口腔潰瘍動物模型造模方法及臨床吻合度分析＊

祝 紅，黃勝楠，苗明三

（河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院 鄭州 450046）

口腔潰瘍（Oral ulcer，OU）是一種具有高復(fù)發(fā)性、周期性和自愈性的常見口腔黏膜炎癥性潰瘍性疾病，以疼痛反復(fù)發(fā)作、久治難愈為主要臨床特征，又稱為復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（Recurrent oral ulcer，ROU）和口瘡[1-2]。目前臨床上已建立了多種口腔潰瘍動物模型用于實(shí)驗研究，以求探究口腔潰瘍發(fā)病機(jī)理以及評價藥物療效，但多以病理性模型為主，很少有模型能完全復(fù)制疾病的自然進(jìn)程。本研究在總結(jié)歸納口腔潰瘍疾病中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對中西醫(yī)各項診斷要點(diǎn)進(jìn)行賦值，分析目前臨床常用口腔潰瘍動物模型與該疾病中西醫(yī)臨床病癥特點(diǎn)的吻合度，以此量化其模型復(fù)制程度，為臨床口腔潰瘍動物模型的選擇提供較為準(zhǔn)確直觀的參考。

1 口腔潰瘍的中西醫(yī)病因病機(jī)

1.1 中醫(yī)病因病機(jī)

口腔潰瘍屬于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病名，為口腔粘膜病中最常見的疾病，祖國醫(yī)學(xué)將其稱為“口糜”、“口瘍”、“口瘡”等[3]?！端貑枴饨蛔兇笳撈吩唬骸皻q金不及，炎火乃行，……民病口瘡”，臨床以疼痛反復(fù)發(fā)作，久治難愈為主要特征[4]。中醫(yī)認(rèn)為“脾胃伏火、口瘡乃發(fā)”、“虛火上乘，發(fā)為口瘡”，指出脾胃伏火、心火上炎、脾胃濕熱、陰虛火旺為其主要病機(jī)，常見病因多為飲食失節(jié)、勞倦失宜、情志失調(diào)及外感六淫[5]。

1.2 西醫(yī)病因病機(jī)

現(xiàn)代研究認(rèn)為，口腔潰瘍是上皮的完整性發(fā)生破壞而引起的組織缺損，其病因目前尚不完全明確。有學(xué)者提出在遺傳背景下，天氣、生活、工作等環(huán)境因素、情志、心理等精神因素、包括飲食不當(dāng)所造成的微量元素或維生素缺乏等刺激，均可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能異常，引發(fā)口腔潰瘍[6-7]。同時，臨床經(jīng)驗總結(jié)和流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該疾病的發(fā)生也與系統(tǒng)性疾病因素密切相關(guān)，如消化道疾?。òㄎ笣儭⑹改c潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎、局限性腸炎、肝膽疾病及寄生蟲感染等）和內(nèi)分泌紊亂（如月經(jīng)紊亂）[8]。目前國內(nèi)外尚無有效根治口腔潰瘍的方法，西醫(yī)一般以局部對癥治療為主如調(diào)節(jié)免疫、補(bǔ)充微量元素和維生素、促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面修復(fù)等。

2 口腔潰瘍的中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及臨床特點(diǎn)

2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參考《口腔黏膜病學(xué)》[9]和《中西醫(yī)結(jié)合口腔科學(xué)》[10]擬定口腔潰瘍西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，見表1。根據(jù)課題組[11]前期提出的賦值方法對口腔潰瘍各項指標(biāo)進(jìn)行賦值，臨床表現(xiàn)為口腔潰瘍最直接的臨床診斷依據(jù)，為核心指標(biāo)，符合Ⅰ①、②、③中任何一項賦值20%，共60%；病理指標(biāo)能客觀反映口腔潰瘍的病變特點(diǎn)，為直接相關(guān)指標(biāo)，符合Ⅱ①、②、③中任何一項賦值10%，共30%；實(shí)驗室指標(biāo)多特征性不強(qiáng)，臨床診斷具有局限性，為間接相關(guān)指標(biāo)，符合Ⅲ①、②、③、④中任何一項賦值2.5%，共10%?？偡?00%。

2.2 中醫(yī)辨證分型及臨床表現(xiàn)

參考《口瘡中醫(yī)臨床實(shí)踐指南（2018）》[12]和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[13]將口腔潰瘍分為5 型：心脾積熱證、胃火熾盛證、陰虛火旺證、脾虛陰火證和脾腎陽虛證，具體分型見表2。進(jìn)一步歸納總結(jié)口腔潰瘍的主次癥，并根據(jù)課題組[11]前期提出的賦值方法對其進(jìn)行賦值，主癥包括①口腔黏膜潰瘍紅腫；②口腔黏膜局部灼熱疼痛，符合其中1 項賦值30%；次癥包括①口熱口干；②心煩急躁；③尿黃便干，符合一項賦值13.3%。總分100%。

3 臨床常見口腔潰瘍動物模型分析

3.1 材料與方法

以“口腔潰瘍+動物模型”，“口瘡+動物模型”和“Oral ulcers+Animal model”為主題，檢索CNKI、萬方、維普、PubMed、Web of Science 等數(shù)據(jù)庫2000 年1 月-2022 年3 月以來的所有實(shí)驗性期刊文獻(xiàn)，共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)文獻(xiàn)149篇。

3.2 造模方法及臨床吻合度分析

口腔潰瘍動物模型主要以化學(xué)燒灼法、免疫誘導(dǎo)法、機(jī)械創(chuàng)傷法等單因素法與免疫化學(xué)聯(lián)合法等多因素造模方法為主，常選擇家兔、大鼠、小鼠、豚鼠、金黃地鼠等為造模對象，一般選用雌雄各半的成年動物。根據(jù)2.1，2.2診斷要點(diǎn)賦分情況計算、量化常見口腔潰瘍動物模型與中、西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)的吻合度，具體造模方法、實(shí)驗動物、模型特征和臨床吻合度見表3。

4 討論與展望

口腔潰瘍是指唇、舌、頰、上顎等處黏膜發(fā)生單個或多個淡黃色或灰白色潰爛點(diǎn)，以黃、紅、凹、痛為主要特征的口腔疾病[46]。雖然為良性自限性疾病，但恢復(fù)較慢、復(fù)發(fā)率高，因發(fā)作時疼痛劇烈而嚴(yán)重影響患者的正常生活[47]。近年來，臨床上已建立了多種口腔潰瘍動物模型用于實(shí)驗研究，其制備思路主要從機(jī)體創(chuàng)傷、免疫力、氧自由基作用、病毒感染、內(nèi)分泌紊亂、維生素以及鋅、銅等微量元素缺乏等方面出發(fā)[48]。本文通過對臨床相關(guān)口腔潰瘍動物模型實(shí)驗性文獻(xiàn)的回顧性梳理，總結(jié)出目前常見口腔潰瘍模型造模方法主要包括單因素造模法如機(jī)械創(chuàng)傷法、化學(xué)燒灼法、免疫誘導(dǎo)法、氧自由基損傷法、細(xì)菌感染法、放射法、化療法等和多因素造模方法如免疫化學(xué)聯(lián)合法和病證結(jié)合法。

動物模型的效度評價是動物模型研究中十分重要的一項環(huán)節(jié)，基于中西醫(yī)臨床病癥特點(diǎn)這一方法可信度較高，尤其對于證候模型的評價更為全面[49]。因此筆者在總結(jié)擬定口腔潰瘍中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對其中西醫(yī)診斷要點(diǎn)進(jìn)行賦值，分析臨床常用口腔潰瘍動物模型的中西醫(yī)吻合度。由表3 可知，免疫誘導(dǎo)法、化學(xué)燒灼法中的NaOH 晶體燒灼法和苯酚浸漬法具有較高的西醫(yī)吻合度，分別為85%、92.5%、92.5%。免疫法建立的口腔潰瘍模型與人類ROU的發(fā)病機(jī)制極其相似，適用于研究復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，但此方法操作過程復(fù)雜且成模率不高，分析原因可能與抗原制備過程中多種不確定因素有關(guān)，如組織研磨程度、注射部位和劑量等[50]?；瘜W(xué)燒灼法操作簡便易行，造模成功率高，適合大規(guī)模動物實(shí)驗，可作為某些促進(jìn)口腔粘膜愈合的藥物及抗炎藥物的首要篩選模型，但在日常生活中此類化學(xué)藥物很少接觸到人類口腔黏膜，因此不能完全模擬ROU 的發(fā)病過程。免疫化學(xué)法將免疫誘導(dǎo)法和化學(xué)燒灼法相結(jié)合，既克服了免疫誘導(dǎo)法成模率不高，以及潰瘍個數(shù)與出現(xiàn)的部位不易掌控和化學(xué)灼燒法不具有免疫反應(yīng)特征的缺點(diǎn)，又保留了二者癥狀及組織學(xué)改變與人類ROU 相似的優(yōu)點(diǎn)[25]，同時經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該方法的中西醫(yī)吻合度均較高，中醫(yī)吻合度為86.6%，西醫(yī)吻合度為82.5%。由此，從口腔潰瘍疾病的致病因素、發(fā)病機(jī)制和模型復(fù)制的可操作性、便捷性、經(jīng)濟(jì)性、臨床吻合度等多方面分析，免疫化學(xué)聯(lián)合法應(yīng)為復(fù)制口腔潰瘍疾病較為理想的選擇。病證結(jié)合動物模型同時具備中醫(yī)證候特征和西醫(yī)疾病特征，內(nèi)外病因兼?zhèn)?，具有較高的中西醫(yī)吻合度，以陰虛火旺證和胃熱熾盛證吻合度最高，兩者的西醫(yī)吻合度分別為72.5%、82.5%，中醫(yī)吻合度分別70%、86.6%?？谇粷冏C候造模常采用灌胃不同性味中藥的方法，以溫?zé)嵝运幉娜绺山阶尤夤鹚逡?、黨參黃芪水煎液等構(gòu)建陰虛火旺證和胃火熾盛證，以破氣耗氣的寒涼藥物如大承氣湯構(gòu)建脾胃陽虛證，可以發(fā)現(xiàn)造模方法過于單一，建議結(jié)合六淫邪氣如燥、火等、情志因素如長期激怒法[51]和體質(zhì)因素如過勞傷陰法[52]誘導(dǎo)相應(yīng)的證候模型，所造的證候模型會更接近中醫(yī)臨床。綜上所述，口腔潰瘍病證結(jié)合模型的最佳選擇為相應(yīng)的證候造模+免疫化學(xué)聯(lián)用法。

病證結(jié)合動物模型在一定程度上代表了中醫(yī)藥動物模型的研究方向，評價該模型的指標(biāo)主要包括疾病指標(biāo)以及證候指標(biāo)2 個方面[11]。中醫(yī)證候的評價是病證模型評價的關(guān)鍵，但目前對于病證結(jié)合口腔潰瘍模型證候指標(biāo)的評價還沒有成熟完善的體系，主要通過觀察模型動物的一般狀態(tài)、宏觀表征及行為學(xué)等確認(rèn)中醫(yī)證候?qū)傩?，該方法具有一定的主觀性，存在一定誤差。在后續(xù)的模型評價中，應(yīng)增添如動物精神、行為、疼痛等表觀指標(biāo)，在全方位采集模型動物宏觀信息的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正面評價為主聯(lián)合逆向反證為輔的“以方測證”法篩選出符合臨床診療特點(diǎn)的模型[53]，如胃火熾盛采用清胃散，陰虛火旺采用知柏地黃丸等方藥進(jìn)行反證，以期在模型評價的過程中推動模型的成熟構(gòu)建，制備出與臨床口腔潰瘍疾病中西醫(yī)吻合度較高的動物模型，為臨床口腔潰瘍的病因和發(fā)病機(jī)制的探討以及臨床新藥的開發(fā)提供可靠依據(jù)。