基于物相形態(tài)差異探究煎煮過(guò)程對(duì)紅花-桃仁藥對(duì)藥效物質(zhì)的傳遞作用

陶春曉，葉泰瑋，李 敏，張 芳，謝 燕*

基于物相形態(tài)差異探究煎煮過(guò)程對(duì)紅花-桃仁藥對(duì)藥效物質(zhì)的傳遞作用

陶春曉1，葉泰瑋1，李 敏2，張 芳3，謝 燕1*

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)公共健康學(xué)院，上海 201203 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué) 專家委員會(huì)辦公室，上海 201203 3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新中藥研究院，上海 201203

以紅花-桃仁藥對(duì)湯液中相態(tài)差異為基礎(chǔ)，探究煎煮過(guò)程對(duì)該藥對(duì)藥效物質(zhì)的傳遞作用。采用超速離心和透析技術(shù)對(duì)紅花-桃仁藥對(duì)湯液進(jìn)行相態(tài)拆分，使用馬爾文粒徑儀、透射電子顯微鏡對(duì)各相態(tài)的粒徑、ζ電位、微觀形態(tài)進(jìn)行表征，選用氣相色譜法、紫外分光光度法、HPLC法對(duì)各相態(tài)的脂肪酸、蛋白、糖類(lèi)以及紅花有效成分羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）、脫水紅花黃色素B（anhydrosafflor yellow B，AHSYB）的含量進(jìn)行測(cè)定；拆分單煎液、分煎合并液及共煎液的相態(tài)，并比較不同藥液中同級(jí)相態(tài)的物質(zhì)組成或微觀形態(tài)的差異，考察煎煮方式對(duì)相態(tài)形成的影響。紅花-桃仁藥對(duì)湯液中分離得到了1個(gè)親油型相態(tài)②和6個(gè)親水型相態(tài)①③④⑤⑥⑧；親油型相態(tài)②由棕櫚酸、棕櫚油酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十烷酸共8種脂肪酸組成；親水型相態(tài)粒徑在20～1000 nm，主要為混懸相態(tài)與膠體相態(tài)，糖類(lèi)、蛋白是親水型相態(tài)的重要組成物質(zhì)，HSYA、AHSYB主要分布于親水型相態(tài)③⑥⑧中。共煎煮可形成親油型相態(tài)，其脂肪酸組成與桃仁油相近，單煎液、分煎合并液及共煎液中親水型相態(tài)⑥⑧粒子的形態(tài)有一定差異，共煎液中相態(tài)⑥⑧粒子的粒徑均一性、穩(wěn)定性最佳。物相形態(tài)是紅花-桃仁藥對(duì)藥效物質(zhì)傳遞的重要形式，煎煮過(guò)程特別是共煎煮，是該藥對(duì)有效相態(tài)形成的重要步驟。

中藥藥對(duì)；紅花；桃仁；煎煮過(guò)程；相態(tài)；超速離心；透析技術(shù)；脂肪酸；蛋白；糖類(lèi)；羥基紅花黃色素A；脫水紅花黃色素B；藥效物質(zhì)傳遞

紅花、桃仁均為活血化瘀常用藥味，兩者配伍后入心可散血中之滯，入肝可理血中之雍，是體現(xiàn)“活血化瘀”治則的經(jīng)典藥對(duì)[1]。臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，紅花-桃仁藥對(duì)確在心脈瘀阻、血滯經(jīng)閉等病證及相關(guān)病理模型治療中療效顯著[2-3]。湯劑是中藥復(fù)方最常見(jiàn)的口服劑型，以紅花-桃仁藥對(duì)為基礎(chǔ)的血府逐瘀湯、桃紅四物湯、補(bǔ)陽(yáng)還五湯等均以湯劑形式用藥[4]；另有研究顯示，湯劑的藥效作用發(fā)揮與其煎煮方式密切相關(guān)[5-6]，因此，有必要研究紅花-桃仁藥對(duì)的煎煮過(guò)程，為合理闡釋其藥效作用提供支持。此外，《中國(guó)藥典》2020年版第一部收載的成方制劑中，含有紅花-桃仁藥對(duì)的制劑共有34個(gè)，其中尿塞通片、根痛平顆粒、消栓口服液等18個(gè)制劑中紅花-桃仁藥對(duì)均以共煎入藥[7]，因此，充分了解紅花-桃仁藥對(duì)湯液煎煮過(guò)程中的變化對(duì)相關(guān)中藥制劑的質(zhì)量提升也具有重要意義。

物相形態(tài)是指在非外力作用下，理化性質(zhì)相同的物質(zhì)相互作用形成的聚集態(tài)，簡(jiǎn)稱相態(tài)[8]。隨著超分子化學(xué)、納米生物學(xué)等新興學(xué)科在傳統(tǒng)中藥學(xué)研究的不斷滲入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)藥對(duì)如甘草-附子、馬錢(qián)子-甘草等在煎煮過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生新的物相形態(tài)，包括沉淀相（粒徑＞10 μm）、混懸相（粒徑0.5～10 μm）、膠體相（粒徑1～100 nm）等[9-10]，由不同成分在靜電引力、氫鍵作用、親-疏水作用等弱相互 作用的誘導(dǎo)下從無(wú)序狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛行虻木奂瘧B(tài)而引起[11]。另外，白虎湯、麻杏石甘湯中各相態(tài)藥效結(jié)果表明，相態(tài)中成分含量、相互作用力的變化會(huì)引起藥效活性的增強(qiáng)或削弱[12-13]。可見(jiàn)，相態(tài)可能是中藥湯劑藥效物質(zhì)的重要傳遞形式，其維持與變化過(guò)程中伴隨著藥效物質(zhì)的裝載、釋放和效應(yīng)發(fā)揮。迄今，紅花-桃仁藥對(duì)湯液中的相態(tài)存在形式及變化未見(jiàn)報(bào)道，值得探究。

因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)濾過(guò)、透析、超速離心等物理分離方法對(duì)紅花-桃仁藥對(duì)共煎液進(jìn)行物相形態(tài)拆分，并采用馬爾文粒徑儀（DLS）、透射電子顯微鏡（TEM）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）及高效液相色譜（HPLC）等對(duì)所獲得的相態(tài)進(jìn)行粒徑、ζ電位和形態(tài)表征，成分含量分析；進(jìn)一步選取組成特殊或可負(fù)載藥效物質(zhì)的相態(tài)為研究對(duì)象，探究不同煎煮方式對(duì)紅花-桃仁藥對(duì)湯液相態(tài)形成的影響，以期探討煎煮過(guò)程中紅花-桃仁藥對(duì)藥效物質(zhì)的傳遞規(guī)律，為中藥復(fù)方制劑前處理過(guò)程研究提供一定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)與借鑒。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HH-4型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼科儀器有限公司；Eppendorf Centrifuge 5424R型離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；SCIENTZ-12N型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；YH型電熱套，江蘇近湖鎮(zhèn)教學(xué)儀器廠；Optima XPN-100型超高速離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；Nano-ZS/ZEN-3600型粒徑儀，英國(guó)馬爾文公司；JEM-2100F型透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；Agilent 8860/7697A型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、Agilent 1260 II型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent Technologies公司；Powerware XS型酶標(biāo)儀，Biotek公司。

1.2 試藥

石油醚、正丁醇、蒽酮、濃硫酸均為分析純，活性炭為試劑級(jí)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、冰醋酸為色譜純，購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司；BCA試劑盒，購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；14%三氟化硼甲醇溶液為試劑級(jí)，購(gòu)于上海泰坦科技有限公司；水為超純水，由Milli-Q超純水儀系統(tǒng)制備。

紅花購(gòu)于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆óa(chǎn)地新疆，批號(hào)211011），經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所吳立宏研究員鑒定，為菊科紅花屬植物紅花L.的干燥花；桃仁購(gòu)于上海康橋中藥飲片有限公司（產(chǎn)地山東，批號(hào)211116），經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所吳立宏研究員鑒定，為薔薇科植物桃(L.) Batsch的干燥成熟種子。羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）對(duì)照品購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號(hào)20191109，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%；無(wú)水葡萄糖對(duì)照品購(gòu)自成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)DSTDW000501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%；脫水紅花黃色素B（anhydrosafflor yellow B，AHSYB）對(duì)照品購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)184840-84-4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅花-桃仁藥對(duì)共煎液的物相形態(tài)考察

2.1.1 紅花-桃仁藥對(duì)共煎液的相態(tài)分離 稱取紅花、桃仁（搗碎）藥材各50 g，加20倍量水浸泡30 min，加熱至微沸并保持1 h，趁熱過(guò)七號(hào)篩濾除藥渣，如此煎煮2次，合并藥液得共煎液。共煎液4 ℃靜置過(guò)夜，4000×離心10 min，得到相態(tài)①和上層液。相態(tài)①用少量水混懸收集，上層液于分液漏斗中靜置分層后，上層加入水飽和正丁醇振搖萃取，萃取液去除有機(jī)試劑得到相態(tài)②；下層液體濃縮10倍后于相對(duì)分子質(zhì)量3500的透析袋（按文獻(xiàn)報(bào)道方法[15]預(yù)處理）中透析至外液無(wú)色，透析外液濃縮得相態(tài)③。透析袋內(nèi)樣品于100 000×、200 000×梯度超速離心90、120 min，沉淀分別為相態(tài)④、⑤，200 000×離心后上清液為相態(tài)⑥，流程見(jiàn)圖1。取部分相態(tài)①③④⑤⑥留作形態(tài)鑒定樣品，其余凍干后儲(chǔ)存于?20 ℃。

圖1 紅花-桃仁藥對(duì)共煎液物相形態(tài)拆分流程

2.1.2 紅花-桃仁藥對(duì)共煎液物相形態(tài)的鑒定與表征 經(jīng)觀察，相態(tài)②為可溶于石油醚的黃色黏稠狀液體，而相態(tài)①③～⑥為具有較明顯丁達(dá)爾效應(yīng)的親水性液體，故分為親油型相態(tài)與親水型相態(tài)兩類(lèi)進(jìn)行表征。

（1）親水型相態(tài)中粒子粒徑分布、ζ電位及微觀形態(tài)表征：分別吸取適量相態(tài)①③～⑥溶液，以超純水稀釋10倍后，采用馬爾文粒徑儀測(cè)定各樣品的粒徑、ζ電位；同時(shí)將樣品滴至銅網(wǎng)支持膜上，陰干后于TEM下觀察粒子形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。

DLS結(jié)果顯示，相態(tài)①④所含粒子從微米級(jí)至納米級(jí)均有分布，平均粒徑在2600 nm左右，ζ電位約為?10 mV且呈現(xiàn)多峰狀；相態(tài)③粒徑偏小，在納米級(jí)別（70～200 nm），ζ電位約為?30 mV；而相態(tài)⑤⑥粒徑主要集中在250 nm左右，ζ電位為?30 mV且呈現(xiàn)單峰。TEM結(jié)果顯示，相態(tài)①中粒子由大小不一且不規(guī)則的白色、黑色粒子組成；相態(tài)③中粒子為黑色球狀顆粒；相態(tài)④為白色類(lèi)球狀粒子；相態(tài)⑤中粒子也為白色球狀，但粒徑遠(yuǎn)小于相態(tài)④；相態(tài)⑥所含粒子呈黑色圓球狀，且粒子內(nèi)可見(jiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。值得注意的是，相態(tài)⑤⑥中單個(gè)粒子聚集成團(tuán)，因此DLS測(cè)得粒徑偏大，但相態(tài)⑤⑥實(shí)際粒徑與相態(tài)③相近。綜上，親水型相態(tài)總體粒徑在20～1000 nm，表明其主要由混懸相態(tài)和膠體相態(tài)組成，其中相態(tài)①④包含有膠體相態(tài)和混懸相態(tài)；相態(tài)③⑤⑥粒徑偏小，為膠體相態(tài)。

圖2 共煎液中親水型相態(tài)的微觀形態(tài)、粒徑分布及ζ電位

（2）親油型相態(tài)GC-MS定性分析：參照文獻(xiàn)方法[14]及GB 5009.168-2016的方法，測(cè)定相態(tài)②中脂肪酸組成。

色譜條件：氣相色譜柱為VF-WAXMS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣口溫度150 ℃；分流比10∶1，升溫程序及柱溫如下：150 ℃（20 ℃/min）→220 ℃（3 ℃/min）→250 ℃，保持5 min，進(jìn)樣量0.3 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊源EI；離子源溫度為230 ℃；四級(jí)桿溫度為150 ℃；掃描質(zhì)量范圍/45～600，溶劑延遲為3 min。

樣品溶液的制備：稱取適量相態(tài)②于圓底燒瓶中，加入100倍量的0.5 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液，60 ℃恒溫水浴30 min，冷卻后加入14%三氟化硼甲醇溶液，60 ℃恒溫水浴15 min，冷卻后，加入適量正己烷，振搖后加入等量飽和氯化鈉溶液，靜置，取正己烷層，加入過(guò)量無(wú)水硫酸鈉，混勻并離心 （10 000×，10 min），上清液進(jìn)樣檢測(cè)即可。

所得GC-MS總離子流色譜圖見(jiàn)圖3。由色譜圖可知，各成分已達(dá)到基本分離，滿足后續(xù)定性分析的要求。調(diào)用NIST化合物譜庫(kù)，解析總離子流圖，共得到9個(gè)成分，其中脂肪酸類(lèi)成分8個(gè)，分別為棕櫚酸、棕櫚油酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十烷酸；苯甲醛衍生物或烷類(lèi)1個(gè)。采用峰面積歸一化法計(jì)算其相對(duì)百分含量，結(jié)果顯示，相態(tài)②中脂肪酸以油酸含量最高，亞油酸、棕櫚酸含量次之，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，上述結(jié)果說(shuō)明相態(tài)②為脂肪酸組成的油類(lèi)物質(zhì)。

1-棕櫚酸 2-棕櫚油酸 3-十七烷酸 4-硬脂酸 5-油酸 6-亞油酸 7-花生四烯酸 8-二十烷酸

表1 相態(tài)②脂肪酸成分的相對(duì)含量

Table 1 Relative content of fatty acid in phase ②

tR/min成分名稱分子式相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)含量平均值/% 6.153棕櫚酸C17H34O2270.457.04 6.387棕櫚油酸C17H32O2268.430.32 7.390十七烷酸甲酯C18H36O2284.480.05 7.838硬脂酸C19H38O2298.501.39 8.141油酸C19H36O2296.4960.51 8.620亞油酸C19H34O2294.4727.07 9.938花生四烯酸甲酯C21H34O2318.490.58 10.683二十烷酸甲酯C21H42O2326.560.09 苯甲醛衍生物、烷類(lèi) 0.39

2.1.3 親水型相態(tài)物質(zhì)組成分析及成分分布考察 糖類(lèi)、蛋白類(lèi)物質(zhì)在湯液相態(tài)形成中發(fā)揮著重要作用[15]，紅花中多糖含量豐富且為主要藥效物質(zhì)，桃仁中蛋白質(zhì)占比達(dá)到20%～30%[16]，兩者可能會(huì)參與相態(tài)形成，故進(jìn)行親水型相態(tài)中蛋白質(zhì)、總糖的定量分析；同時(shí)，以紅花有效成分HSYA、AHSYB為代表考察小分子成分在親水型相態(tài)中的分布情況。

（1）相態(tài)中蛋白質(zhì)、總糖含量測(cè)定：樣品溶液前處理：稱取適量相態(tài)①③～⑥凍干粉于10 mL量瓶中，平行3份，加超純水超聲溶解并定容，離心（2800×，10 min），取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)、總糖含量測(cè)定。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：取適量相態(tài)①③～⑥溶液，平行3份，加入1%活性炭水浴脫色得樣品溶液。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制BCA工作液及標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸取2 μL樣品溶液于96孔板中，超純水補(bǔ)足至20 μL，加入200 μL工作液，37 ℃孵育30 min后，酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm的吸光度（）值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

總糖含量測(cè)定：采用蒽酮-硫酸法[16]測(cè)定樣品中總糖含量。配制質(zhì)量濃度為0.010～0.075 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液，按體積比4∶1將對(duì)照品溶液與0.2%蒽酮-硫酸溶液混勻，沸水浴10 min，冷卻后于波長(zhǎng)625 nm測(cè)定值，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量相態(tài)①③～⑥溶液，平行3份，按體積比5∶1加Sevage試劑[17]除蛋白并加入1%活性炭脫色后，按上述操作反應(yīng)，測(cè)定值并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總糖含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：相態(tài)①③⑥中總糖含量較高，相態(tài)①③④中蛋白含量較高，且相態(tài)③中2種物質(zhì)含量最高，相態(tài)①次之；共煎液、相態(tài)①③④⑥中總糖含量分別為蛋白的45、47、62、7、100倍。以上結(jié)果表明糖類(lèi)、蛋白在煎煮過(guò)程中溶出良好，且兩者均是相態(tài)①③④的重要組成物質(zhì)；相態(tài)⑥的形成僅與糖類(lèi)密切相關(guān)，蛋白參與較少。

表2 共煎液及親水型相態(tài)中蛋白、總糖及有效成分含量測(cè)定(, n = 3)

（2）親水型相態(tài)中有效成分含量測(cè)定：參照文獻(xiàn)中液相色譜方法[18]，測(cè)定親水型相態(tài)中HSYA和AHSYB的含量。

色譜條件：色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.7%乙酸水溶液-甲醇，梯度洗脫：0～10 min，20%甲醇；10～14 min，20%～35%甲醇；14～20 min，35%～44%甲醇；20～30 min，44%～50%甲醇；后運(yùn)行時(shí)間5 min；檢測(cè)波長(zhǎng)403 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

對(duì)照品溶液的配制：分別取HSYA、AHSYB對(duì)照品適量，加25%甲醇制成質(zhì)量濃度為51.8、88.0 μg/mL的HSYA和AHSYB對(duì)照品溶液。

樣品溶液配制：稱取適量相態(tài)①③～⑥凍干粉于5 mL量瓶中，平行3份，加超純水超聲溶解并定容，10 000×離心10 min，取上清液進(jìn)樣檢測(cè)并計(jì)算各樣品HSYA、AHSYB的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，紅花-桃仁共煎液中HSYA含量為AHSYB的8倍。HSYA和AHSYB主要存在于相態(tài)①③⑥，其在相態(tài)③中的含量分別為共煎液總量的68%和42%，相態(tài)①中分別為共煎液總量的3%和8%，說(shuō)明在混懸、膠體相態(tài)形成過(guò)程中，共煎液中的HSYA、AHSYB在不同相態(tài)間進(jìn)行了重新分布。另外，圖2顯示相態(tài)①③⑥均含有黑色納米粒，提示納米?？赡苁荋SYA、AHSYB的主要傳遞形式，為驗(yàn)證該推論，本實(shí)驗(yàn)將相態(tài)①進(jìn)一步分離并考察HSYA、AHSYB在其中的分布情況。

（3）相態(tài)①分離及有效成分的分布情況考察：取相態(tài)①，加適量超純水分散后，濾過(guò)，得到濾餅為相態(tài)⑦，濾液為相態(tài)⑧，并對(duì)相態(tài)⑧進(jìn)行粒徑分布、ζ電位及微觀形態(tài)表征，分離過(guò)程及表征結(jié)果見(jiàn)圖4。取相態(tài)①⑦⑧溶液適量，平行3份，按“2.1.3（2）”項(xiàng)下方法測(cè)定樣品中HSYA、AHSYB的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，相態(tài)⑧為100～200 nm的小粒子，且相態(tài)①中超過(guò)80%的HSYA、AHSYB集中分布于相態(tài)⑧，表明相態(tài)⑧是HSYA、AHSYB的主要傳遞形式。

綜上，本實(shí)驗(yàn)從紅花-桃仁共煎液中分離得到了1個(gè)親油型相態(tài)和6個(gè)親水型相態(tài)，親水型相態(tài)包括混懸相態(tài)與膠體相態(tài)；對(duì)相態(tài)進(jìn)行化學(xué)組成分析發(fā)現(xiàn)親油型相態(tài)由8種脂肪酸組成，糖類(lèi)、蛋白是親水型相態(tài)的重要組成物質(zhì)，小分子有效成分HSYA、AHSYB主要分布于親水型相態(tài)③⑥⑧中。以上結(jié)果表明，紅花、桃仁中脂肪酸、糖類(lèi)和蛋白等物質(zhì)按不同比例相互作用形成了多種相態(tài)，其中相態(tài)③⑥⑧是紅花有效成分HSYA、AHSYB在湯液中的重要傳遞形式。

2.2 不同煎煮方式對(duì)紅花-桃仁藥對(duì)物相形態(tài)的影響

據(jù)報(bào)道，中藥復(fù)方經(jīng)單煎、分煎合并、共煎提取所得湯液中的成分種類(lèi)、含量及理化性質(zhì)均存在差異[5]，提示煎煮方式對(duì)相態(tài)的形成具有一定影響。本實(shí)驗(yàn)以親油型相態(tài)②、親水型相態(tài)⑥⑧為研究對(duì)象，通過(guò)考察紅花-桃仁藥對(duì)單煎、分煎合并及共煎湯液的相態(tài)差異，探究煎煮方式對(duì)紅花-桃仁藥對(duì)湯液相態(tài)形成的影響。

2.2.1 樣品制備

（1）紅花、桃仁單煎液和分煎合并液中相態(tài)的分離：分別稱取50 g紅花、桃仁（搗碎），加20倍量水浸泡30 min，加熱回流至微沸并保持1 h，趁熱濾除藥渣，各煎煮2次后合并藥液，得2味藥材的單煎液。所得單煎液冷卻后將其等量混合，得紅花桃仁分煎合并液。按“2.1.1”項(xiàng)下分離方法將單煎液、分煎合并液分離得到各相態(tài)。

圖4 相態(tài)①的分離及相態(tài)⑧的形貌表征

表3 相態(tài)①⑦⑧有效成分含量(, n = 3)

相態(tài)分離過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，單煎液、分煎合并液均未得到相態(tài)②。表1結(jié)果顯示，相態(tài)②為油類(lèi)物質(zhì)，且桃仁含有30%～60%的油類(lèi)物質(zhì)，故以桃仁油為對(duì)照，考察煎煮過(guò)程對(duì)相態(tài)②形成的影響。

（2）桃仁油提?。翰捎檬兔烟崛》╗14]提取桃仁油：稱取搗碎后過(guò)一號(hào)篩的桃仁粉適量，置于索氏提取器中，按料液比1∶15加入石油醚，加熱回流一定時(shí)間，濾過(guò)并脫除溶劑，即得黃色清亮的桃仁油。

2.2.2 桃仁油與共煎液相態(tài)②成分比較 將桃仁油與相態(tài)②按“2.1.2（2）”項(xiàng)下方法處理并檢測(cè)，所得總離子流圖如圖5所示。結(jié)果表明，桃仁油含有棕櫚酸、棕櫚油酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亞油酸共6個(gè)脂肪酸成分，3個(gè)苯甲醛衍生物和1個(gè)烷類(lèi)。與相態(tài)②進(jìn)行對(duì)比可知，兩者脂肪酸組成相近，但相態(tài)②中存在少量花生四烯酸及二十烷酸，這可能與紅花中花生酸、二十烷烯酸的溶出[19]有關(guān)。該結(jié)果說(shuō)明共煎促進(jìn)桃仁、紅花中油類(lèi)成分分離，并與其他結(jié)構(gòu)物質(zhì)相互作用，形成穩(wěn)定存在于湯液中的相態(tài)②。

1-棕櫚酸 2-棕櫚油酸 3-十七烷酸 4-硬脂酸 5-油酸 6-亞油酸 7-花生四烯酸 8-二十烷酸

2.2.3 相態(tài)⑥的差異分析 按“2.1.2（1）”項(xiàng)測(cè)定紅花-桃仁單煎、分煎合并液、共煎液中相態(tài)⑥的粒徑、ζ電位及粒子形態(tài)，結(jié)果如圖6所示。共煎液相態(tài)⑥為粒徑分布均勻（平均粒徑約150 nm）、大小相近的類(lèi)球形粒子；與之相比，桃仁、紅花單煎液相態(tài)⑥的平均粒徑較大，分別在360、440 nm左右，粒徑分布范圍也更廣，且形貌均為大小不一的球形粒子；分煎合并液相態(tài)⑥也與共煎液有區(qū)別，其粒徑分布近似于2種單煎液的簡(jiǎn)單加和，平均粒徑約為317 nm，不規(guī)則小粒子和球形粒子共存于相態(tài)中。另外，與共煎液相態(tài)⑥的單峰、負(fù)ζ電位（＜?30 mV）不同，桃仁單煎液相態(tài)⑥帶正電荷（＞30 mV），紅花單煎液與分煎合并液為雙峰、負(fù)ζ電位（＞?10 mV），由于ζ電位絕對(duì)值越大則粒子穩(wěn)定性越好[20]，因此共煎液與桃仁單煎液中相態(tài)⑥穩(wěn)定性更佳。上述結(jié)果表明共煎所得相態(tài)⑥與單煎液、分煎合并液中相態(tài)⑥在形貌、電荷負(fù)載方面存在較大差異，且共煎液相態(tài)⑥粒子均一性、穩(wěn)定性較佳，提示共煎時(shí)紅花、桃仁發(fā)生了單煎、分煎合并中不存在的物理化學(xué)變化，從而形成了與之不同的相態(tài)。

2.2.4 相態(tài)⑧的差異分析 按“2.1.2（1）”測(cè)定紅花-桃仁單煎、分煎合并液、共煎液中相態(tài)⑧的粒徑、ζ電位并觀察粒子形態(tài)，結(jié)果如圖7所示。從粒徑及形貌來(lái)看，共煎液相態(tài)⑧粒徑約為200 nm，由不規(guī)則小粒子組成，桃仁單煎液相態(tài)⑧粒徑較大（約400 nm），為具光暈的類(lèi)球狀粒子；紅花單煎液相態(tài)⑧粒徑偏?。ǎ?20 nm），為大小、形狀不一，內(nèi)部含晶狀粒子的聚集物；分煎合并液粒徑分布最廣，與單煎液相態(tài)⑧相似的類(lèi)球狀粒子與聚集物均有出現(xiàn)；分析ζ電位圖可得，各相態(tài)⑧均帶負(fù)電荷，以紅花單煎液相態(tài)⑧ζ電位絕對(duì)值最小，分煎合并液次之，桃仁單煎液與共煎液相態(tài)⑧ζ電位絕對(duì)值最大，兩者具有較好的穩(wěn)定性。上述結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明紅花-桃仁藥對(duì)共煎形成相態(tài)的原理與單煎、分煎合并不同，共煎所得相態(tài)均一性及穩(wěn)定性更佳。

圖6 單煎液、分煎合并液和共煎液中相態(tài)⑥的微觀形態(tài)、粒徑分布及ζ電位

圖7 單煎液、分煎合并液和共煎液相態(tài)⑧的微觀形態(tài)、粒徑分布及ζ電位

總之，紅花-桃仁藥對(duì)共煎液與單煎液、分煎合并液在相態(tài)的種類(lèi)、微觀形態(tài)等方面存在明顯差異，親油型相態(tài)僅見(jiàn)于共煎液，又以共煎所得親水型相態(tài)的粒子粒徑均一性、穩(wěn)定性最優(yōu)，此類(lèi)相態(tài)或在湯液藥效物質(zhì)傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此，共煎是紅花-桃仁藥對(duì)湯液相態(tài)生成的重要步驟。

3 討論

中藥湯液屬于多相態(tài)體系，現(xiàn)有研究多以相態(tài)系統(tǒng)中的微粒粒徑為參考指標(biāo)進(jìn)行中藥湯液的相態(tài)分離，常用的分離方法有離心法、透析法、場(chǎng)流分離法、過(guò)濾法和凝膠色譜法等[21]。本實(shí)驗(yàn)以微粒溶解性和粒徑為指標(biāo)，結(jié)合離心法、透析法和過(guò)濾法從紅花-桃仁藥對(duì)共煎液中分離得到了1種親油型相態(tài)和6種親水型相態(tài)，使用該方法得到的相態(tài)種類(lèi)更為全面，且操作簡(jiǎn)單、高效。

進(jìn)一步地，采用GC-MS法進(jìn)行親油型相態(tài)成分分析發(fā)現(xiàn)，其組成與桃仁油相近，推測(cè)兩藥共煎過(guò)程中桃仁油在多糖、皂苷等具有良好界面吸附能力的物質(zhì)[22]作用下乳化，并作為疏水性成分的傳遞形式穩(wěn)定存在于湯液中；HPLC和紫外光譜法測(cè)定結(jié)果顯示，3種親水型相態(tài)中糖類(lèi)、蛋白及小分子活性成分HSYA、AHSYB的含量較高，可能是紅花多糖、桃仁蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)或自組裝形成膠束或納米粒[15]后裝載小分子活性成分，從而成為湯液中藥效物質(zhì)的主要傳遞形式。

已有研究表明，藥對(duì)配伍共煎時(shí)原有化學(xué)成分會(huì)發(fā)生取代、氧化還原、異構(gòu)化等多種反應(yīng)，從而生成新的化合物或使原有化合物消失[23]。而本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，紅花-桃仁藥對(duì)共煎形成了單煎、分煎合并液中不存在的親油型相態(tài)，且共煎液中親水型相態(tài)的粒子形貌也不同于單煎、分煎合并液，提示湯液相態(tài)的形成可能與藥對(duì)中物質(zhì)成分在共煎時(shí)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)相關(guān)。除共煎、單煎和分煎合并等煎煮方式外，煎煮容器、煎煮時(shí)間、煎煮用水量和浸泡處置等亦會(huì)影響中藥湯劑的藥效發(fā)揮[24]；考察上述因素對(duì)湯液相態(tài)形成的影響，是中藥湯液相態(tài)研究的重要補(bǔ)充，將有助于充分闡釋中藥復(fù)方煎煮這一傳統(tǒng)中藥制藥方式的科學(xué)內(nèi)涵，促進(jìn)中藥復(fù)方煎煮工序的理論化、規(guī)范化。

綜上，本實(shí)驗(yàn)拆分了紅花-桃仁藥對(duì)湯液中的親油型及親水型相態(tài)，對(duì)所得相態(tài)進(jìn)行微觀形貌和物質(zhì)組成分析，并發(fā)現(xiàn)共煎是該藥對(duì)湯液相態(tài)形成的重要工序，為中藥復(fù)方制藥工藝合理性研究提供了新的思路。紅花-桃仁藥對(duì)相態(tài)形成過(guò)程中物質(zhì)成分的相互作用機(jī)制，以及相態(tài)中藥效成分的溶出、吸收方式及量效關(guān)系等問(wèn)題尚需進(jìn)一步探究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Exploration of delivering effects of decocting process on pharmacodynamic substances of-herb pair based on variation of phase states

TAO Chun-xiao1, YE Tai-wei1, LI Min2, ZHANG Fang3, XIE Yan1

1. School of Public Health, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. The Office of Experts Committee, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 3. Innovative Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

To explore the delivering effects of decocting process on the pharmacodynamic substances in-herb pair based on the phase state differences.The phase states of the co-decoction were separated using ultracentrifugation and dialysis, and the particle size, ζ potential, and microscopic morphology of each phase state were characterized by Zetasizer Nano ZS instrument and transmission electron microscope. The content of fatty acids, proteins, saccharine, hydroxysafflor yellow A (HSYA) and anhydrosafflor yellow B (AHSYB) were determined by gas chromatography, UV spectrophotometry and HPLC. The effects of decoction modes on phase states formation were investigated by splitting the phase states in single-, merged- and co-decoction and then comparing the composition or microscopic forms of phase states in different decoctions.One oleophilic phase state ② and six hydrophilic phase states including ①, ③, ④, ⑤, ⑥, and ⑧were isolated from-herb pair decoction; The oleophilic phase state consisted of eight fatty acids including palmitic acid, palmitoleic acid, margaric acid, stearic acid, oleic acid , linoleic acid, arachidonic acid, and arachidic acid and the hydrophilic phases were mainly miscible or colloidal phase states with the particle size ranging from 20 to 1000 nm. Both saccharine and proteins are important constituents of the hydrophilic phases, and HSYA, AHSYB are predominantly distributed in the hydrophilic phases ③, ⑥ and ⑧. Co-decocting can form oleophilic phase state, whose fatty acid composition is similar to that of peach kernel oil. The microscopic morphology of hydrophilic phases ⑥ and ⑧ in single-, merged- and co-decoction are slightly different, and phases ⑥ and ⑧ in co-decoction present the good particle size uniformity and stability.The phase state is an important form for delivering the pharmacodynamic substances in-herb pair, and the decocting process, especially the co-decocting, is the essential procedure for the formation of the effective phase states of this herb pair.

herb pairs;;; decocting process; phase state; ultracentrifugation; microdialysis technique; fatty acids; proteins; saccharine; hydroxysafflor yellow A; anhydrosafflor yellow B; pharmacodynamic substance delivery

R283.6

A

0253 - 2670(2023)17 - 5550 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.009

2023-02-21

上海市衛(wèi)生健康學(xué)科帶頭人項(xiàng)目（2022XD026）

陶春曉（2000—），女，碩士研究生，主要從事中藥制劑新技術(shù)的研究與應(yīng)用。

謝 燕（1978—），女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥制劑新技術(shù)的研究與應(yīng)用。Tel: (021)51322440 E-mail: rosexie_2004@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]