人工接種東北酸菜發(fā)酵過程中氨基酸類物質(zhì)的代謝變化

李瀟，吳興壯，韓艷秋，張曉黎，高雅，王琛

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學院食品與加工研究所，遼寧沈陽 110161）

東北酸菜是以白菜或甘藍為原料制得的鹽漬菜，因其獨有的風味、口感與營養(yǎng)保健功能，目前已成為我國東北地區(qū)最具代表性食品，深受消費者喜愛[1]。而隨著現(xiàn)代食品加工技術的不斷進步，人工接種乳酸菌發(fā)酵酸菜的模式逐漸興起。這種模式可在一定程度下縮短酸菜的發(fā)酵周期，提高酸菜的營養(yǎng)及食用安全性，因此具有廣泛的應用前景[2]。

發(fā)酵過程中，微生物的協(xié)同代謝以及酶和代謝物的進一步反應，能夠賦予東北酸菜獨有的風味品質(zhì)[3]。研究表明接種發(fā)酵酸菜的風味成分包括酯、醛、酮、醇、酸、氨基酸等[4]，更有相關研究表明食品發(fā)酵過程中形成的高濃度氨基酸會對發(fā)酵產(chǎn)品的風味起關鍵作用。例如，食醋中含有的較高濃度的谷氨酸和丙氨酸對其鮮味及甜味具有積極影響[5]；張建萍等[6]認為腐乳中的咸鮮味主要是由谷氨酸和天冬氨酸所賦予。而Jin等[7]認為中國米酒的甜、鮮、酸和苦味分別與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、酪氨酸以及除精氨酸外的其他苦味氨基酸有關；同樣，彭杰等[8]則表示呈鮮味的天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸，呈甜味的丙氨酸與呈苦味的精氨酸一同造就了郫縣豆瓣口味的復雜性與厚重感。

近年來，組學技術不斷地在發(fā)酵酸菜微生物的多樣性以及主要風味代謝物的組成方面有所應用[9]，然而關于人工接種發(fā)酵的東北酸菜發(fā)酵過程中風味物質(zhì)代謝途徑變化規(guī)律的研究仍有所欠缺。

本研究以人工接種乳酸菌發(fā)酵的東北酸菜為研究對象，借助非靶向代謝組學技術分析東北酸菜在人工接種發(fā)酵過程中代謝物組成以及氨基酸類物質(zhì)的代謝變化規(guī)律。研究結(jié)果可為后續(xù)調(diào)控東北酸菜風味物質(zhì)形成，提升東北酸菜品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（L.plantarumLNJ005）來源于遼寧省農(nóng)業(yè)科學院食品與加工研究所；干酪乳桿菌（L.caseiBNCC134415）和檸檬明串珠菌（Leu.citreumBNCC194779）均采購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司。東北大白菜（杠菜）、食用鹽（中國鹽業(yè)集團有限公司）和白酒（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠）均采購自農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD型單人單面工作凈化臺，上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；CJ50-3疊加式培養(yǎng)箱，上海程捷儀器設備有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TGL-16G-C高速臺式冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；LGJ-18C真空冷凍干燥機，北京四環(huán)起航科技有限公司；UHPLC-Q Exactive HF-X串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 東北酸菜制備與樣品收集

通過生理鹽水將植物乳桿菌、干酪乳桿菌和檸檬明串珠菌的菌懸液稀釋到濃度為菌體數(shù)量級為107。將3種乳酸菌菌懸液按體積比為1:1:1混合均勻，制成液體混合菌發(fā)酵劑。

市售大白菜，清洗切絲后，添加2%的食鹽（m/m），攪拌均勻。隨后將白菜絲裝入350 mL塑料泡菜瓶中并壓實。將液體混合菌發(fā)酵劑加入到泡菜瓶中，20 ℃密封發(fā)酵30 d。

根據(jù)酸菜的酸度在發(fā)酵前期變化較大，酸菜發(fā)酵液樣品選擇在5個采樣時間點（第0天、第2天、第10天、第18天和第30天）進行采集，分別在每個泡菜瓶的上、中、下三層采集發(fā)酵液后混合均勻（約10 mL）[10]，進行代謝物分析。

1.3.2 樣品處理與LC-MS/MS分析

取發(fā)酵液樣品，4 ℃下10 000g離心10 min，分離后取上清在4 ℃下20 000g離心15 min，收集上清。收集的上清液在-80 ℃冷凍后進行真空冷凍干燥，冷凍干燥后的樣品用含L-2-氯苯丙氨酸（0.02 mg/mL）作為內(nèi)標的提取液：甲醇:水=4:1（V/V）溶解。研磨6 min后，低溫超聲提取30 min。在4 ℃下13 000g離心15 min，收集上清進行UHPLC-Q Exactive HF/MS分析。將每個時間點采集的樣品作為一組，每組樣品測定5個平行。并將發(fā)酵不同時間的樣品組作為差異分析對比組。每個處理樣品中取20 μL上清液混合作為質(zhì)量控制樣品（QC）。

色譜條件：采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相A為包含0.1%（V/V）甲酸的三聚氰酸水溶液H2O/ACN（95:5）；流動相B為包含0.1%（V/V）甲酸的三聚氰酸-乙腈溶液ACN/IPA/H2O（47.5:47.5:5）。進樣量為2 μL，柱溫為40 ℃。梯度洗脫條件為0 min，100:0（V/V），流速0.4 mL/min；3.5 min，75.5:24.5（V/V），流速0.4 mL/min；5 min，35:65（V/V），流速0.4 mL/min；5.5 min，0:100（V/V），流速0.4 mL/min；7.4 min，0:100（V/V），流速0.6 mL/min；7.6 min，48.5:51.5（V/V），流量0.6 mL/min；7.8 min，0:100（V/V），流速0.6 mL/min；9 min，0:100（V/V），流速0.4 mL/min；10 min，0:100（V/V），流速0.4 mL/min。

質(zhì)譜條件：采用正負電離掃描模式，掃描范圍為70～1 050m/z，加熱器溫度為425 ℃；毛細管溫度為325 ℃；鞘氣流速50 arb；輔助氣流速13 arb；離子噴霧電壓，正電離模式為3.5 kV，負電離模式為-3.5 kV。整個分析過程中，QC樣品每隔5～15個進樣一次，用于監(jiān)控穩(wěn)定性。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

將原始數(shù)據(jù)導入Progenesis QI（Waters Corporation，Milford，USA），得到滯留時間、質(zhì)荷比、峰強度等參數(shù)信息。利用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）將這些特征值與MS片段在網(wǎng)上公共數(shù)據(jù)庫和自建數(shù)據(jù)庫（http://www.hmdb.ca/，https://metlin.scripps.edu/）上進行比對。MS質(zhì)量誤差小于10×10-6，是基于二級質(zhì)譜匹配分數(shù)確定代謝物種類。數(shù)據(jù)分析在Majorbio Cloud Platform在線平臺（www.majorbio.com）上進行。

采用Relative-betweeness Centrality方法進行拓撲學分析，采用Benjamini-Hochberg方法（BH法）進行多重檢驗校正，對P值進行校正，當經(jīng)過校正的P＜0.05時，認為此通路存在顯著富集情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種發(fā)酵酸菜代謝物及代謝功能通路分析

人工接種發(fā)酵東北酸菜（以下簡稱酸菜）不同階段代謝物的共有數(shù)目見圖1。在酸菜接種發(fā)酵過程中共檢測出638種代謝物。從發(fā)酵開始到結(jié)束共有619種代謝物同時存在，且眾多代謝物含量在發(fā)酵過程中均存在不同程度的改變。此外，發(fā)酵前18 d共有的4種化合物中甘油磷脂類化合物存在差異下調(diào)，而發(fā)酵第2天到第30天共有的13種化合物中脂類、酚類和氨基酸類化合物存在差異上調(diào)。在已被確定的代謝物中，以氨基酸，多肽及其類似物為主，占總代謝物的25.43%，隨后是脂肪酸及其共軛物和碳水化合物，占總代謝物的5.31%和4.36%。而萜類、嘌呤類、羰基化合物、以及其他類化合物的種類較少。

圖1 接種發(fā)酵東北酸菜代謝物數(shù)目Fig.1 Number of metabolites of Inoculated fermented Dongbeisuancai

通過將代謝途徑涉及的基因與京都基因和基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫進行匹配，可以更加直觀地了解酸菜發(fā)酵過程中的生物轉(zhuǎn)化途徑，詳細見圖2a。接種發(fā)酵酸菜代謝途徑主要與氨基酸代謝、脂類代謝、其他次生代謝物生物合成、碳水化合物代謝、核苷酸代謝、外源生物降解與代謝、輔酶因子和維生素代謝、萜類和多酮類代謝、能量代謝以及聚糖生物合成與代謝有關。

圖2 接種發(fā)酵東北酸菜代謝途徑分類與化合物分類Fig.2 Metabolic pathways and compounds classification of inoculated fermented Dongbeisuancai

不同的代謝途徑對酸菜香氣、滋味等品質(zhì)的形成具有重要意義。脂類代謝，包括“不飽和脂肪酸的生物合成”、“脂肪酸代謝及生物合成”、“丙酮酸代謝”等均涉及揮發(fā)性風味酯的形成。氨基酸代謝、核苷酸代謝、萜類和多酮類代謝也同樣涉及揮發(fā)性風味物質(zhì)的形成。而碳水化合物代謝，包括“淀粉和蔗糖代謝”以及“果糖和甘露糖代謝”，也可能是酸菜發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香氣和滋味化合物的重要來源。此外，葡萄糖代謝是對酸菜酸味具有重要貢獻的乳酸和醋酸的生產(chǎn)途徑。雖然碳水化合物代謝是酸菜發(fā)酵中的基礎代謝過程，它與其他代謝途徑的協(xié)同運作能夠反映微生物利用碳水化合物、蛋白質(zhì)和其他基質(zhì)生長的生物學必要性[11]。但氨基酸代謝同樣是接種發(fā)酵酸菜的主要代謝途徑，并且對酸菜風味與滋味的形成具有重要意義[12]。在與生物合成代謝相關的化合物中，氨基酸的種類最多，這也說明氨基酸代謝在酸菜發(fā)酵過程中的重要作用（圖2b）。

2.2 接種發(fā)酵酸菜中氨基酸分析

通過UHPLC-Q Exactive系統(tǒng)的檢測以及與代謝物數(shù)據(jù)庫的匹配，得到酸菜接種發(fā)酵過程中氨基酸的種類與變化，詳細見圖3。在混菌接種發(fā)酵的酸菜中鑒定出12種氨基酸，分別是L-精氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、焦谷氨酸、反-4-L-羥基谷氨酸、L-半胱氨酸、L-絲氨酸、L-天冬酰胺、β-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸，并且在發(fā)酵過程中，L-精氨酸和L-脯氨酸的豐度始終較高。但相比之下，自然發(fā)酵的酸菜中含有更多的游離氨基酸種類，這可能是由于混菌的接種使發(fā)酵過程具有主導乳酸菌，而自然發(fā)酵酸菜中微生物的種類更加豐富，也因此產(chǎn)生更多的代謝物質(zhì)[13]。氨基酸的呈味效果與其手型結(jié)構有相關性，L-氨基酸可呈現(xiàn)出酸、甜、苦、咸、鮮5種味道，但L-氨基酸呈甜味閾值均較高，因此其呈甜味不明顯[14]。接種發(fā)酵前兩天，除L-絲氨酸外，其他氨基酸的豐度均呈現(xiàn)上升趨勢。尤其是L-半胱氨酸，上升程度明顯較高。與之相反，L-絲氨酸的豐度呈現(xiàn)急劇下降趨勢。這可能是由于在發(fā)酵前兩天存在L-絲氨酸與L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)化。發(fā)酵第2天開始L-谷氨酸與反-4-L-羥基谷氨酸的豐度基本維持穩(wěn)定，而其他氨基酸的豐度緩慢上升到發(fā)酵第10天基本穩(wěn)定。這說明前10天的代謝過程涉及大部分氨基酸的合成與轉(zhuǎn)化，也表明前10天是接種發(fā)酵酸菜風味與滋味形成的重要時期。值得注意的是，L-半胱氨酸的豐度在發(fā)酵前10天始終顯著上升，這表明與L-半胱氨酸生物合成的相關代謝較為活躍。此外，呈酸味的半胱氨酸大量積累，說明發(fā)酵前10天是酸味形成的重要時期。同時與Xiao等[15]的研究結(jié)果相似，東北酸菜的谷氨酸與天冬氨酸具有較高的豐度，結(jié)合兩者較低的酸味與鮮味閾值，導致酸菜整體酸感較強。

圖3 接種發(fā)酵東北酸菜發(fā)酵過程氨基酸變化Fig.3 Changes of amino acid during fermentation of Dongbeisuancai

2.3 接種發(fā)酵酸菜中氨基酸代謝通路富集分析

對酸菜發(fā)酵過程中的代謝物進行富集分析，使用超幾何分布算法獲得代謝物顯著富集的通路詳見圖4所示。

圖4 接種發(fā)酵東北酸菜氨基酸代謝通路富集Fig.4 Amino acid metabolism enrichment pathway of inoculated fermented Dongbeisuancai

在人工接種發(fā)酵前兩天，多種代謝物在相關氨基酸代謝通路中顯著富集并顯示出重要性。而對應的多組氨基酸代謝通路同時顯示出重要作用。顯著富集的代謝物對應的重要氨基酸代謝包括精氨酸和脯氨酸代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、谷胱甘肽代謝以及賴氨酸降解。在這些氨基酸相關的代謝途徑中，精氨酸和脯氨酸代謝富集更多的代謝物，同時在代謝中具有更重要的作用。其次是半胱氨酸和甲硫氨酸代謝，雖然該代謝通路富集的代謝物較少，但其在代謝中仍具有較高的相對影響值。谷胱甘肽代謝通路富集了較多的代謝物，而其影響值介于甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝與賴氨酸降解之間。發(fā)酵第2天到第10天，具有重要影響的氨基酸相關代謝路徑顯著減少。在這一發(fā)酵階段，谷胱甘肽代謝表現(xiàn)出較高的重要性。而半胱氨酸和甲硫氨酸代謝以及賴氨酸降解雖然仍具有重要性，但兩者的代謝物富集相對較少。發(fā)酵第10天到第18天，組氨酸代謝路徑上出現(xiàn)了代謝物富集，并且其與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝均具有重要作用，而半胱氨酸和甲硫氨酸代謝的重要性降低。值得注意的是，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝路徑在發(fā)酵第2天到發(fā)酵第10天無代謝物富集，這也表明甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝的路徑在發(fā)酵前兩天和第10天到第18天不同。縱觀整體發(fā)酵期間，精氨酸和脯氨酸代謝路徑僅在發(fā)酵前兩天具有重要性，因此發(fā)酵前兩天以精氨酸和脯氨酸代謝為主。而谷胱甘肽代謝在發(fā)酵第2天到第10天，重要性顯著提高，隨后通路代謝物無富集。發(fā)酵第10天到第18天，代謝路徑以甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及組氨酸代謝為主。此外，半胱氨酸和甲硫氨酸代謝在發(fā)酵前18天，賴氨酸降解在發(fā)酵前10天始終具有重要性，但伴隨發(fā)酵進行，重要性逐漸降低。隨后，發(fā)酵第18天到第30天，已無具有明顯重要性的氨基酸代謝路徑出現(xiàn)。

2.4 接種發(fā)酵酸菜中氨基酸代謝途徑分析

根據(jù)在酸菜發(fā)酵過程中富集的氨基酸，采用KEGG對人工接種酸菜發(fā)酵過程中涉及的氨基酸代謝途徑進行了分析。參與不同氨基酸代謝途徑的代謝物和關鍵酶詳見圖5和表1。針對發(fā)酵前兩天具有重要作用的精氨酸和脯氨酸代謝途徑，根據(jù)富集的代謝物L-精氨酸、N2-琥珀酰-L-鳥氨酸、L-谷氨酸、5-半醛-L-谷氨酸、L-脯氨酸、γ-谷酰-γ-氨基-丁酸、4-氨基丁酸和亞精胺，預測該代謝途徑主要包括：（1）琥珀?；D(zhuǎn)移酶途徑，涉及5種酶。通過琥珀?；嚓P的轉(zhuǎn)移酶、水解酶和氧化還原酶將L-精氨酸轉(zhuǎn)化成L-谷氨酸。（2）脯氨酸生物合成途徑，涉及3種酶。通過激酶、半醛脫氫酶和羧酸還原酶將L-谷氨酸轉(zhuǎn)化成L-脯氨酸。（3）γ-氨基丁酸（GABA）生物合成途徑，涉及6種酶。Yang等[16]認為GABA是由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶的作用轉(zhuǎn)化而來。而本研究由于檢測到γ-谷酰-γ-氨基丁酸，因此預測GABA合成途徑是由L-精氨酸開始，通過不同的裂解酶、水解酶、氧化還原酶的作用，最終轉(zhuǎn)化成4-氨基丁酸。（4）多胺生物合成途徑，涉及1種酶。通過亞精胺合成酶將丁二胺轉(zhuǎn)化成亞精胺。詳細轉(zhuǎn)化途徑見圖5精氨酸和脯氨酸代謝。

表1 不同氨基酸代謝途徑的關鍵酶Table 1 Key enzymes of different amino acid metabolic pathways

圖5 接種發(fā)酵酸菜中氨基酸代謝途徑分析Fig.5 Analysis of amino acid metabolism pathway in inoculated fermented Dongbeisuancai

針對半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途徑，預測該代謝途徑主要包括：（1）半胱氨酸生物合成途徑，涉及4種酶。通過2種轉(zhuǎn)移酶將L-絲氨酸轉(zhuǎn)化成L-半胱氨酸以及在2種裂解酶的作用下將同型半胱氨酸化成L-半胱氨酸。其中L-絲氨酸轉(zhuǎn)化成L-半胱氨酸也可以通過這兩種氨基酸的含量變化得到印證（圖3）。（2）甲硫氨酸生物合成途徑，涉及2種酶。通過裂解酶和轉(zhuǎn)移酶將胱硫醚轉(zhuǎn)化成L-甲硫氨酸。此外，半胱氨酸也可以通過轉(zhuǎn)胺反應轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸[17]。詳細轉(zhuǎn)化途徑見圖5甲硫氨酸和半胱氨酸代謝。

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸作為前體組成的含γ-酰胺鍵和巰基的三肽物質(zhì)[18]。針對谷胱甘肽代謝途徑，富集的代謝物包括L-谷氨酸、L半胱氨酸、L-γ-谷氨酸半胱氨酸、還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）和亞精胺。預測該代謝途徑涉及谷胱甘肽生物合成途徑，涉及6種酶。與張子潔等的研究結(jié)果相似[19]，通過連接酶將L-谷氨酸和L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化成GSH?；蛘邅喚方?jīng)連接酶轉(zhuǎn)化成GSH。同時還存在GSH和GSSG的相互轉(zhuǎn)化。詳細轉(zhuǎn)化途徑見圖5谷胱甘肽代謝。

絲氨酸代謝以絲氨酸生物合成為主，代謝途徑涉及5種酶，由糖酵解途徑（EMP）中合成的3磷酸甘油酸（3PG）經(jīng)多種酶轉(zhuǎn)化成L-絲氨酸，同時L-半胱氨酸也可經(jīng)由胱硫醚途徑轉(zhuǎn)化成L-絲氨酸。詳細轉(zhuǎn)化途徑見圖5絲氨酸代謝。

組氨酸代謝以組氨酸生物合成途徑為主。該途徑是由磷酸戊糖途徑生成的5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）經(jīng)多種酶逐步轉(zhuǎn)化成L-組氨醛后經(jīng)脫氫酶轉(zhuǎn)化成L-組氨酸。詳細轉(zhuǎn)化途徑見圖5組氨酸代謝。

賴氨酸降解途徑富集的代謝物包括N6-乙酰-L-賴氨酸、L-β-賴氨酸、3,5-二氨基己酸、5-羥基賴氨酸和S-2-羥戊二酸。因此預測賴氨酸降解途徑主要由L-賴氨酸（1）在乙酰轉(zhuǎn)移酶作用下轉(zhuǎn)化成N6-乙酰-L-賴氨酸，（2）在2種異構酶的作用下先轉(zhuǎn)化成L-β-賴氨酸后轉(zhuǎn)化成3,5-二氨基己酸，（3）在多種酶的作用下轉(zhuǎn)化成5-羥基賴氨酸，（4）在多種酶作用下轉(zhuǎn)化成S-2-羥戊二酸后又經(jīng)氧化還原酶轉(zhuǎn)化成琥珀酸，參與三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）。詳細轉(zhuǎn)化途徑見圖5賴氨酸降解。

3 結(jié)論

本研究鑒定了人工接種發(fā)酵東北酸菜發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物，其中以氨基酸、多肽及其類似物占比較大。同時，鑒定出的氨基酸對酸菜酸味的形成具有重要作用，并且發(fā)酵前10天是接種酸菜風味與滋味形成的重要時期。酸菜發(fā)酵過程中主要代謝途徑涉及氨基酸的生物合成和代謝，根據(jù)代謝物的富集發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前兩天以精氨酸和脯氨酸代謝為主，第2天到第10天以谷胱甘肽代謝為主，第10天到第18天以絲氨酸和組氨酸代謝為主，此外賴氨酸降解，半胱氨酸和甲硫氨酸代謝分別在發(fā)酵前10天和前18天始終存在，但伴隨發(fā)酵進行，逐漸減弱。發(fā)酵18天后，基本無氨基酸代謝路徑出現(xiàn)。本研究揭示了氨基酸代謝調(diào)控接種發(fā)酵東北酸菜風味的機制，但還需要進一步基于微生物在基因和酶水平上的表達研究來完善機制研究。本研究從氨基酸代謝途徑的角度切入，完善了東北酸菜發(fā)酵機理，同時為提高東北酸菜風味和口感提供了理論基礎。