人參皂苷Rg1對重癥急性胰腺炎模型大鼠肺損傷的治療作用及其機(jī)制＊

江 勇，朱大俠，劉禮劍，夏紅星

（南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬南華醫(yī)院 衡陽 421002）

重癥急性胰腺炎（Severe acute pancreatitis，SAP）是臨床上最為常見的急性腹部炎癥性疾病，具有發(fā)病快、死亡率高和并發(fā)癥多等特點。急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）是SAP引起的多種器官功能障礙中發(fā)生率最高、出現(xiàn)較早的一種常見并發(fā)癥[1]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（Nucleotide-binding domain，leucine-rich-containing family，pyrin domain-containing-3，NLRP3）炎癥小體是炎癥復(fù)合體的傳感蛋白，屬于機(jī)體固有免疫系統(tǒng)，可以通過控制多種促炎細(xì)胞因子的分泌而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[2]。研究表明，NLRP3 炎癥小體激活參與SAP 的進(jìn)程，抑制NLRP3 炎癥小體激活，能有效減輕胰腺損傷，并且有效緩解SAP 導(dǎo)致的其他臟器損傷，包括肺損傷[3]。人參皂苷是人參中的主要有效成分，其中人參皂苷Rg1是重要的單體之一，具有抗炎和抗氧化作用[4]。研究表明[5]，人參皂苷Rg1 通過抑制炎癥反應(yīng)減輕膿毒癥肺損傷，但其是否對SAP 引起的肺損傷具有治療作用還未知。

本研究以SAP 大鼠模型為研究對象，探討人參皂苷Rg1 對SAP 引起的肺損傷的治療作用，并初步闡明了其作用機(jī)制是否與NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD 大鼠75 只，8 周齡，體質(zhì)量220-260 g，購于湖南嘉泰實驗動物有限公司，動物許可證編號：SCXK（湘）2019-0003。在20-25°C，濕度50%，晝夜交替（12 h/12 h）的清潔環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，期間給予大鼠常規(guī)飼料，自由飲水，保持通風(fēng)。本研究動物實驗在南華大學(xué)實驗動物學(xué)部進(jìn)行，經(jīng)南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬南華醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2020zcx-07）。

1.2 主要試劑和儀器

人參皂苷Rg1（含量 ≥ 98%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；注射用烏司他?。?0 萬U/支，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H19990132）；白細(xì)胞介素（IL）-1β（SBJ-R0546）、IL-6（SBJ-R0755）、IL-18（SBJ-R0759）和腫瘤壞死因子（TNF）-α（SBJ-R0040）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；血清淀粉酶檢測試劑盒（E33651，美國InvitrogenGTX 公司）；脂肪酶活性檢測試劑盒（BC2340，北京索萊寶科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1691，美國Promega 公司）；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（RR820A，大連TaKaRa 公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白試劑盒（P0012，上海碧云天生物技術(shù)公司）；NLRP3（NBP2-12446）、ASC（NB100-56564）和caspase-1（NBP1-45433）抗體購自美國NOVUS 公司；GAPDH（ab181602）抗體（英國Abcam 公司）。日立7600P 全自動生化分析儀（日本HITAACHI 公司）；Anthos 2010 酶標(biāo)儀（英國Anthos 公司）；ABL700 全自動血氣分析檢測儀（丹麥雷度公司）；ABI7500 熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物造模及分組

參考文獻(xiàn)[6]采用逆行胰膽管注射5%牛黃膽酸鈉溶液法建立SAP模型，具體方法為：SAP大鼠模型構(gòu)建成功后在制備SAP 模型前，所有大鼠均禁食12 h 后，采用30 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒鋪巾，腹部正中做切口，暴露腹腔十二指腸，識別膽胰管，用動脈夾阻斷膽胰管入肝門處，然后在膽胰管連接十二指腸處，使用硬膜外導(dǎo)管探入膽胰管，以0.2 mL·min-1流速注入5% 牛磺膽酸鈉溶液0.1 mL·100 g-1，膽胰管出現(xiàn)擴(kuò)張后，維持8-10 min，當(dāng)胰腺出現(xiàn)明顯水腫出血情況，說明SAP 模型制作成功。松開動脈夾，取出導(dǎo)管，復(fù)位十二指腸后逐層縫合關(guān)閉腹腔。利用隨機(jī)數(shù)字法，將造模成功的大鼠分為模型對照組、烏司他丁組和人參皂苷Rg1低、高劑量組（10、40 mg·kg-1），每組15只。另取15只大鼠作為假手術(shù)組，該組大鼠在模型制備過程中僅開腹后翻開膽胰管，不做其他處理。

1.3.2 藥物干預(yù)

造模成功后，低劑量組大鼠腹腔注射10 mg·kg-1人參皂苷Rg1，高劑量組大鼠給予腹腔注射40 mg·kg-1人參皂苷Rg1[7]，烏司他丁組大鼠給予尾靜脈注射2×104U·kg-1[8]，假手術(shù)組和模型對照組大鼠腹腔注射等量生理0.9%氯化鈉溶液，每天1 次，共2 天。給藥2 天后采用脊椎脫臼法處死大鼠并取材。

1.3.3 血清脂肪酶和淀粉酶活性檢測

大鼠處死前腹主動脈取血，隨后立刻將血液3000 r·min-1離心10 min（離心半徑r=10 cm），取血清置于-20℃保存。采用日立7600P 全自動生化分析儀檢測血清淀粉酶活性，采用ELISA 試劑盒檢測血清脂肪酶含量。

1.3.4 蘇木精-伊紅（HE）染色

大鼠處死后取部分胰腺和左肺組織，立即置于4%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)制備胰腺、肺組織石蠟切片，進(jìn)行HE 染色后觀察胰腺和左肺組織病理學(xué)變化。采用Schmidt 病理評分法[9]評定胰腺病理變化程度：從胰腺組織水腫、炎癥浸潤、空泡和壞死4 個方面進(jìn)行評定，每項評分0-4 分。采用Hoffuaer 病理評分法[10]評定肺部組織病理變化程度：根據(jù)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤和出血對肺組織切片進(jìn)行評估，每項評分0-4分。評分越高，表明胰腺或肺組織病理改變越嚴(yán)重。

1.3.5 肺泡灌洗液（BALF）中IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α水平檢測

大鼠處死后，頸部正中切口，分離肌肉后，暴露氣管。在氣管上剪Y 型口，插入自制的靜脈套管針行氣管插管，用PBS 溶液5 mL 第1 次灌洗，注入回收后，再用5 mL PBS 溶液重復(fù)灌洗2 次后，回收3 次的肺泡灌洗液。采用ELISA 試劑盒和Anthos 2010 酶標(biāo)儀檢測大鼠BALF炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平。

1.3.6 肺組織濕/干（W/D）比值測定

大鼠處死后取右肺，擦干表面水分后，使用電子分析天秤稱濕質(zhì)量（W），然后將其置于80℃干燥箱中烘烤20 h至恒質(zhì)量，再稱干質(zhì)量（D）。根據(jù)W/D比值=（W-D）/D×100%計算肺組織W/D比。

5.5 細(xì)胞因子 Gon?alves等[61]探討了BALF中細(xì)胞因子水平與IPA的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示，IL-8肺泡水平≥904 pg/mL預(yù)測IPA的敏感性和特異性分別為90%、73%，陰性預(yù)測值88%，說明IL-8是IPA良好的生物標(biāo)志物。此項研究突出了IPA患者中肺泡細(xì)胞因子呈一定特異性。同時，Heldt等[62]研究認(rèn)為，血清和BALF中IL-6和IL-8水平與IPA有關(guān)，提示細(xì)胞因子用于診斷IPA的潛在價值。

1.3.7 動脈血中氧合指數(shù)（Oxygenation index，OI）檢測

大鼠處死前腹主動脈取血5 mL，立刻置入ABL700全自動血氣分析檢測儀進(jìn)行OI分析。通過儀器觀察到動脈血氧分壓（PaO2），空氣中吸入的氧濃度分?jǐn)?shù)（FiO2）參考值為21%，根據(jù)公式OI=PaO2/FiO2計算動脈血中OI值。

1.3.8 NLRP3、caspase-1 和ASC mRNA 的表達(dá)水平檢測

大鼠處死后取左肺部分組織，液氮快速研磨后，加入TRIzol試劑提取組織總mRNA。嚴(yán)格根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒操作步驟，使用ABI7500 熒光定量PCR 儀檢測待測樣本中NLRP3、caspase-1 和ASC mRNA 相對表達(dá)量。引物序列：NLRP3 forward 5’-GGAGTGGATAGGTTTGCTGG-3’，reverse 5’-GGTGTAGGGTCTGTTGAGGT-3’（180 bp）；caspase-1 forward 5’-TGCCGTGGAGAGAAACAAGG-3’，reverse 5’-CCCCTGACAGGATGTCTCCA-3’（278 bp）；ASC forward 5’-TCTGGAG GGGTATGGCTTGG-3’，reverse5’-GAGTGCTTGCCTGTGTTGGT-3’（235 bp）；GAPDH forward 5’-TGCTGGGGCTGGCATTGCTC-3’，reverse 5’-TCCTTGCTGGGCTGGGTGGT-3’（153 bp）。ABI 熒光定量PCR 儀設(shè)定程序：預(yù)變性95℃ 5 min，變性94℃1 min，退火61℃ 45 s，延伸72℃ 30 s 循環(huán)30 次，最終延伸72℃ 10 min。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算待測基因mRNA相對表達(dá)水平。

1.3.9 NLRP3、caspase-1和ASC蛋白的表達(dá)水平檢測

大鼠處死后取左肺部分組織，按照1:8 比例加入蛋白酶抑制劑，用勻漿器勻漿后，4℃、14 000 r·min-1離心10 min（離心半徑r=10 cm），提取組織總蛋白。用BCA 試劑盒檢測提取的蛋白量。預(yù)先制備12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，含有吐溫-20 的Tris-HCl 緩沖鹽溶液（TBST）洗滌3 次后，加抗體NLRP3（1∶500）、caspase-1（1∶1000）、ASC（1∶1000）和內(nèi)參GAPDH（1∶10000），4℃孵育過夜。TBST洗滌3次后，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5000），室溫孵育1 h。ECL化學(xué)顯影后，在利用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒對PVDF 膜進(jìn)行顯影曝光后，用Image J 軟件對條帶灰度值進(jìn)行量化，待測蛋白的相對表達(dá)量為待測蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.3.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 版統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Kolmogorov-Smirnov 分析數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則進(jìn)行方差齊性分析；若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗。將符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，其中組間兩兩比較采用LSD-t分析。將非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以四分位數(shù)間距（IQR）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗，兩組間比較采用Wilcox檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠急性胰腺炎指標(biāo)

與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠血清脂肪酶和淀粉酶活性均顯著提高（Z=4.66、t=19.43，P＜0.01）；與模型對照組比較，人參皂苷Rg1 高劑量組和烏司他丁組大鼠血清脂肪酶和淀粉酶活性均顯著下降（H=39.13、F=60.10，P＜0.05），而人參皂苷Rg1 低劑量組大鼠血清脂肪酶和淀粉酶活性無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。

表1 5組大鼠血清脂肪酶和淀粉酶活性比較（或IQR，n=15）

表1 5組大鼠血清脂肪酶和淀粉酶活性比較（或IQR，n=15）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.01；與模型對照組比較，②P＜0.01。

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2.2 大鼠胰腺和肺組織病理變化

如圖1所示，假手術(shù)組胰腺組織形態(tài)正常，未見明顯病理改變；模型對照組和人參皂苷Rg1 低劑量組大鼠胰腺組織出現(xiàn)明顯水腫，胰腺間質(zhì)出血，細(xì)胞壞死，組織形態(tài)不完整，并且有大量炎癥細(xì)胞浸潤；人參皂苷Rg1高劑量組與烏司他丁組大鼠胰腺壞死損傷明顯減輕。如圖2所示，假手術(shù)組肺組織形態(tài)正常，無明顯病理變化；模型對照組和人參皂苷Rg1 低劑量組大鼠肺組織水腫明顯，肺泡內(nèi)出血，且有大量炎癥細(xì)胞浸潤；人參皂苷Rg1 高劑量組與烏司他丁組大鼠肺組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤以及出血癥狀明顯減輕。與假手術(shù)組比較，模型對照組胰腺和肺組織病理評分顯著升高（Z=4.66、4.67，P＜0.01）；與模型對照組比較，人參皂苷Rg1高劑量組和烏司他丁組的胰腺和肺組織病理評分均降低（H=36.93、37.13，P＜0.01），而人參皂苷Rg1低劑量組的病理評分無顯著性差異（P＞0.05）。見表2。

圖1 5組大鼠胰腺組織病理形態(tài)改變（HE，×200）

圖2 5組大鼠肺組織病理形態(tài)改變（HE，×200）

表2 5組大鼠胰腺和左肺組織病理評分比較（IQR，n=15）

2.3 大鼠BALF 中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平

如表3 所示，與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平均顯著上升（Z=4.67、Z=4.67、t=9.20、Z=4.67，P＜0.01）；與模型對照組比較，人參皂苷Rg1 高劑量組和烏司他丁組大鼠BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平均顯著下降（H=30.12、H=37.79、F=35.55、H=31.02，P＜0.01），而人參皂苷Rg1低劑量組無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 5組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平（pg·mL-1，或IQR，n=15）

表3 5組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平（pg·mL-1，或IQR，n=15）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.01；與模型對照組比較，②P＜0.01。

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2.4 大鼠右肺組織W/D比值和動脈血OI值比較

與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠肺組織W/D 比值及動脈血中OI 值均顯著上升（t=9.89，Z=4.67，P＜0.01）；與模型對照組比較，人參皂苷Rg1 高劑量組和烏司他丁組大鼠肺組織W/D 比值及動脈血中OI 值均顯著下降（F=51.87，H=29.64，P＜0.01），而人參皂苷Rg1低劑量組無顯著性差異（P＞0.05）。見表4。

表4 5組大鼠右肺組織W/D值和動脈血OI值比較（或IQR，n=15）

表4 5組大鼠右肺組織W/D值和動脈血OI值比較（或IQR，n=15）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.01；與模型對照組比較，②P＜0.01。

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2.5 大鼠肺組織NLRP3、caspase-1 和ASC 的表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠肺組織中NLRP3、caspase-1 和ASC mRNA 和蛋白水平均顯著上升（mRNA：t=25.53、17.24、22.57，P＜0.01；蛋白：t=16.21、21.43、21.48，P＜0.01）；與模型對照組比較，人參皂苷Rg1 高劑量組和烏司他丁組的肺組織中NLRP3、caspase-1 和ASC mRNA 和蛋白水平均下降（mRNA：F=113.44、44.83、85.75、P＜0.01；蛋白：F=87.70、64.38、109.61，P＜0.01），而人參皂苷Rg1 低劑量組無顯著性差異（P＞0.05）。見圖3。

圖3 5組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1和ASC mRNA和蛋白的表達(dá)水平

3 討論與結(jié)論

3.1 急性肺損傷病理特征

急性肺損傷是SAP最常見的遠(yuǎn)端器官并發(fā)癥之一，發(fā)病率和死亡率均較高。急性胰腺炎中有60%-70%的SAP 相關(guān)死亡是由急性肺損傷引起[11]。但現(xiàn)階段仍缺乏SAP導(dǎo)致急性肺損傷的有效臨床治療策略。SAP能通過全身炎癥導(dǎo)致肺損傷[12]。本研究顯示，SAP大鼠肺組織病理形態(tài)發(fā)生了顯著變化，出現(xiàn)了水腫、出血和大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺出現(xiàn)明顯水腫；另外動脈血氧合指數(shù)升高。這些結(jié)果均提示SAP大鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重肺損傷，與前人結(jié)論SAP導(dǎo)致肺損傷一致。

3.2 NLRP3炎癥小體與SAP誘導(dǎo)的肺損傷

NLRP3炎癥小體是由無活性的caspase-1前體、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）和NLRP3 組成的復(fù)合體。NLRP3炎癥小體的激活，誘導(dǎo)發(fā)生caspase-1依賴性介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡（細(xì)胞焦亡），并伴隨大量促炎因子釋放，最終誘發(fā)級聯(lián)放大性炎癥反應(yīng)[13]。SAP患者外周血NLRP3炎癥小體活性明顯增加，并且IL-1β和IL-18水平升高，與SAP病情嚴(yán)重程度成正相關(guān)[14]。在SAP導(dǎo)致肺損傷過程中，NLRP3炎癥小體明顯激活，引發(fā)炎癥因子IL-β和IL-6的釋放，促進(jìn)炎癥過程，同時caspase-1的表達(dá)量增加，肺損傷加重[15]。這些均說明NLRP3炎癥小體參與了SAP導(dǎo)致的肺損傷。本研究顯示，SAP通過上調(diào)全身炎癥水平引起的肺損傷與NLRP3炎癥小體異常激活有關(guān)，與前人的結(jié)論一致。提示NLRP3炎癥小體參與SAP 引起的肺損傷過程，因此后續(xù)以NLRP3炎癥小體為靶點尋找新的治療方法或藥物。

3.3 人參皂苷Rg1 通過抑制NLRP3 炎癥小體活性緩解SAP誘導(dǎo)的肺損傷

人參是人參屬的一種多年生植物，傳統(tǒng)上被用作一種草藥來緩解如糖尿病、高血壓、神經(jīng)疾病、疼痛和炎癥等疾病及其癥狀[16]。人參皂苷是人參中的主要活性成分，是甾體三萜皂苷，具有抗炎作用。人參皂苷Rg1 通過調(diào)控炎癥因子IL-4、IL-10、IL-13、IL-6、IL-1β 和TNF-α 的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，對抑郁癥大鼠起神經(jīng)保護(hù)作用[17]。人參皂苷Rg1 通過降低血清中IL-6、IL-1β、和TNF-α 的水平，減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷[18]。這些研究說明，人參皂苷Rg1 通過抗炎作用，能有效減輕炎癥引起的機(jī)體臟器損傷，但人參皂苷對SAP 引起的肺損傷是否具有類似的保護(hù)作用尚未有研究報道。本研究顯示，高劑量（40 mg·kg-1）人參皂苷Rg1 對SAP 引起的全身急性炎癥和肺損傷具有明顯治療作用，并且治療效果接近陽性藥物烏司他丁，說明人參皂苷Rg1 能通過抑制炎癥反應(yīng)，減輕SAP 時的全身炎癥以及肺損傷，這與人參皂苷Rg1 的抗炎作用一致。研究報道[19]，人參皂苷Rg1 通過抑制NLRP3 炎癥小體表達(dá)活性，逆轉(zhuǎn)了炎癥細(xì)胞因子IL-1β 水平升高，對輕度應(yīng)激抑郁大鼠具有潛在抗抑郁作用。人參皂苷Rg1還可以通過阻斷TLR4/NF-kB/ NLRP3 途徑減輕脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠炎癥，恢復(fù)膿毒癥引起的心功能受損[20]。但人參皂苷Rg1 減輕SAP 引起的肺損傷是否與調(diào)控NLRP3 炎癥小體活性有關(guān)尚不清楚。本研究首次表明，人參皂苷Rg1 通過抑制NLRP3 炎癥小體活性，降低SAP 誘導(dǎo)的BALF 子IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α 的高表達(dá)水平，減輕SAP 引起的肺損傷。

3.4 總結(jié)

人參皂苷Rg1 通過抑制炎癥小體NLRP3 活性，降低全身炎癥水平，治療SAP 引起的肺損傷，對臨床治療SAP誘發(fā)肺損傷并發(fā)癥具有治療意義。