視化檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌，構建了基于量子點檢測探針的RPA結合試紙條檢測體系，將該菌在實際樣品中的檢測也實現(xiàn)體溫觸發(fā)和快速可視化。此外，核酸等溫擴增方法可通過結合不同方法實現(xiàn)信號放大，Xiao等[51]建立基于靶標ail的CRISPR/Cas12a-RPA體系來檢測生豬肉中的小腸結腸炎耶爾森氏菌，檢測限為1.7 CFU/mL，比qPCR靈敏100倍。本實驗室此前成功開發(fā)了基于CRISPR/Cas12a的檢測體系用于單增李斯特菌的檢測[52,53]。

3 總結與展望

目前已報道的可用于小腸結腸炎耶爾森氏菌檢測的方法有傳統(tǒng)培養(yǎng)法，免疫學和分子生物學方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)法（例如使用CIN-1和改良Y瓊脂培養(yǎng)基）對小腸結腸炎耶爾森氏菌進行鑒定，但這些方法繁瑣、耗時、無法快速鑒定菌株是否具有毒性。而免疫學檢測方法中所需特異性單克隆抗體制備過程周期長、成本高。因此，通過使用分子生物學方法來檢測小腸結腸炎耶爾森氏菌成為主流。

在分子生物學檢測方面，除了PCR、qPCR和LAMP檢測方法較為成熟外，ddPCR、RPA、RCA、變溫擴增的生物傳感器等方法都有很好的應用前景，尤其是針對小腸結腸炎耶爾森氏菌的快速便攜式檢測，已開發(fā)的檢測方法匯總于表1。值得注意的是目前該菌的檢測和鑒定方法往往側重于檢測已知的致病菌株，而往往忽略生物型1A菌株。然而，生物型1A的菌株還存有潛在的未知風險，在檢測過程中故意忽視可能導致調查或診斷結果出現(xiàn)偏差。因此建立基于特異性分子靶標的小腸結腸炎耶爾森氏菌快速檢測方法是十分必要的。

表1 總結和比較小腸結腸炎耶爾森氏菌的分子生物學檢測方法Table 1 Summary and comparison of molecular bioassays for Y.enterocolitica

此外，開發(fā)針對小腸結腸炎耶爾森氏菌血清型的檢測方法也尤為重要。目前常用的血清型分型方法是玻片凝集法。然而，該方法需要5～8 d才能確定血清型，極大地阻礙了其應用。為了克服傳統(tǒng)診斷血清型方法的不足，基于分子生物學檢測方法已被開發(fā)，但仍存在一定局限性。例如血清型靶標覆蓋率不高，因此還有更多小腸結腸炎耶爾森氏菌的血清型靶標有待開發(fā)。

針對小腸結腸炎耶爾森氏菌的檢測已有較多檢測方法的報道，但現(xiàn)有檢測方法存在普遍問題有：檢測設備昂貴、靈敏度不足、樣品預處理復雜等。這些方法的不足就導致對大量且復雜的食品樣品難以有效監(jiān)測。因此現(xiàn)有的小腸結腸炎耶爾森氏菌檢出率可能被低估。

未來小腸結腸炎耶爾森氏菌分子生物學檢測的研究重點是種靶標和血清型靶標挖掘、新檢測方法的開發(fā)驗證。以期克服上述不足的同時為相關食品生產(chǎn)、零售和監(jiān)管提供可切實可行的技術基礎。