HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌抑癌基因甲基化異常及機(jī)制的研究進(jìn)展

陳映均 劉同剛

原發(fā)性肝癌目前是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居世界第七位，死亡率已位居世界第三位[1]。肝細(xì)胞癌（HCC）作為原發(fā)性肝癌中最為多見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型，占原發(fā)性肝癌總數(shù)的85%～90%[2]。肝細(xì)胞癌是一種復(fù)雜的多基因多因素疾病，它的發(fā)生發(fā)展受遺傳因素和環(huán)境因素共同作用。多種研究表明，影響肝癌的因素包括乙型肝炎病毒（HBV）感染、丙型肝炎病毒（HCV）感染、飲酒、非酒精性脂肪性肝病等[3]。其中，HBV 感染是我國(guó)公認(rèn)的導(dǎo)致肝臟細(xì)胞發(fā)生癌變的主要危險(xiǎn)因素[4]。HBV 誘導(dǎo)的HCC 的發(fā)病機(jī)制涉及點(diǎn)突變、染色體畸變、表觀遺傳學(xué)變化等多個(gè)方面[5]。愈來(lái)愈多證據(jù)顯示表觀遺傳機(jī)制參與了惡性腫瘤的發(fā)病過(guò)程。DNA 甲基化作為表觀遺傳修飾中最主要的修飾類(lèi)型之一，通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生[6-7]，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控及基因表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8-9]。HBV 感染可能會(huì)加快基因甲基化的進(jìn)程，繼而導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的發(fā)生[10-11]。DNA 甲基化及其誘導(dǎo)的表觀遺傳的改變，為探索HCC 更具特異性的生物標(biāo)志物及更具針對(duì)性的治療手段提供了幫助[12-13]。HBV 感染作為HCC 發(fā)病的最重要危險(xiǎn)因素之一，它如何引起宿主細(xì)胞中腫瘤抑制基因的異常高甲基化的機(jī)制仍不清楚。因此，亟待進(jìn)一步了解HBV 相關(guān)HCC 的分子機(jī)制，尋找新的基因標(biāo)記物或靶點(diǎn)，以便早期診斷及治療肝癌。

1 HBV感染與肝細(xì)胞癌

HBV 慢性感染已經(jīng)被公認(rèn)為21 世紀(jì)肝癌發(fā)病的高危因素[14]。以往多種研究表明，影響肝癌的因素包括HBV 感染、HCV 感染、飲酒、非酒精性脂肪性肝病、長(zhǎng)期攝入黃曲霉素、肥胖、2 型糖尿病和吸煙等[3]。其中，HBV 感染是我國(guó)公認(rèn)的導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生癌變的主要危險(xiǎn)因素。有數(shù)據(jù)證實(shí)我國(guó)HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌患者發(fā)病率約占肝細(xì)胞癌患者總數(shù)的80%以上[2]。肝細(xì)胞癌的發(fā)病率及死亡率一直居高不下，原因在于HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌的早期診斷及晚期治療方法有限，對(duì)化療和放療的耐藥性強(qiáng)，肝臟移植供體資源短缺[15]，肝移植復(fù)發(fā)率高，以及人們對(duì)疾病或日常健康管理的認(rèn)識(shí)不足。肝細(xì)胞癌的發(fā)生與HBV 的直接和間接感染機(jī)制都有關(guān)，HBV 感染HCC 的因素包括慢性感染、HBV 復(fù)制水平高、HBV 基因型、HBV 整合、HBV 突變體和HBV 編碼腫瘤蛋白[16]。此外，慢性HBV 感染時(shí)，宿主免疫反應(yīng)引起的反復(fù)的肝臟炎癥可導(dǎo)致肝臟纖維化和肝硬化，加速肝細(xì)胞的更新增殖速率，促進(jìn)突變因子的累積。因此，控制HBV 已刻不容緩，探究DNA 甲基化引起HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌的作用機(jī)制對(duì)肝細(xì)胞癌的預(yù)后具有重要意義。

2 HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌與DNA甲基化

DNA 甲基化作為重要的表觀遺傳修飾之一，其并沒(méi)有改變遺傳信息，只是改變了DNA 的可讀性，并通過(guò)后續(xù)mRNA 轉(zhuǎn)錄抑制使基因失活[17]。研究已經(jīng)證實(shí)許多顯著基因的異常甲基化表達(dá)在肝癌細(xì)胞成瘤過(guò)程中發(fā)揮了作用[18]。DNA 甲基化是以原癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化為特征[19]，被認(rèn)為是癌癥進(jìn)展中的重要事件。越來(lái)越多的證據(jù)表明，DNA 甲基化可以引起特異性抑癌基因（tumour suppressor gene，TSG）的失活和不同癌基因的異常激活[20]，異常的TSG 甲基化模式與HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌的發(fā)生有直接關(guān)系。表觀遺傳調(diào)控基因啟動(dòng)子中的CpG 島的高甲基化可能導(dǎo)致抑癌基因的沉默，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[21-22]。HBV 感染過(guò)程中導(dǎo)致肝細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)增加的誘因可能是DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）基因的上調(diào)[23]。DNA 甲基化與去甲基化之間的循環(huán)過(guò)程通常是HBV 感染導(dǎo)致DNMTs 表達(dá)變化的過(guò)程，特別是從肝硬化到肝細(xì)胞癌的過(guò)程[24]。研究證實(shí)，HBV 感染與DNA 甲基化相互作用，相互影響。HBV 的感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌發(fā)生DNA 甲基化的一個(gè)誘因，而DNA 甲基化也會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)HBV 相關(guān)的肝細(xì)胞癌的發(fā)展[25]。

3 HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌的抑癌基因異常甲基化和表達(dá)

在HBV 相關(guān)腫瘤中，HBV 基因組受到廣泛的DNA 甲基化調(diào)控[26]。HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌中，許多基因受表觀遺傳學(xué)作用出現(xiàn)異常甲基化現(xiàn)象，如RAS 相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族蛋白1A（RAS association domain family 1A，RASSF1A）、細(xì)胞周期調(diào)控家族基因（cell cycle regulation family genes，P16）、谷胱甘 肽-S- 轉(zhuǎn) 移 酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）、分泌卷曲相關(guān)蛋白（secretfrizzered-related proteins，SFRP）、細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）、長(zhǎng)散布核元件-1（long interspersed nuclear element-1，LINE-1）等在HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌中均存在不同程度的異常甲基化[27-32]。DNA 甲基化是HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌中腫瘤抑制基因失活的重要渠道，抑癌基因啟動(dòng)區(qū)甲基化的異常升高會(huì)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，影響基因表達(dá)從而推動(dòng)腫瘤發(fā)生和發(fā)展。

3.1 RASSFlA 的異常甲基化和表達(dá)

啟動(dòng)子的高甲基化可能導(dǎo)致腫瘤組織中抑癌基因的沉默[21-22]。其中，RASSF1A 是RASSF1 基因的八個(gè)亞型之一，位于人類(lèi)3 號(hào)染色體p21.3 上，是一種重要的具有多種生物學(xué)功能的腫瘤抑制因子[21]。癌癥發(fā)生時(shí)，RASSF1A 往往由于突變、雜合性喪失及最常見(jiàn)的啟動(dòng)子高甲基化等因素而被滅活[33]。研究發(fā)現(xiàn)，RASSF1A 的表觀遺傳失活在多種類(lèi)型癌癥中都有表現(xiàn)，當(dāng)前RASSF1 啟動(dòng)子甲基化研究多集中于表觀遺傳腫瘤生物標(biāo)志物上[34-35]。Peng 等[10]抽取HBV/HCV 相關(guān)HCC 樣本1 015 份，非腫瘤對(duì)照1 225 份，檢測(cè)到與非腫瘤樣本相比，HBV/HCV 相關(guān)腫瘤病例中RASSF1A 甲基化頻率顯著增加。這表明RASSF1A 異常甲基化可能參與了HBV/HCV 誘導(dǎo)的肝癌的發(fā)生和進(jìn)展，RASSF1A 甲基化表達(dá)可能是一個(gè)潛在的表觀遺傳生物標(biāo)志物。Xu 等[27]基于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)Meta 分析和Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)RASSF1A 啟動(dòng)子甲基化率在HCC 患者中顯著高于非腫瘤患者和健康人群，且與HBV 感染陽(yáng)性和腫瘤大小顯著相關(guān)。并且，ROC 曲線證實(shí)RASSF1A 啟動(dòng)子甲基化可能是反映HCC 預(yù)后的一個(gè)標(biāo)記[36]。這些研究表明，RASSF1A 啟動(dòng)子高甲基化是HCC 早期診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物。

3.2 P16 基因的異常甲基化和表達(dá)

P16 基因是一個(gè)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行周期性調(diào)控的基因家族，位于人類(lèi)染色體9p21 上，由3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子組成，是一種周期蛋白依賴的激酶抑制劑。P16 作為抑癌基因，其啟動(dòng)子能被甲基化沉默，并且研究發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)腫瘤疾病的進(jìn)程中，其活性常因微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的破壞呈現(xiàn)紊亂的狀態(tài)[37]。已有P16 基因啟動(dòng)子甲基化出現(xiàn)在HBV 相關(guān)HCC 報(bào)道中。Li 等[28]Meta 分析鑒定出GSTP1 與P16 基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌易感性升高具有較強(qiáng)相關(guān)性，啟動(dòng)子區(qū)GSTP1 和P16 的甲基化能夠顯著升高肝硬化患者發(fā)生HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)。Lv 等[38]Meta 分析選取了3 105 例HCC 患者和808 例非腫瘤患者（包括慢性肝炎和肝硬化），結(jié)果顯示HCC 患者的P16 啟動(dòng)子甲基化發(fā)生率顯著高于慢性肝炎患者。此外，大于50 歲的患者P16 啟動(dòng)子甲基化顯著高于50 歲以下的患者，且HBV 相關(guān)HCC患者P16 啟動(dòng)子甲基化顯著高于病毒陰性的HCC患者。由此可見(jiàn)，P16 甲基化程度與患者年齡大小、是否感染乙型肝炎病毒密切相關(guān)。上述結(jié)果均提示HBV 感染可誘導(dǎo)P16 基因的高甲基化和異常表達(dá)，對(duì)HBV 相關(guān)HCC 的發(fā)生、發(fā)展具有促進(jìn)作用。

3.3 GSTP1 基因的異常甲基化和表達(dá)

GSTP1 屬于參與多種致癌物代謝的酶類(lèi)家族，含有亞基多肽的二聚體酶。GSTP1 是由GSTPi 基因編碼的同工酶，在降低毒性、抗氧化和降低疾病發(fā)生率等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[39]。GSTP1 通常通過(guò)G 位點(diǎn)特異性地與谷胱甘肽（glutathione，GSH）或GSH 類(lèi)似物結(jié)合，并催化谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）氨基酸殘基與GSH 硫醇及H 位點(diǎn)上的傳統(tǒng)親電試劑之間的相互作用[40]。因此，G 位點(diǎn)修飾通常有助于特異性GSTP1抑制劑的產(chǎn)生。國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)，GSTP1 在肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、食管癌、膀胱癌、甲狀腺癌等各種類(lèi)型的腫瘤和癌前病變中表達(dá)顯著增高[39，41]。在HBV 相關(guān)的HCC 中，Niu 等[42]報(bào)道了常見(jiàn)的GSTP1 基因高甲基化和低蛋白表達(dá)，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜脫氧胞苷逆轉(zhuǎn)了HepG2 細(xì)胞中GSTP1 的高甲基化。Li 等[28]通過(guò)Meta 分析證實(shí)了肝癌組織中，GSTP1 基因的甲基化率顯著高于正常組織及肝硬化組織，啟動(dòng)子區(qū)GSTP1 的甲基化可明顯增加肝硬化患者發(fā)生HBV 相關(guān)HCC 的風(fēng)險(xiǎn)。以上研究證實(shí)GSTP1 基因的高甲基化可以促進(jìn)HBV相關(guān)HCC 的發(fā)生、發(fā)展，并且可能為HCC 分子標(biāo)志物檢測(cè)提供方向。

3.4 SFRP1 和SFRP5 基因的異常甲基化與表達(dá)

分泌卷曲相關(guān)蛋白是一個(gè)分泌糖蛋白家族，是直接結(jié)合Wnt 配體和拮抗Wnt 信號(hào)通路的胞外信號(hào)分子，其表觀遺傳下調(diào)已被證明參與了肝癌的發(fā)生。Huang 等[43]對(duì)105 例肝癌患者和50 例對(duì)照組血漿進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)SFRP1 基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG 島高甲基化和LINE1 基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG 島的LINE1低甲基化均與HBsAg 及甲胎蛋白（AFP）值相關(guān)。Xie 等[32]研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒X 蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）顯 著 降 低 了 肝 癌 細(xì) 胞 中SFRP1 和SFRP5 的表達(dá)，并且在HBx 表達(dá)的肝癌細(xì)胞和HBV 相關(guān)HCC 組織中，SFRP1 和SFRP5 啟動(dòng)子都存在高甲基化。他們還發(fā)現(xiàn)HBV 相關(guān)HCC組織中，SFRP1 和SFRP5 的下調(diào)與DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）過(guò)表達(dá)和腫瘤分化不良顯著相關(guān)，HBx 可以促進(jìn)DNMT1 和DNMT3A 與SFRP1 和SFRP5 啟動(dòng)子的結(jié)合，導(dǎo)致SFRP1 和SFRP5 的表觀遺傳沉默。這些結(jié)果都證明SFRP1 啟動(dòng)子的甲基化是HCC 發(fā)展過(guò)程中常見(jiàn)的表觀遺傳異常變化，對(duì)肝癌早期階段的發(fā)展可能具有相關(guān)性。

3.5 SOCS1 和SOCS3 基因的異常甲基化與表達(dá)

細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子家族基因是γ-STAT 信號(hào)通路的經(jīng)典負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子[44]。哺乳動(dòng)物SOCS家族由八個(gè)成員組成，包括細(xì)胞因子誘導(dǎo)的SH2 含蛋白（CIS）和SOCS1 至SOCS7。據(jù)報(bào)道，SOCS家族通過(guò)抑制酪氨酸激酶/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋 白（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）、核 轉(zhuǎn) 錄 因 子-kappa B（nuclear factor-Kappa B，NF-κB）等 信 號(hào) 通 路 及促進(jìn)p53 等信號(hào)通路在抑制腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[45]。Zhang 等[46]定量檢測(cè)了116 例HBV 相關(guān)HCC 患者SOCS1-7 基因的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOCS1 基因在腫瘤組織表現(xiàn)出更高的甲基化強(qiáng)度。此外，在HCC 細(xì)胞系中，SOCS1 異位過(guò)表達(dá)可激活p53 信號(hào)通路，所以SOCS1 的基因丟失和表觀遺傳沉默與HBV 相關(guān)的HCC 可能有所聯(lián)系。Hoan 等[29]的結(jié)果顯示與HBV 陰性HCC 腫瘤組織相比，感染HBV 的HCC 腫瘤組織中SOCS3 表達(dá)增加。Yuan 等[47]發(fā)現(xiàn)HBV 誘導(dǎo)的線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累會(huì)抑制SOCS3并持續(xù)激活白細(xì)胞介素-6/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3 （interleukin-6/signal transducer and activator of transcription 3，IL-6/STAT3）通路。此外，HBV 誘導(dǎo)的ROS 積累被證明促進(jìn)了鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail）的表達(dá)，該轉(zhuǎn)錄因子與SOCS3 啟動(dòng)子的e-box 結(jié)合，介導(dǎo)了DNMT1 和組蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）與SOCS3 的表觀遺傳沉默。這些結(jié)果都提示SOCS1 和SOCS3 的甲基化可能是HBV 相關(guān)HCC 發(fā)展過(guò)程中常見(jiàn)的異常表觀遺傳變化，對(duì)患者的生存、預(yù)后可能會(huì)造成影響。

3.6 LINE-1 基因的異常甲基化與表達(dá)

LINE-1 大小為6 kd，是重復(fù)DNA 元件的重要組成部分之一，約占人類(lèi)基因組序列的17%，但由于5'截?cái)?，大部分LINE-1 不活躍[48]。有報(bào)道稱LINE-1 低甲基化可作為肝癌診斷和指導(dǎo)治療策略的新標(biāo)志物，特別是LINE-1 啟動(dòng)子的低甲基化被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)[49-50]。Gao 等[51]在臨床隊(duì)列中評(píng)估了LINE-1 啟動(dòng)子在每個(gè)CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示，與HBV 相關(guān)肝硬化相比，近90%的HCC 顯示LINE-1 啟動(dòng)子低甲基化，這也提示LINE-1 啟動(dòng)子低甲基化（特別是在CpG 位點(diǎn)7 和18）是患者生存時(shí)間顯著縮短的原因，與肝癌的不良預(yù)后相關(guān)。Qiao 等[52]將HBV 相關(guān)HCC 患者和慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者進(jìn)行隊(duì)列研究，結(jié)果顯示HCC 組LINE-1 甲基化明顯低于CHB組，進(jìn)一步說(shuō)明了LINE-1 甲基化水平與HBV 相關(guān)HCC 的發(fā)生密切相關(guān)。以上證據(jù)都證明了LINE-1 可以作為新型標(biāo)志物在肝癌診斷方面具有重要作用。

3.7 其他基因的異常甲基化與表達(dá)

鋅指蛋白382（ZNF382）屬于鋅指蛋白家族，ZNF382 基因位于染色體19q13.13，編碼一個(gè)約64 kDa 的 鋅 指 蛋 白[53]。Dang 等[54]發(fā) 現(xiàn)ZNF382 在HBV 相關(guān)HCC 中（相對(duì)于HBV 感染的肝硬化組織）常被啟動(dòng)子甲基化下調(diào)，并且ZNF382 的表達(dá)下降與早期HCC 患者的低生存率密切相關(guān)。另外，有研究證實(shí)，HCC 患者Wnt 誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白1（Wnt inducible signaling pathway protein 1，WISP1）的甲基化與肝癌患者預(yù)后相關(guān)[55-57]。同樣，Arzumanyan 等[58]認(rèn)為HBV 感染可能導(dǎo)致E-鈣粘蛋白（E-cadherin，E-Cad）啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化。Liu 等[59]還指出，HBx 與E-Cad 啟動(dòng)子的高甲基化有關(guān)，并進(jìn)一步指出，E-Cad 表達(dá)的減少可能與細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核中-連環(huán)蛋白的積累有關(guān)，導(dǎo)致細(xì)胞遷移增加，從而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。此外，Yan等[60]報(bào)道稱，非受體酪氨酸蛋白磷酸酶13 型（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 13，PTPN13）在HBV 陽(yáng)性肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著下降。研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A 以一種與DNA 甲基化增加相關(guān)的表觀遺傳制模式與PTPN13 啟動(dòng)子（-343～-313 bp）結(jié)合，并隨后抑制PTPN13 轉(zhuǎn)錄。Fan 等[61]通過(guò)對(duì)HBV 相關(guān)HCC 和成對(duì)腫瘤周?chē)谓M織分離的DNA 進(jìn)行硫酸氫鈉測(cè)序，發(fā)現(xiàn)STAT3 和八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）通過(guò)與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（transcription start site，TSS）下游位點(diǎn)的染色質(zhì)重塑蛋白1（Brahma-related gene 1，BRG1）結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄因子婆羅雙樹(shù)樣基因4（spalt-like transcription factor 4，SALL4）基 因在HBV 復(fù)制、分化的肝細(xì)胞中重新表達(dá)?？傊琙NF382 等相關(guān)抑癌基因的異常甲基化已經(jīng)被證實(shí)對(duì)肝癌的進(jìn)展具有重要作用，但目前對(duì)于這些基因進(jìn)行的相關(guān)研究很少，其具體機(jī)制尚未得到充分探究，未來(lái)對(duì)該領(lǐng)域進(jìn)行更深層次的挖掘?qū)?huì)對(duì)肝癌的診斷和治療大有幫助。HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌中11 個(gè)異常甲基化基因的特征見(jiàn)表1。

表1 HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌中11個(gè)異常甲基化基因的特征

4 HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展

許多研究表明，HBV 相關(guān)的HCC 患者DNA 甲基化水平明顯高于未受感染的肝癌患者，且68%的甲基化基因都與癌癥的發(fā)展有關(guān)，這表明HBV感染可能影響肝癌組織的基因甲基化[59-61]。但是，HBV 感染如何通過(guò)DNA 甲基化誘導(dǎo)HBV 相關(guān)的HCC 發(fā)生的機(jī)制尚未闡明。有研究顯示，HBV 結(jié)構(gòu)蛋白（主要是HBx 蛋白）在HBV 相關(guān)HCC 的表觀遺傳學(xué)中發(fā)揮著重要作用，它通過(guò)增加DNMT1 和DNMT3A 的表達(dá)，調(diào)控癌基因及沉默抑癌基因的表達(dá)。HBx 可以促進(jìn)甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1 和DNMT3A結(jié)合到SFRP1 和SFRP5 的基因啟動(dòng)子上，沉默SFRP1 和SFRP5，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[32]。另外，抑制DNMT1 可以使Wnt 信號(hào)失活，降低Wnt 靶基因C-Myc 和 細(xì) 胞 周 期 素D1（cyclin D1，CCND1）的表達(dá)水平，從而阻礙HBV 相關(guān)HCC 在體內(nèi)外的生長(zhǎng)和侵襲。此外，Yan 等[60]發(fā)現(xiàn)HBx 通過(guò)上調(diào)DNMT3A 的表達(dá)并與DNMT3A 相互作用來(lái)抑制PTPN13 的表達(dá)。DNMT3A 以表觀遺傳學(xué)控制的方式與PTPN13 啟動(dòng)子結(jié)合，使PTPN13 甲基化，抑制PTPN13 轉(zhuǎn) 錄。另 外，HBx 通 過(guò)DNMT3A1 和DNMT3A2 的新甲基化，以及通過(guò)招募甲基CpG 結(jié)合蛋白2（MECP2）到新甲基化的SP1 結(jié)合元件來(lái)抑制SP1 的結(jié)合，特異性地抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子-3（IGF3）表達(dá)[62]。這表明HBx 和DNMT3A的相互作用促進(jìn)了不同基因組位點(diǎn)的細(xì)胞表觀遺傳修飾（通過(guò)區(qū)域高甲基化或低甲基化）。HBx 還可以通過(guò)下調(diào)DNMT3B 誘導(dǎo)人類(lèi)衛(wèi)星2 重復(fù)序列（HSATII）的全局低甲基化?？傊?，在HBV 感染的HCC 患者中，HBx 的這些特定甲基化異常的發(fā)生率與HBx 的表達(dá)明顯相關(guān)，HBV 的表觀遺傳重塑在HCC 的進(jìn)展過(guò)發(fā)病機(jī)制程中起著重要的作用。

5 DNA甲基化研究在HCC中的臨床應(yīng)用

目前，以血清甲胎蛋白為代表的肝癌血清生物標(biāo)志物在肝癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷中發(fā)揮著重要作用[63]。然而，其臨床應(yīng)用一直存在爭(zhēng)議[64]。當(dāng)AFP值為20 g/L 時(shí)，診斷的敏感度在55%～60%，肝癌早期臨床診斷的敏感度較低[65]。此外，患者血清中AFP 升高也可能反映慢性肝炎、肝硬化等疾病，經(jīng)常導(dǎo)致誤診[66]。DNA 甲基化異常是HCC 表觀遺傳改變的主要介導(dǎo)因子[67]，目前已被證實(shí)與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，某些抑癌基因的異常DNA 甲基化可能是早期診斷疾病的一種潛在的生物標(biāo)志物[27，68-69]。因此，對(duì)正常細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)具有重要意義。目前已有許多方法可以用于分析腫瘤組織或健康組織的DNA 甲基化水平，包括甲基化特異性PCR（MS-PCR）、亞硫酸氫鹽、熒光定量法（Methylight）等[70]。Pasha 等[71]發(fā)現(xiàn)在HCC 診斷中，聯(lián)合檢測(cè)AFP 和RASSF1A 基因甲基化狀態(tài)及聯(lián)合檢測(cè)AFP 和SOCS1 基因甲基化狀態(tài)比單獨(dú)檢測(cè)AFP 更有益處。RASSF1A 啟動(dòng)子甲基化與血清AFP 聯(lián)合使用，可作為HCC 診斷和預(yù)后的高效生物標(biāo)志物。Chen 等[57]研究發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)使用AFP 或WISP1 甲基化狀態(tài)相比，WISP1 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與AFP 聯(lián)合檢測(cè)顯著提高了區(qū)分HCC與CHB 的診斷能力。由此可見(jiàn)，WISP1 基因啟動(dòng)子的低甲基化可作為檢測(cè)HBV 相關(guān)HCC 的非侵入性生物標(biāo)志物。異常基因啟動(dòng)子超甲基化已被提出作為診斷實(shí)體腫瘤的一種有效手段。因此，使用強(qiáng)有力的指標(biāo)對(duì)慢性HBV 感染患者進(jìn)行定期評(píng)估，將有助于提高肝癌診斷和治療的及時(shí)性。

6 總結(jié)與展望

HBV 感染到肝癌細(xì)胞出現(xiàn)涉及腫瘤微環(huán)境和遺傳等多方面的因素相互作用，多種機(jī)制共同參與了這一進(jìn)程，而在這些HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制中，DNA 甲基化發(fā)揮著具有其典型特色的關(guān)鍵作用。更重要的是，隨著臨床方面現(xiàn)有的腫瘤治療手段出現(xiàn)越來(lái)越多的治療抵抗現(xiàn)象，預(yù)示著僅僅依靠現(xiàn)有的途徑無(wú)法達(dá)到顯著的治療效果，迫使大家必須去尋求更為高效的、特異性的治療靶點(diǎn)。因此，尋找DNA 甲基化致使抑癌基因沉默的原因，深入研究DNA 甲基化在HBV 相關(guān)HCC 發(fā)病過(guò)程中的作用，對(duì)于闡明HBV 相關(guān)HCC 的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。DNA 甲基化有可能是腫瘤早期診斷的一個(gè)非常有前景的指標(biāo)，而針對(duì)甲基化治療的DNA 甲基化抑制劑則有較強(qiáng)的特異性，仍需更深入的研究。