基于SmartChip HT-qPCR分析不同食品中抗生素抗性基因的多樣性及豐度

陳亞波，譚貴良，胡燕玲，金倩儀，朱爽，孟嫚，邱雨薇，李雪雁

（1.中山市食品藥品檢驗所，廣東中山 528437）（2.電子科技大學中山學院，廣東中山 528402）（3.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東廣州 510006）（4.廣東利誠檢測技術有限公司，廣東中山 528436）

抗生素是指由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產(chǎn)物或人工合成的類似物。抗生素對微生物的生長和代謝活動有較強的抑制作用，其在低濃度下就可在一定程度上抑制甚至殺死其他微生物[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計，2020年我國農(nóng)用抗生素產(chǎn)量達到23.14萬t，預計2022年我國農(nóng)用抗生素產(chǎn)量達23.86萬t。然而抗生素的過量或長期低劑量的使用會使微生物產(chǎn)生耐藥性[2]，導致抗生素抗性基因（Antibiotics Resistance Genes，ARGs）的產(chǎn)生和傳播[3]。

ARGs被認定為21世紀新型污染物[4]，它廣泛存在于人類、動物體內(nèi)以及復雜的環(huán)境中。ARGs可通過各種可移動遺傳元件（Mobile Genetic Elements，MGEs）如整合子、轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒等，通過水平基因轉(zhuǎn)移（Horizontal Gene Transfer，HGT）的方式，轉(zhuǎn)移到其它環(huán)境細菌和致病菌中[5]，對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成潛在威脅。目前針對ARGs的大多數(shù)研究主要集中在土壤、飲用水、醫(yī)院和生活污水等環(huán)境領域[6-8]，對于食品領域中ARGs的研究報道相對較少。在食品領域，已有的研究大都基于普通PCR或傳統(tǒng)熒光定量PCR（q-PCR）檢測食品中的ARGss。研究發(fā)現(xiàn)，在蝦、魚和貝類等水產(chǎn)品中可檢出磺胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類ARGs（如tetA、tetB、tetM、sul Ⅱ、floR、aphA-1、aadA、ermB、cmlA）[9]；在發(fā)酵乳制品中可檢出tetO、ermB、cat等22種常見ARGs[10]；在肉類、水產(chǎn)品、蔬菜和水果中可檢出11個ARGs[11]；在畜禽養(yǎng)殖場周邊蔬菜地生食蔬菜可檢出磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類、喹諾酮類4類ARGs[12]。最近，也有報道采用宏基因組測序方法研究了商品腐乳[13]、辣椒醬[14]以及牛奶和牛奶生產(chǎn)環(huán)境[15]中ARGs的分布和豐度。與前者不同，后者宏基因組測序方法屬于高通量方法，不需要專門針對具體ARGs的種類設計引物，可檢測出超過150種ARGs[15]。對更多的食品及環(huán)境中多種ARGs的檢測分析，是當前以及今后一個重要的研究方向。

SmartChip定量PCR系統(tǒng)是美國WaferGen Biosystems公司推出的一款高密度、納升級別的高通量實時定量PCR系統(tǒng)（High-Throughput qPCR，HT-qPCR）[16]。一張SmartChip包含5 184個微孔，一次運行可同時完成多達5 184個獨立的擴增反應。該系統(tǒng)廣泛應用于基因表達定量、基因分型等研究領域。特別是近年來SmartChip定量PCR系統(tǒng)在環(huán)境領域中ARGs的研究備受關注，研究涉及土壤[17]、豬糞施肥下的水稻和小麥葉片[16]，土壤及蔬菜[18]，最近也開始陸續(xù)應用于即食沙拉[19]、海鱸[20]等食品安全領域研究。但是對于采用HT-qPCR同時分析不同類型食品中ARGs的研究至今未見報道。

考慮到ARGs對人體健康的潛在風險，更全面的評估不同食品中的ARGs多樣性及豐度顯得尤為必要。因此，本研究針現(xiàn)有研究不足，采用SmartChip HT-qPCR方法，使用296對引物對水產(chǎn)品、發(fā)酵食品、肉類、蔬菜的285個ARGs和10個MGEs標記基因進行定量分析，旨在探究這些食品中ARGs和MGEs的分布特征，為潛在的食品安全風險分析提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

分為水產(chǎn)品、發(fā)酵食品、肉類、蔬菜四大類，共15個樣品。其中水產(chǎn)品樣品2個（海鱸，AP-SB-2；草魚，AP-WA-2）、發(fā)酵食品2個（黃豆醬，F(xiàn)-HDJ7；發(fā)酵火腿，F(xiàn)-HT1）、肉類3個（牛肉，M-BE-2；鴿子肉，M-DO-2；豬肉，M-PO-2）、蔬菜8個（大白菜，V-CA-3；香菜，V-CI-3；生菜，V-CL-2；生菜，V-CL-3；枸杞葉，V-CWL-3；萵苣，V-LE-2；番茄，V-TO-2；白蘿卜，V-TU-2）。上述樣品取自中山市的菜市場、海鮮市場和超市，于2 h內(nèi)運送至實驗室。

1.2 主要儀器與設備

SmartChip Real-time PCR系統(tǒng)，美國WaferGen Biosystems；Milli-Q Integral 3 System純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；高速冷凍離心機，德國Sigma公司；均質(zhì)器，西班牙IUL公司，組織勻漿儀，美國MP公司；Qubit 2.0熒光計，美國Invitrogen公司。

1.3 樣品前處理

處理樣品前，將所有器具包括砧板、解剖刀、剪刀、鑷子、研缽等進行滅菌處理；樣品解剖過程帶無菌乳膠手套。

（1）魚樣：取解凍后的魚清洗表面，用解剖刀分離出肉及內(nèi)臟。取約25 g肉或內(nèi)臟放入帶側(cè)濾的一次性無菌均質(zhì)袋中稱重，加入10倍體積0.1%（m/V）蛋白胨水，放入拍打式均質(zhì)器中拍打2 min～3 min；用無菌移液管吸出濾液，于-80 ℃保存以備下一步提取DNA。

（2）畜禽肉：取解凍后的樣品，清洗表面，取約25 g肉或內(nèi)臟放入帶側(cè)濾的一次性無菌均質(zhì)袋中稱重，加入10倍體積0.1%（m/V）蛋白胨水，放入拍打儀拍打2 min～3 min；用無菌移液管吸出濾液，于-80 ℃保存以備下一步提取DNA。

（3）蔬菜：方法1：用研缽研磨或用剪刀剪碎樣品，取約25 g左右樣品放入帶側(cè)濾的一次性無菌均質(zhì)袋中稱重，加入10倍體積0.1%（m/V）蛋白胨水。放入拍打儀拍打2 min～3 min；用無菌移液管吸出濾液，于-80 ℃保存以備下一步提取DNA。方法2：取蔬菜日?？墒秤貌糠?，經(jīng)無菌水清洗后，稱量按葉菜類1:4、根莖類1:1的比例加入0.1%（m/V）蛋白胨水，浸泡30 min后超聲5 min，將上清用0.22 μm濾膜抽濾，用無菌剪刀剪碎濾膜以備下一步提取DNA。

（4）發(fā)酵食品：直接取0.5 g樣品，進行下一步DNA提取。

1.4 總DNA的提取

采用EZNA? Mag-Bind Food DNA kit （Omega Bio-Tek, Inc., Norcross, GA，美國）提取樣品中的總DNA，每個樣3個重復。DNA濃度和質(zhì)量采用Qubit 2.0進行測定和評估，提取的DNA保存于-20 ℃，以備后續(xù)分析。

1.5 ARGs和MGEs的高通量測定

抗生素抗性基因檢測使用SmartChip高通量熒光定量PCR系統(tǒng)完成，該系統(tǒng)每次能夠并行5 184個納升級qPCR反應。本次實驗中共設置296對引物，其中285對抗性基因引物、10對可轉(zhuǎn)移基因引物對（包括2對Ⅰ類整合酶基因、8對轉(zhuǎn)座酶基因）、1對細菌通用16S rRNA基因內(nèi)參引物。高通量熒光定量PCR擴增體系的體積為100 nL，其反應體系為：1×LightCycler 480 SYBR Green IMaster、500 nmol/L each primer、DNA模板2 ng/μL。PCR反應混合液先使用納升級多樣品點樣儀（MSND）的16（Samples）×296（Assays）模式加入到微孔芯片中，隨后在cycler上進行qPCR反應，共運行3張芯片。PCR反應程序為：預變性95 ℃，10 min；接著95 ℃變性30 s、60 ℃退化30 s，共40個循環(huán)。使用儀器的qPCR軟件對qPCR結(jié)果進行自動分析。檢測閾值Ct=31，每個樣品進行3次技術重復，至少2次技術重復都擴增出來則被認為目的基因在該樣品中有檢出。做相對定量時，作圖數(shù)據(jù)采用Relative copy number=Copy(gene)/Copy(16S)，其中Copy(gene)和Copy(16S)均來自同一樣品。其中，Copy=10(31-CT)/(10/3)。將Relative copy number×106，然后取以10為底的對數(shù)值，進行熱圖繪制。采用利用R package pheatmap（版本1.0.8）繪制聚類熱圖。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)整理，采用GraphPad Prism 8進行柱狀圖作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARGs和MGEs的多樣性

在所有檢測的樣品中，共檢測到9個大類的抗生素抗性基因（圖1），分別是氨基糖苷類（Aminoglycoside）、β-內(nèi)酰胺類（Beta-Lactamase）、氯霉素類（Chloramphenicol）、大環(huán)內(nèi)酯-林可霉素-鏈陽霉素類（Macrolide-Lincosamide-Streptogramin B，MLSB）、多重耐藥類（Multidrug），磺胺類（Sulfonamide）、四環(huán)素類（Tetracycline）、萬古霉素（Vancomycin）以及其他類。其中，樣品F-HDJ7（黃豆醬）、V-CA-3（大白菜）、V-CI-3（香菜）、V-CL-3（生菜）和V-CWL-3（枸杞葉）檢出的ARGs較多，分別檢測出ARGs 161個、136個、165個、128個和182個。這些樣品中檢測到的ARGs數(shù)量與前人在即食沙拉樣品到的大致相同（156個）[19]。上述15個樣品共檢出ARGs亞類（指具體的ARG）234個（氨基糖苷類33個，β-內(nèi)酰胺類45個，氯霉素類3個，多重耐藥類45個，MLSB 33個，磺胺類6個，四環(huán)素類36個，萬古霉素類21個、其他類12個以及移動基因元件10個（IS613、Tp614、cIntI-1(class1)、intI-1(clinic)、tnpA-01、tnpA-02、tnpA-03、tnpA-04、tnpA-05、tnpA-07）（表1）。

表1 樣品中的MGEs分布Table 1 The diversity of MGEs

圖1 不同樣品中ARGs的數(shù)量及多樣性Fig.1 Numbers and diversity of ARGs detected in various samples

細菌可以通過可移動遺傳元件（MGEs）如整合子、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒的水平基因轉(zhuǎn)移而獲得ARGs[5]，從而使得該菌獲得抗生素抗性。MGEs是部分ARGs的攜帶載體，在ARGs的水平轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用，其轉(zhuǎn)移不但可以發(fā)生在同一種屬細菌甚至還發(fā)生在細菌和真菌之間[21]。對MGEs的分布研究發(fā)現(xiàn)（表1），所有樣品均可檢出整合酶和轉(zhuǎn)座酶基因。具體而言，所有樣均能檢測整合子基因intI-1(clinic)；除了M-DO-2和V-CA-3外，其余樣品均能檢出轉(zhuǎn)座酶基因tnpA-01和Tp614，所分析的8個轉(zhuǎn)座酶基因均能在2個蔬菜樣品（V-CI-3和V-CWL-3）被檢出。intI-1屬于Ⅰ類整合子，在前人對水產(chǎn)品[9]和零售食品[22]的研究中也均有發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，超過80%的人體或畜禽體內(nèi)的腸細菌（Enterobacteria）中存在該整合子[23]。整合子是一種重要的基因捕獲和傳播元件，能夠通過整合酶從外界環(huán)境中捕獲和堆積一個或多個ARGs，在微生物的耐藥性中具有重要作用，是耐藥基因水平傳播的重要機制。在所有樣品中均檢測到Ⅰ類整合子，說明抗生素的使用增加了這類基因尤其intI-1（clinic）的豐度，這些MGEs介導的細菌耐藥性傳播而引起的食源性疾病應引起重視。

2.2 ARGs抵抗機制分析

ARGs抵抗機制見圖2。檢測到ARGs抵抗機制包括：抗生素滅活機制（Antibiotic Deactivate）、細胞保護機制（Cellular Protection）、外排泵機制（Efflux Pump）、Integrase、Transposase及其他機制。其中，抗生素滅活機制、外排泵機制和細胞保護機制為主要的ARGs抵抗機制，它們豐度占比最高，在樣品中的平均數(shù)量分別為44個、34個和24個，即這些樣品中ARGs抵抗機制貢獻大小依次為：抗生素滅活機制＞外排泵機制＞細胞保護機制，該結(jié)果與前人的報道相同[19]?？股販缁顧C制、外排泵機制和細胞保護機制為目前已知的三種主要細菌耐藥機制。外排泵在細菌中廣泛存在，是引起細菌多重耐藥的重要機制[24]。細菌細胞膜上的主動外排泵可將抗菌藥物排至細菌外，從而阻礙抗菌藥物與細菌內(nèi)的靶點結(jié)合，從而引起耐藥[25]。

圖2 ARGs的抵抗機制分析Fig.2 Analysis of antibiotic resistance mechanism detected in ARGs

2.3 樣品中ARGs的熱圖分析

本研究利用R package pheatmap繪制聚類熱圖，通過熱圖展現(xiàn)ARGs在不同樣品中的豐度分布模式（圖3）。圖中顏色由綠色-黃色-紅色，表示ARGs的豐度逐漸遞增，白色表示樣品未檢出該抗生素抗性基因。從圖3可以看出，三個樣品即V-CWL-3（182個）、V-CI-3（165個）和F-HDJ7（161個）富集的ARGs數(shù)量最多。但是水產(chǎn)品（AP-SB-2、AP-WA-2）和肉類樣品（M-DO-2、M-PO-2）中含有的ARGs豐度較高，其中海鱸（AP-SB-2）、鴿肉（M-DO-2）和豬肉（M-PO-2）富集多種ARGs，如氨基糖苷類（aac(6')-Ib(aka aacA4)-03、aadA5-01、strB）、磺胺類（folA、sul1）和四環(huán)素類（tetA-02、tetD-01），其中aac(6')-Ib(aka aacA4)-03在AP-SB-2樣品中的相對豐度高達3.6 copies/16S rRNA gene。其他研究采用HT-qPCR對海鱸中的11個ARGs進行了分析，但只檢測到8個ARGs：sul1、sul2、floR、tetQ、tetM-01、cmlA1-01、tetG-01和vanA[20]。本研究也在水產(chǎn)樣品檢測到上述7個ARGs（vanA除外）。本研究結(jié)果表明，水產(chǎn)品和肉類樣品富集多種高豐度的ARGs，可能與這些水產(chǎn)和畜禽在養(yǎng)殖過程中大量使用抗生素有關。發(fā)酵食品及蔬菜中ARGs的豐度普遍較低，但發(fā)酵食品中也有個別ARG的豐度較高，如黃豆醬樣品（F-HDJ7）中tetK，其相對豐度為0.07 copies/16S rRNA gene。

圖3 聚類熱圖Fig.3 Heatmap of ARG subtypes in different samples

2.4 樣品中共有及特有的ARGs

最后，本文還分析了水產(chǎn)品、發(fā)酵食品、肉類、蔬菜四類樣品中共有及特有的ARGs，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，四類樣品中共有的ARGs達79個，其中四環(huán)素類達19個（tet(32)、tet(36)-01、tet(36)-02、tetA-02、tetB-02、tetD-01、tetD-02、tetG-01、tetL-01、tetL-02、tetM-01、tetM-02、tetO-01、tetPB-03、tetR-02、tetR-03、tetS、tetT、tetX）、氨基糖苷類15個（aac(6')-Ib(aka aacA4)-02、aac(6')-Ib(aka aacA4)-03、aacC2、aadA-01、aadA-02、aadA2-01、aadA2-02、aadA2-03、aadA5-01、aadA9-01、aadD、aadE、aph(2')-Id-02、aphA1(aka kanR)、strB）、多耐藥性5個（floR、qac、qacEdelta1-01、qacEdelta1-02、rarD-02）、磺胺類3個（folA、sul1、sul1）、氯霉素類1個（cmlA1-01）。

圖4 不同樣品中ARGs的維恩圖Fig.4 Venn diagram of the unique and overlapping of ARG subtypes among different sample types

特有的ARGs分析表明，總共發(fā)現(xiàn)有51個特有的ARGs（表2），其中蔬菜樣品中特有的ARGs最多（36個），其次是發(fā)酵食品（13個）；含特有的ARG最少的是水產(chǎn)品和肉類，均只含有1個，分別是pmrA和bla-ACC-1。pmrA屬于多重耐藥類ARGs，而bla-ACC-1屬于β-內(nèi)酰胺類ARGs。蔬菜中特有的ARGs主要屬于氨基糖苷類（Aac、aac(6')-Iy、aacC1、aacC4、aadA9-02、spcN-01、spcN-02）、β-內(nèi)酰胺類類（ampC-04、ampC-07、blaCMY、blaCTX-M-02、blaMOX/blaCMY、blaOCH、blaOKP、blaOXY、blaPAO）和MLSB類（ceoA、ereA、ermJ/ermD、ermK-02、ermY、lnuC、mexA、mexD、oleC、pikR2、yceE/mdtG-02）；而發(fā)酵食品中特有的ARGs主要屬于β-內(nèi)酰胺類（blaCTX-M-01、ndm-1、Pbp）、四環(huán)素類（tetJ、tetPB-04、tetU-01）和萬古霉素類（vanC1、vanTE、vanTG）（表2）。發(fā)酵食品和肉類含有較多固有的ARGs，推測可能與這些樣品中含有某些高豐度的微生物物種有關。

表2 樣品中特有的ARGs統(tǒng)計分析Table 2 The unique ARG subtypes in different types of samples

3 結(jié)論

本研究對四個不同類別食品（發(fā)酵食品、水產(chǎn)品、禽畜肉、蔬菜）中的285種ARGs及10種MGEs進行了分析。結(jié)果表明，這些樣品中含有較多的ARGs，特別是部分蔬菜樣品中的ARG甚至可達182個。15個被分析的樣品中，共檢出234個ARGs，其中79個為所有樣品中共有的ARGs，51個為特有的ARGs；水產(chǎn)品和肉類樣品富集多種ARGs。這15個樣品中的ARGs耐藥機制主要是抗生素滅活機制、外排泵機制和細胞保護機制。與普通熒光定量PCR相比，本研究采用的Smartchip超高通量熒光定量PCR方法能檢出較多的ARGs，對于研究樣品中的ARGs和MGEs多樣性和豐度具有顯著的優(yōu)勢。分析更多的樣品以及對樣品中微生物組成與ARGs和MGEs相關性研究，將是未來的一個研究方向?？傊?，本研究對于了解不同類別食品中ARGs的賦存情況以及為食品安全風險分析提供了數(shù)據(jù)支持。