復(fù)方血竭跌打膏的制劑工藝、指紋圖譜及含量測定研究＊

郭星妤，俞越童，崔述生，孫 波，翟恩愛，于淑琳，鄒慧琴＊＊，閆永紅＊＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102401；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700；3. 北京市鼓樓中醫(yī)醫(yī)院 北京 100009）

復(fù)方血竭跌打膏由血竭、乳香、沒藥等十味中藥配伍組成，原方為崔氏速效損傷靈藥膏，來源于北京市鼓樓中醫(yī)醫(yī)院，是國家級(jí)名老中醫(yī)、首都名中醫(yī)崔述生教授在長期臨床實(shí)踐中研發(fā)出的用于治療急性軟組織損傷的驗(yàn)方，臨床療效確切。隨著使用需求不斷擴(kuò)大，由蜂蜜混合、現(xiàn)用現(xiàn)配制成的糊劑已無法滿足臨床使用及藥品存儲(chǔ)需求。水包油型（O/W）乳膏劑能夠較好的分散樹脂類油溶性藥物和水溶性藥物，具有容易涂布、無油膩感、便于清洗的優(yōu)點(diǎn)，更適合本制劑的臨床使用需求[1]。傳統(tǒng)的中藥質(zhì)量評價(jià)方法包括定性鑒別與含量測定，而中藥復(fù)方制劑具有多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用發(fā)揮療效的特點(diǎn)，其質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)要針對多成分測定、全過程評價(jià)[2]。

課題組前期已完成對原料藥的提取工藝優(yōu)化[3]，本研究在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下結(jié)合現(xiàn)代制劑技術(shù)，制備出工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控的復(fù)方血竭跌打膏，建立了HPLC 指紋圖譜并測定了三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量，以期為復(fù)方血竭跌打膏臨床擴(kuò)大使用提供安全可靠的保障，并促進(jìn)臨床驗(yàn)方從“方”向“藥”的發(fā)展[4]。

1 材料

1.1 儀器

AK20002 電子天平（成都倍賽克儀表研究所）；電風(fēng)鼓吹干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州恒巖儀器有限公司）；BY-400C 型醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司），Waters e2695 高效液相色譜儀（Waters 2489 PDA 檢測器，美國）；Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；FW-100 高速萬能粉碎機(jī)型（北京科偉永興儀器有限公司）；HH-S6A電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

血竭（批號(hào)：1806002）、乳香（批號(hào)：1805002）、沒藥（批號(hào)：1805002）、續(xù)斷（批號(hào)：1801006）、三七（批號(hào)：1804001）、延胡索（批號(hào)：1806003、210912）、紅花（批號(hào)：1805004、201214001、210613001）、青黛（批號(hào)：1805002）、骨碎補(bǔ)（批號(hào)：1806001、180101、1906030），鹿筋購自安國興華藥業(yè)有限公司。硬脂酸，硬脂醇，白凡士林，羊毛脂，單硬脂酸甘油酯，液體石蠟，甘油，三乙醇胺，十二烷基硫酸鈉，尼泊金乙酯，吐溫80均為藥用輔料；柚皮苷對照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：5562），延胡索乙素對照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：5066），血竭素高氯酸鹽對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y17M9H56341），人參皂苷Rg1對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：G16S10Y97436）；人參皂苷Rb1對照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：7672）；三七皂苷R1對照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：5365）；川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：5688）；甲醇、正丁醇、氨水、無水乙醇均為分析純；乙腈為色譜純；娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 乳膏劑制備工藝

2.1.1 處方基質(zhì)篩選

以軟膏的均勻度、細(xì)膩度、稠度、涂展性、有無氣泡、油膩性等6方面為外觀性狀評價(jià)指標(biāo)；以膏體是否發(fā)粗、有無油水分離兩方面為高、低溫實(shí)驗(yàn)評價(jià)指標(biāo)；以有無出現(xiàn)油水分離、藥物沉淀兩方面為離心實(shí)驗(yàn)評價(jià)指標(biāo)[5-8]，篩選最優(yōu)處方[9-11]，評分結(jié)果見表1。初步定為處方7：硬脂酸10 g、液體石蠟7 g、單硬脂酸甘油酯5 g、羊毛脂2 g、白凡士林6 g、十二烷基硫酸鈉1 g、甘油10 g。具體制法為：將硬脂酸、液體石蠟、單硬脂酸甘油酯、白凡士林、羊毛脂，置于燒杯中水浴加熱至熔融，油相備用；再取十二烷基硫酸鈉、甘油、水，置于燒杯中水浴加熱至溶解，水相備用；分別加入濃縮藥液，將水相加入油相乳化，加入藥物極細(xì)粉攪拌均勻，即得。

表1 基質(zhì)處方篩選結(jié)果

2.1.2 基質(zhì)配比優(yōu)化

（1）單因素實(shí)驗(yàn)考察基質(zhì)用量

采用單因素實(shí)驗(yàn)考察硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸鈉等基質(zhì)的用量，確定星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素和水平，單因素實(shí)驗(yàn)考察因素與水平見表2。此外，由于白凡士林∶液體石蠟的用量對藥膏離心穩(wěn)定、耐寒耐熱性影響較大，故對二者比例進(jìn)行考察。

表2 單因素考察因素與水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：甘油用量為10 g 時(shí)綜合評分最高；白凡士林:液體石蠟用量為3 g∶6 g 時(shí)，外觀性狀和穩(wěn)定性都較好，綜合評分最高。而硬脂酸用量在10 g、15 g 綜合評分最高；單硬脂酸甘油酯用量在3 g、6 g 綜合評分最高；十二烷基硫酸鈉用量在1 g、2 g 綜合評分最高；羊毛脂用量在1 g、3 g綜合評分最高。綜上，固定100 g 處方中，白凡士林用量為3 g，液體石蠟用量為6 g，甘油用量為10 g，選擇硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸鈉、羊毛脂四項(xiàng)為響應(yīng)面考察因素，用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法（CCD-RSM）優(yōu)化處方基質(zhì)配比。

（2）CCD-RSM優(yōu)化處方基質(zhì)配比

參考文獻(xiàn)[12-14]，根據(jù)單因素考察結(jié)果，采用designexpert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案和處理數(shù)據(jù)結(jié)果。因素水平表見表3，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見表4。

表3 CCD實(shí)驗(yàn)因素的代碼水平及其對應(yīng)的物理量

表4 CCD實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

將表4 中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用design expert 8.0.6 軟件處理，得到方差分析結(jié)果，見表5，同時(shí)進(jìn)行回歸方程擬合，得到二次回歸方程：Y=46.33-1.88A+5.37B-1.79C-1.21D-0.94AB+0.81BC+0.063AD+0.81BC+1.56BD-0.19CD-2.53A2-0.66B2-0.16C2-0.78D2（R2=0.9414，P＜0.0001）。根據(jù)擬合出的二次回歸方程，采用design expert 8.0.6軟件進(jìn)一步做出各因素間交互作用的三維響應(yīng)面圖，見圖1。

圖1 交互作用響應(yīng)面圖

表5 響應(yīng)面方差分析表

擬合方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9414，表明模型預(yù)測值與實(shí)測值有較高的關(guān)性，回歸方程擬合度好，預(yù)測性好；由表4 方差分析可知，擬合出的模型P＜0.0001，說明模型具有顯著性；模型的失擬項(xiàng)P=0.1461＞0.05，不具有顯著性，表明回歸方程擬合較好，可用于本實(shí)驗(yàn)的處方基質(zhì)配比優(yōu)化。由各因素的F值可以比較出四個(gè)因素對藥膏成型的影響顯著性順序?yàn)椋築＞A＞C＞D，A、B、C、D 四個(gè)因素的P值均小于0.05，表明四個(gè)因素都具有顯著影響，交互作用中BD 有顯著影響，其余交互作用無顯著影響。

采用design expert 8.0.6軟件在使綜合評分最大情況下，得到最佳基質(zhì)用量為：硬脂酸10.7 g、單硬脂酸甘油酯6.0 g、十二烷基硫酸鈉1.0 g、羊毛脂3.3 g。

（3）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按確定的最佳基質(zhì)配比條件平行制備出三批復(fù)方血竭跌打膏，對軟膏的外觀性狀、高溫實(shí)驗(yàn)、低溫實(shí)驗(yàn)、離心實(shí)驗(yàn)進(jìn)行綜合評分，結(jié)果見表6。由表6可知，相對誤差為2.66%，說明實(shí)測值與預(yù)測值偏差較小，擬合出的模型具有良好的預(yù)測性，優(yōu)選出的最佳基質(zhì)配比科學(xué)合理，穩(wěn)定可行。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 指紋圖譜

2.2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相水（A）-乙腈（B）梯度洗脫條件見表7；檢測波長283 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40℃；流速1.0 mL·min-1。

表7 HPLC梯度洗脫程序表

2.2.2 供試品的制備

稱取5 g 藥膏，加30 mL 甲醇超聲（250 W，頻率40 KHz）提取30 min，放冷后過濾，取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 HPLC指紋圖譜的建立

（1）方法學(xué)考察

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，取樣品（0519）制備1份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，以最高峰為參照，測得峰面積大于80000的共有峰相對保留時(shí)間RSD＜0.62%，相對峰面積RSD＜4.84%，表明儀器精密度良好。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，取樣品（0519）平行制備6 份供試品溶液，以最高峰為參照，同樣標(biāo)準(zhǔn)測得共有峰相對保留時(shí)間RSD＜0.15%，相對峰面積RSD＜4.62%，表明該方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，取樣品（0519）制備1份供試品溶液，分別于0、6、12、18、24 h進(jìn)樣，以最高峰為參照，同樣標(biāo)準(zhǔn)測得共有峰相對保留時(shí)間RSD＜0.47%，相對峰面積RSD＜4.17%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

（2）圖譜生成

取11 批樣品，按3.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2.1 項(xiàng)下色譜條件檢測，將處理結(jié)果保存cdf. 格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012”，得到19 個(gè)共有峰，相似度均＞0.9，且對峰進(jìn)行歸屬結(jié)果如圖2所示。

圖2 11批樣品的HPLC指紋圖譜

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相水（A）-乙腈（B）梯度洗脫（0-30 min，81%-80% A；30-60 min，80%-62% A）；檢測波長203 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃；流速1.0 mL·min-1。

2.3.2 溶液的制備

（1）混合對照品溶液的制備

精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，用甲醇溶解定容至10 mL 容量瓶中，配制成濃度分別為0.978、1.447、1.528、2.087 mg·min-1的混合對照品溶液。

（2）供試品溶液的制備

稱取20 g 藥膏，加50 mL 甲醇超聲（250 W，頻率40 KHz）提取1 h，放冷后過濾，蒸干濾液，加20 mL 水溶解殘?jiān)?，用水飽和正丁醇萃? 次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2 次，每次30 mL，取正丁醇液，蒸干，加甲醇溶解殘?jiān)ㄈ葜? mL 容量瓶中，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

（3）陰性樣品溶液的制備

按復(fù)方血竭跌打膏處方及工藝制備缺三七藥膏和缺續(xù)斷藥膏，同“2.3.2（2）”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成缺三七陰性樣品溶液和缺續(xù)斷陰性樣品溶液。

2.3.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

專屬性考察結(jié)果顯示，混合對照品溶液、供試品溶液、缺三七陰性樣品溶液、缺續(xù)斷陰性樣品溶液色譜圖分離度良好、陰性無干擾，見圖3。線性關(guān)系考察結(jié)果顯示，三七皂苷R1在48.9-978.0 μg·mL-1、人參皂苷Rg1在72.4-1447.0 μg·mL-1、人參皂苷Rb1在76.4-1528.0 μg·mL-1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ在104.4-2087.0 μg·mL-1范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r＞0.999。精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的峰面積RSD 分別為1.54%、1.23%、1.14%、0.72%，表明儀器精密度良好。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24 h 內(nèi)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的RSD 值分別為1.91%、1.98%、1.96%、1.99%，表明溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的RSD 值分別為1.78%、1.71%、1.97%、1.79%，表明此方法重復(fù)性良好。加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均加樣回收率分別為99.64%、99.81%、100.84%、98.83%，RSD 值分別為2.22%、2.69%、3.16%、2.45%，表明此方法回收率良好。

圖3 高效液相色譜圖

2.3.4 中試樣品的含量測定

取三批中試藥膏，按上述建立的含量測定方法進(jìn)行含量測定，分別計(jì)算每克藥膏中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量。結(jié)果顯示，藥膏中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的平均含量分別為41.48 μg·g-1、200.08 μg·g-1、199.37 μg·g-1、150.45 μg·g-1，可為后續(xù)制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

3 討論

復(fù)方血竭跌打膏藥味復(fù)雜，方中乳香、沒藥等樹脂類藥物主要成分為油脂性，紅花、續(xù)斷等的提取物為水溶性，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳劑型基質(zhì)能更好的溶解分散原料藥物。而一般認(rèn)為O/W 型乳膏較W/O 型乳膏藥物釋放和透皮吸收快[15]，更適合本制劑的臨床使用需求，因此將其制備為O/W 型乳膏。CCD-RSM 是一種通過建立多元二次回歸模型來擬合自變量與效應(yīng)變量之間的函數(shù)關(guān)系，對獲得的函數(shù)模型分析得出最佳實(shí)驗(yàn)條件的統(tǒng)計(jì)方法[16]，具有實(shí)驗(yàn)精度高、預(yù)測性好、實(shí)驗(yàn)簡單等優(yōu)點(diǎn)[17-18]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇CCDRSM 對處方基質(zhì)配比進(jìn)行優(yōu)化，建立的多元二次回歸方程擬合度好，并通過驗(yàn)證表明優(yōu)選出的基質(zhì)處方穩(wěn)定可靠。

中藥復(fù)方制劑多成分協(xié)同發(fā)揮療效，指紋圖譜綜合全面的特點(diǎn)更有利于科學(xué)實(shí)際的建立制劑質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[19]，同時(shí)能反應(yīng)復(fù)方制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性與一致性[2]。本實(shí)驗(yàn)分別比較了100%甲醇、80%甲醇、50%甲醇的提取效率以及30℃、35℃、40℃柱溫對色譜圖的影響，通過全波長掃描，選擇出峰最多、分離度最好的檢測波長，確定了最終的色譜條件?；|(zhì)中加入的防腐劑尼泊金乙酯在該檢測條件下出峰，且響應(yīng)值最大，但由于該峰對其他峰干擾較小且在其他檢測波長下的分離效果并不理想，而基質(zhì)中的其他成分對色譜圖無影響，綜合考慮將尼泊金乙酯納入指紋圖譜的建立。由于本復(fù)方藥味復(fù)雜，指紋圖譜并未涵蓋所有成分，因此進(jìn)一步對處方當(dāng)中的臣藥續(xù)斷以及貴重藥三七的皂苷成分進(jìn)行定量分析，為建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。本研究在建立三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量測定方法時(shí)，比較了波長為190 nm、203 nm、212 nm時(shí)色譜峰的分離效果，結(jié)果4個(gè)成分在203 nm時(shí)基線較穩(wěn)定，峰型較好且分離度良好，因此選擇檢測波長為203 nm。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中擬同時(shí)測定人參皂苷Re 的含量，但由于測定時(shí)發(fā)現(xiàn)人參皂苷Re 含量較少，色譜峰面積小且不穩(wěn)定，因此不予考慮。

綜上，本實(shí)驗(yàn)制備的復(fù)方血竭跌打膏均勻細(xì)膩、易于涂布、質(zhì)量穩(wěn)定，指紋圖譜結(jié)果顯示制劑工藝穩(wěn)定可行，后續(xù)將在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上開展透皮實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)完善對本復(fù)方的臨床前研究。