丁香酚酯及肉桂醇酯對氟比洛芬透皮吸收的影響＊

王 晶，張金偉，張藝蓉，萬旭春，尹 虹，李翰銘，趙利剛，2＊＊

（1. 華北理工大學藥學院 唐山 063210；2. 唐山市新型藥物制劑與釋藥技術(shù)重點實驗室 唐山 063210）

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)（Transdermal drug delivery system，TDDS）是指藥物以恒定或接近恒定速度進入皮膚，對全身或局部起到治療作用的新型給藥系統(tǒng)[1]。因皮膚角質(zhì)層（SC）的阻礙作用，大部分藥物經(jīng)皮透過量達不到治療濃度的需求[2]。目前應(yīng)用透皮吸收促透劑是提高藥物經(jīng)皮透過量的常用手段。天然揮發(fā)油主要來源于中藥材，是其活性成分的一類。由于促透時滯短、促透效果好、刺激性小，天然揮發(fā)油作為經(jīng)皮吸收促透劑具有很大的優(yōu)勢和潛力[3]。

肉桂油是樟科植物肉桂的干皮經(jīng)水蒸汽蒸餾后得到的黃色液體，肉桂醛為其中的主要成分，約占總提取成分的70%-85%[4]，結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)肉桂醇可以與皮膚中的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生更強的氫鍵作用，其促透能力強于肉桂醛，且肉桂醛在透皮吸收時會轉(zhuǎn)化為肉桂醇[5]，因而本研究選用肉桂醇；丁香油是桃金娘科植物丁香的干燥花蕾經(jīng)水蒸汽蒸餾后得到的無色液體，丁香酚為其中的主要成分，約占總提取成分的70%以上[6]。已有研究表明，肉桂油和丁香油作為促透劑對阿魏酸、磷酸川穹嗪、參黃散等藥物具有顯著的促透效果[7-9]。由于中藥揮發(fā)油成分復雜，因此選擇丁香油和肉桂油中的主要成分丁香酚、肉桂醇對其進行深入系統(tǒng)的研究，但二者在室溫下易揮發(fā)，嚴重制約其在經(jīng)皮給藥制劑中作為關(guān)鍵輔料的應(yīng)用。對易揮發(fā)組分進行結(jié)構(gòu)改造，降低其揮發(fā)性、優(yōu)化其促透活性，如將異胡薄荷酮、香芹醇與脂肪酸酯化合可促進氨氯地平、氟比洛芬等藥物的經(jīng)皮吸收[10-11]；或?qū)⑾忝┐?、肉桂醇與氨基酸成酯，促進茶堿、西多福韋等藥物的經(jīng)皮滲透[12]。因此，本研究以CIN、EUG 為先導化合物與硬脂酸合成硬脂酸肉桂醇酯（CIN-C18）、硬脂酸丁香酚酯（EUG-C18）作為新型促透劑，以氟比洛芬為模型藥物，探究其促透活性，以期為新型經(jīng)皮給藥系統(tǒng)的研發(fā)提供可利用的關(guān)鍵輔料。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

雄性大耳兔（2000±200）g，華北理工大學實驗動物中心，動物合格證編號SCXK（京）2019-0008，實驗過程均符合《實驗動物調(diào)查倫理指南》。

1.2 實驗藥品及試劑

DURO-TAK 87-235A 壓敏膠（醫(yī)用級，德國漢高公司）；氟比洛芬原料藥（批號：20200316，上海源葉生物科技有限公司）；尼泊金異丙酯（孝感深遠化工有限公司）；肉桂醇、丁香酚（上海麥克林生化有限公司）；硬脂酸（津東天正化學試劑有限公司）；色譜級甲醇（北京邁瑞達科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 實驗設(shè)備

TP-01 型臥式雙室透皮儀（沈陽天美達科學儀器有限公司）；ST-16R 型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；RC-8 溶出度測試儀（天津新天光技術(shù)開發(fā)有限公司）；LC-2010A 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）包括LC-20AT型泵、SDP-20A型檢測器；Hypersi ODS色譜柱。

2 實驗方法

2.1 CIN-C18、EUG-C18的制備及結(jié)構(gòu)確證

采用酰氯酯化法合成CIN-C18、EUG-C18，其反應(yīng)路線如圖1所示。取硬脂酸與氯化亞砜置于圓底燒瓶中，于油浴加熱至65℃回流4 h，之后加入揮發(fā)油，繼續(xù)油浴75℃反應(yīng)4 h。以0.5 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH=9.0，將調(diào)節(jié)好PH 值的粗產(chǎn)物用乙酸乙酯（100 mL）萃取數(shù)次至無色，收集有機相，選用無水硫酸鎂進行脫水處理。得到的粗產(chǎn)物，經(jīng)過柱色譜（800 mm×20 mm，硅膠為200-300 目）分離，以石油醚：乙酸乙酯（50:1，v/v）為流動相進行洗脫。后經(jīng)1H-NMR 檢測產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，并通過氣相法（GC）檢測揮發(fā)油酯的純度均＞98%。

圖1 CIN-C18、EUG-C18的合成路線

CIN-C18：1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ：7.48-7.40 (6H, m), 7.36 (6H, dd,J=8.4, 6.8 Hz), 7.34-7.27 (5H, m), 6.69 (3H, d,J=15.6 Hz), 6.35 (3H, dt,J=15.7, 7.2 Hz,), 4.28 (6H, dd,J=7.2, 1.2 Hz,), 7.61-0.70 (10H, m), 1.28 (4H, s), 0.91 (1H, t,J=6.9 Hz).產(chǎn)率：76.5%。

EUG-C18：1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ：7.05-6.69 (3H, m), 5.98 (1H, ddt,J=16.9, 10.1, 6.7 Hz), 5.25-4.86 (2H, m), 4.15 (3H, q,J=7.2 Hz), 3.83 (4H, s),3.40 (2H, dd,J=6.7, 1.6 Hz), 2.58 (2H, t,J=7.5 Hz),2.31 (4H, t,J=7.5 Hz), 1.90-1.70 (3H, m), 1.65 (4H, q,J=7.4 Hz), 1.44-1.37 (2H, m), 1.36-1.11 (12H, m),0.90 (4H, t,J=7.0 Hz)。產(chǎn)率：77.4%。

2.2 體外分析方法的建立及方法學考察

2.2.1 色譜條件

Hypersi ODS 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 mm）；流動相：甲醇-含1%冰乙酸的水溶液（55:45，v/v）；檢測波長：247 nm；柱溫40℃；流速：1.0 mL·min-1；內(nèi)標為40 μg·mL-1尼泊金異丙酯溶液。

2.2.2 標準曲線方程

精密稱量20.01 mg 的FP 于容量瓶中，加入甲醇定容，稀釋至200 μg·mL-1，再稀釋為濃度為0.2-100 μg·mL-1的FP溶液。分別加入等體積、濃度為40 μg·mL-1尼泊金異丙酯溶液。以尼泊金異丙酯為內(nèi)標物，通過HPLC 進行溶液檢測，分析藥物與內(nèi)標的峰面積比值（Ai）隨模型藥物的不同濃度（C）的變化曲線。對數(shù)據(jù)進行線性擬合，得到回歸方程：Ai=0.0304C+0.0046，r=0.9999。證明在0.2-100 μg·mL-1范圍內(nèi)，二者具有良好的線性相關(guān)性。

2.2.3 精密度

日內(nèi)精密度測定需在1 天時間內(nèi)對高、中、低3 個濃度下的樣品進行分析，日間精密度測定選用相同濃度樣品連續(xù)3 天進樣分析，得到3 種濃度的日內(nèi)精密度均值分別為RSD：（0.98±0.13）%、（0.91±0.19）%和（1.12±0.37）%（n=6），日間精密度均值分別為RSD：（0.95±0.17）%、（0.98±0.29）%和（1.03±0.41）%（n=6）。

2.2.4 回收率

通過計算高、中、低三種藥物濃度的比來確定回收率，得到FP平均加樣回收率分別為（97.86±0.52）%、（98.36±0.36）%和（99.03±0.23）%（n=6）。

2.3 體外透皮實驗

2.3.1 離體兔皮的制備

選取體質(zhì)量（2000±200）g 的家兔，以質(zhì)量濃度為20%的烏來糖溶液作為麻醉劑，將其背部朝上固定于兔臺，用修剪器除去背部長毛后，用剃須刀除去細密絨毛。待皮膚裸露后，采用空氣栓塞法處死大耳兔。之后，迅速剝離背部皮膚，剔除皮膚中的脂肪和結(jié)締組織，裁剪成1cm2，于生理鹽水下沖洗數(shù)次，之后置于密封袋中低溫（-80℃）冷凍保存。兔皮須在7 天內(nèi)使用，使用前應(yīng)當保證其完整無破損。

2.3.2 貼劑的制備

稱取FP 溶于乙酸乙酯溶液中，與促透劑、壓敏膠混合，置于磁力攪拌器上攪拌15 min 至混勻，靜置脫氣10 min 直至氣泡消失，將混合物均勻轉(zhuǎn)移到硅酮紙上，室溫下放置10 min 揮發(fā)溶劑，于50℃下烘干15 min，覆上背襯膜備用。同上制備含有促透劑（揮發(fā)油及其酯）的FP 貼劑，處方中FP、壓敏膠（DUROTAK 87-235A）的比例保持不變。

2.3.3 體外滲透實驗方法

采用水平臥式雙室擴散池為實驗裝置，以離體兔皮為透過屏障，在其角質(zhì)層一側(cè)貼敷制備好含（不含）促透劑的貼劑，加入3.5 mL pH=7.4的PBS溶液，加入磁轉(zhuǎn)子，32℃下恒溫攪拌。于2、4、6、8、10、12、24 h 取樣2 mL，同時補充2 mL PBS溶液。在4℃，4000 r·min-1條件下離心5 min，取300 μL 上清液與等量內(nèi)標液混勻，經(jīng)高效液相色譜儀分析測定含量。

計算單位面積累積透過量（Q）。以Q對時間t 作圖，直線的斜率為穩(wěn)態(tài)透皮速率（Jss），直線與橫軸的交點為時滯（tlag），并計算增滲比（ER，即加入促透劑與不加促透劑時藥物Q24h之比）

2.4 體外釋放實驗

選擇FP 貼劑（含或不含促透劑）進行藥物釋放度測定。在（32±0.5）℃下進行實驗，取磷酸鹽緩沖溶液（900 mL）注入溶出杯中，將貼劑釋放面朝上固定于碟網(wǎng)之間，并與槳底相距（25±2）mm 處平行放置[13]，于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h 取樣5 mL，同時補充5 mL緩沖溶液。樣品經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過濾后在室溫下4000 r·min-1下離心5 min，與同體積內(nèi)標液混合，渦旋20 s，通過HPLC檢測。

2.5 分子模擬

Materials Studio 7.0 軟件用于模擬促透劑-模型藥物-神經(jīng)酰胺三者之間相互作用的影響。從ChemDraw 16.0 中獲得模型藥物（FP）、神經(jīng)酰胺（CER-NP）及促透劑（CIN、EUG、CIN-C18、EUG-C18）結(jié)構(gòu)，在COMPASSII 力場下，首先在Forcite 模塊下對結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，其次在Blend 模塊下進行化合物的混合，尋找最優(yōu)構(gòu)象，最后在Dreding 力場下計算各化合物間結(jié)合的鍵能及鍵長。

2.6 ATR-FTIR

剔除兔背部毛發(fā)，標記15 個的不同區(qū)域（面積為1.0 cm2），隨機分5 組（A：無水乙醇，B：1%CIN，C：3%EUG，D：CIN-C18，E：EUG-C18），并向區(qū)域內(nèi)涂抹20 μL 含（不含）促透劑的無水乙醇溶液，滲透30 min后以空氣栓塞法處死大耳兔，剝離背部皮膚（標記區(qū)域），室溫下干燥15 min，利用ATR-FTIR 光譜儀進行檢測，其中內(nèi)反射晶體為硒化鋅（ZnSe），入射角為45℃，角質(zhì)層朝下置于檢測器上，在1000-4000 cm-1的檢測波長范圍內(nèi)掃描20 次，使用Origin 7.0 軟件對紅外吸收峰進行分析。

2.7 組織學評價

剔除兔背部毛發(fā)，標記5個面積為1.0 cm2的區(qū)域，涂抹20 μL含（不含）促透劑的無水乙醇溶液，5個區(qū)域分別為（A：無水乙醇，B：1%CIN，C：3%EUG，D：1%CIN-C18，E：3%EUG-C18）。滲透1 h 后，采用空氣栓塞法處死大耳白兔，剝離給藥區(qū)域背部皮膚，4%多聚甲醛溶液固定后將其包埋在石蠟塊中，冠狀切片，后用蘇木精-伊紅染料進行染色。組織切片均在Olympus顯微鏡下，10倍鏡觀察[14]。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 實驗結(jié)果

3.1 最佳促透濃度的篩選

按“2.3.2”項下的方法分別制備含1%、3%和5%揮發(fā)油的FP透皮貼劑，按“2.3.3”項下的方法進行體外經(jīng)皮滲透實驗。以經(jīng)皮累積透過量（Q24h）為縱坐標、T為橫坐標繪制經(jīng)皮累積滲透曲線，結(jié)果見圖2。由圖可知，含有不同濃度的揮發(fā)油對FP的促透效果均顯著高于空白組（P＜0.05），1%、5%濃度的CIN對FP的Q24h分別為（205.04±29.28）μg·cm-2、（237.78±65.86）μg·cm-2，對FP的促透活性差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），故選擇較小濃度1%進行后續(xù)實驗。當EUG濃度為3%時，促透效果最佳。在隨后的實驗中，揮發(fā)油酯的濃度與揮發(fā)油類化合物等摩爾濃度。

圖2 含有不同濃度揮發(fā)油的貼劑中FP的經(jīng)皮滲透曲線（,n=4）

3.2 最佳促透劑的篩選

按“2.3.2”項下的方法制備含揮發(fā)油酯的貼劑，考察揮發(fā)油及其酯對FP 經(jīng)皮滲透參數(shù)的影響，結(jié)果見表1。從結(jié)果上看，與空白組相比，CIN、EUG 顯著增強FP 的經(jīng)皮透過量，其中對FP 的增滲比分別為1.92，1.52。體外經(jīng)皮促透實驗表明，促透劑組均能夠顯著提高FP 的經(jīng)皮滲透（P＜0.05），EUG-C18 對FP 產(chǎn)生的促透量最大，Q24h達到（295.03±45.08）μg·cm-2，CIN-C18僅次于EUG-C18（P＜0.05）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIN 的促透效果優(yōu)于EUG，而EUG-C18的促透效果優(yōu)于CIN-C18。

表1 揮發(fā)油及其硬脂酸酯對FP的經(jīng)皮滲透影響（,n=4）

表1 揮發(fā)油及其硬脂酸酯對FP的經(jīng)皮滲透影響（,n=4）

注：與Control相比，*P＜0.05；與CIN、EUG相比，**P＜0.05。

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3.3 體外釋放實驗

如圖3 所示，為含或不含促透劑的FP 貼劑的24 h內(nèi)體外釋放百分比，所選用促透劑分別為1%CIN、3%EUG、1%CIN-C18、3%EUG-C18，所有加入促透劑均顯著增強了FP的釋放（P＜0.05），其累積釋放度分別為35.06%、30.27%、40.06%、46.61%，高于對照組的23.38%，且促釋放能力由大到小依次為EUG-C18＞CIN-C18＞CIN＞EUG。

圖3 含有揮發(fā)油及其硬脂酸酯的FP貼劑的累積釋放度（,n=4）

3.4 分子模擬

如圖4 所示，分別為使用Materials Studio 軟件計算得到的FP-CER-NP 及FP-促透劑-CER-NP 的最小能量復合物。所有系統(tǒng)計算的氫鍵鍵能如表2 所示，結(jié)果表明促透劑組計算的氫鍵鍵能絕對值均顯著高于FP與CER-NP。

表2 分子模擬計算各組氫鍵鍵能

圖4 FP、促透劑與NP間的氫鍵相互作用

3.5 ATR-FTIR

通過ATR-FTIR 檢測特征峰位移情況，判斷角質(zhì)層“三明治”結(jié)構(gòu)中烴鏈的有序度[15]。乙醇不會改變皮膚脂質(zhì)烴鏈的排列方式及空間構(gòu)象，且揮發(fā)快，短時間內(nèi)可以恢復角質(zhì)層屏障功能[16]。皮膚角質(zhì)層的主要成分是脂質(zhì)、角蛋白和水，在ATR-FTIR 中，脂質(zhì)的特征吸收峰為vsCH2=2848.69cm-1及vasCH2=2918.12cm-1，反映脂質(zhì)側(cè)鏈自由度水平的指標可用CH2伸縮振動峰位移表示，波數(shù)位移的大小與CH2的偏轉(zhuǎn)/全反構(gòu)象體的比例有關(guān)[17]。角蛋白的特征吸收峰分為酰胺Ⅰ帶（1639.39cm-1）及酰胺Ⅱ帶（1544.89cm-1），代表蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)α-螺旋及β-折疊[18]，除此之外，角質(zhì)層中OH的振動吸收峰為3278 cm-1。由圖5可見，與對照組相比，實驗組中皮膚角質(zhì)層中脂質(zhì)的CH2對稱及不對稱振動均向高波數(shù)發(fā)生移動，其中，EUG-C18 位移變化最大，除CH2振動吸收峰發(fā)生改變外，酰胺Ⅰ帶的位移值也發(fā)生改變，均發(fā)生了藍移現(xiàn)象，同時，角質(zhì)層中OH的振動吸收峰也均向高波數(shù)發(fā)生移動。

圖5 含或不含促透劑的皮膚ATR-FTIR光譜圖

3.6 組織學評價

如圖6 所示為在10 倍放大倍數(shù)下，含或不含促透劑的兔皮膚組織切片圖像，圖6a為對照組下的皮膚細胞形態(tài)，可清晰觀察到角質(zhì)層（角質(zhì)層緊密排列在活性表皮上，角質(zhì)層呈帶狀均勻分布）和附屬器官，未觀察到角質(zhì)層脫落，且未見任何炎癥細胞。經(jīng)促透劑處理后的大耳兔皮膚組織切片可明顯觀察到角質(zhì)層變薄，一些區(qū)域外層角質(zhì)呈帶狀游離，并且在表皮區(qū)有空腔出現(xiàn)，表明揮發(fā)油及其酯改變了皮膚角質(zhì)層有序致密結(jié)構(gòu)，使其變得疏松，從而降低了皮膚的屏障作用。組織學切片結(jié)果表明促透劑僅會對皮膚產(chǎn)生的輕微的刺激性，并不會對皮膚細胞產(chǎn)生毒性。

圖6 含或不含促透劑的兔皮膚組織學切片

4 討論

促透劑的作用機制主要是通過可逆性改變皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)來增加藥物的經(jīng)皮滲透量。近年來對揮發(fā)油類促透劑的研究顯示，其作用于皮膚后可不同程度地改變皮膚的生理結(jié)構(gòu)，增加其通透性且刺激性較小。但因其易揮發(fā)，不利于制劑的質(zhì)量控制，限制了在經(jīng)皮給藥制劑中的應(yīng)用。本文參考課題組之前的研究，選取了芳香族兩種典型的揮發(fā)油醇酚成分，即肉桂醇和丁香酚，結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)肉桂醇可以與皮膚中的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生更強的氫鍵作用，其促透能力強于肉桂醛，同時肉桂醛在透皮吸收時會轉(zhuǎn)化為肉桂醇[5]，因而本文選用肉桂醇；且因貼劑在制備過程中需加熱，肉桂揮發(fā)油、丁香揮發(fā)油作為促透劑穩(wěn)定性較差[19-20]，本文對其結(jié)構(gòu)進行酯化改造，以期改善揮發(fā)性且提高促透活性，同時不會增加其皮膚刺激性，并探究了酯類衍生物對FP的促透效果及作用機制。

體外經(jīng)皮促透實驗表明，揮發(fā)油對FP具有一定的促透活性，這表明丁香酚可通過影響皮膚角質(zhì)層的角蛋白構(gòu)象來增加其流動性從而發(fā)揮經(jīng)皮促透作用；而肉桂醇可通過擾亂脂質(zhì)側(cè)鏈的有序排列使細胞間隙增大，增加藥物經(jīng)皮滲透量。同時研究表明揮發(fā)油酯的促透活性優(yōu)于揮發(fā)油組，這表明脂肪酸酯可通過干擾脂質(zhì)雙分子層側(cè)鏈的空間排列順序來提高藥物的經(jīng)皮滲透量并縮短時滯[21]。組織學切片顯示，在加入揮發(fā)油酯后有輕微水腫現(xiàn)象出現(xiàn)，但并未對皮膚活性造成影響，且在短時間內(nèi)可以恢復，這表明其刺激性低。

體外釋放研究表明，所有促透劑均可增加藥物釋放，而EUG-C18、CIN-C18 比EUG、CIN 更容易使藥物釋放。這可能是由于促透劑可以通過形成自由體積的填充劑來減少藥物與壓敏膠的相互作用，從而促進藥物釋放[22]，而成酯后因其更容易占據(jù)壓敏膠中氫鍵而形成位點，從而產(chǎn)生更多的自由藥物分子，增加藥物的釋放。分子模擬結(jié)果表明促透劑與NP 混合后的氫鍵鍵能絕對值均顯著高于FP-NP，可能是由于促透劑與神經(jīng)酰胺結(jié)合后導致脂質(zhì)結(jié)構(gòu)被擾亂致使更多FP 游離而增加皮膚滲透量。ATR-FTIR 研究表明應(yīng)用促透劑后SC脂質(zhì)烷基側(cè)鏈的自由度增大，分子間結(jié)合力減弱，角蛋白的二級結(jié)構(gòu)可能受到促透劑的空間位阻效應(yīng)而產(chǎn)生了擠壓，使其排列發(fā)生變形，導致角蛋白分子間的空隙增加[23]，同時二級結(jié)構(gòu)的改變可能會造成角蛋白中的氫鍵網(wǎng)絡(luò)發(fā)生斷裂，擴張了角質(zhì)細胞[24]，OH振動吸收峰向高波數(shù)移動可能角質(zhì)細胞含水量增加而膨脹有利于FP 的透過[25]，無論是CH2的對稱及不對稱吸收峰、酰胺I 帶及OH 振動吸收峰，EUGC18 顯示了最大的位移變化，這為其具有最優(yōu)促透能力提供了合理的解釋。

綜上所述，來源于芳香族揮發(fā)油的EUG 及CIN 均可增加FP的經(jīng)皮滲透量，結(jié)構(gòu)改造后的酯類衍生物通過促進FP 從壓敏膠中的釋放、影響SC 中角蛋白的構(gòu)象及擾亂脂質(zhì)側(cè)鏈順序來增加FP的經(jīng)皮滲透。其中，EUG-C18 具有較好的經(jīng)皮促透活性和較低的皮膚刺激性，值得進一步深入研究。