腎衰泄?jié)釡珜ο汆堰手侣阅I衰大鼠TGF-β1/Smads通路的影響＊

李懷玉，邱麗瑛，陳 微，李瑋婷，付 勇，簡鈺乘，楊軍平＊＊

（1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 南昌 330004；2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

慢性腎臟?。–hronic kidney disease，CKD）是全球主要的公共衛(wèi)生問題。預(yù)計在2040年，CKD將成為世界范圍內(nèi)的第5 大常見疾病死因[1-2]。一旦CKD 進入慢性腎衰竭（Chronic renal failure，CRF）階段，透析治療是大多數(shù)患者的治療首選。然而透析在延長CRF患者壽命的同時，也不可避免地對患者的經(jīng)濟和生活質(zhì)量產(chǎn)生一些負面影響，透析作為CRF 主要的治療手段其實際效益并不理想[3]。

中醫(yī)對CRF 的認識可追溯至《內(nèi)經(jīng)》[4]。病名上，參考CRF 的臨床部分表現(xiàn)特征，可歸屬于中醫(yī)“腰痛”和“水腫”等范疇。CRF 的基本病機為本虛標實，本虛與標實二者隨病變趨勢其側(cè)重有所不同。國醫(yī)大師皮持衡認為CRF 標實雖雜，但以濕濁毒邪瘀血互結(jié)為主，正虛雖累及多臟，但治療大抵應(yīng)從脾腎入手，腎衰泄?jié)釡闶瞧こ趾饨淌卺槍RF 這一病機而設(shè)立的。該方治法上以清熱化濕解毒與活血通腑泄?jié)釣橹?，補益脾腎為輔，作為院內(nèi)制劑有效運用于臨床治療。腎纖維化是多種腎臟疾病導(dǎo)致CRF 的共同表現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming growth factor beta1，TGF-β1）作為腎間質(zhì)纖維化（Renal interstitial fibrosis，RIF）的關(guān)鍵因子，其介導(dǎo)的TGF-β1/Smads 信號通路在腎瘢痕形成過程中起重要的調(diào)控作用[5-6]。

鑒于腎衰泄?jié)釡珜GF-β1/Smads 信號通路的影響尚不清楚，本實驗通過構(gòu)建CRF 大鼠模型，探究不同濃度腎衰泄?jié)釡珜υ撏分蠺GF-β1、Smad3 和Smad4 的影響，進而為腎衰泄?jié)釡筊IF 的相關(guān)機制提供部分理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物

選用SD 大鼠（SPF 級）64 只，雌雄各半，體質(zhì)量180±20 g，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（贛）2018-0003。飼料充足，于室溫20-25℃中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實驗方案由江西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準（JZLLSC20220001）。

1.2 主要藥物與試劑

腎衰泄?jié)釡山魇≈嗅t(yī)院藥房提供，組成包括生大黃20 g、白蔻仁10 g、生牡蠣30 g、蒲公英30 g、川芎10 g、白馬骨30 g和黃芪30 g等，煎煮和濃縮步驟由江西省中醫(yī)院藥劑科完成。腺嘌呤（北京索萊寶科技有限公司，批號：104N052）；氯沙坦鉀（科素亞，杭州默沙東制藥有限公司，批號：T034534）；β2-MG 試劑盒和TGF-β1檢測試劑盒均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司（批號均為202105）；水合氯醛（上海麥克林生化科技有限公司公司，批號：C12195151）；cDNA 合成和TB Green試劑盒均購于北京TaKaRa 公司；Smad3 抗體和Smad4抗體均購自美國CST 公司（批號均為800vlal）；引物由深圳華大基因科技有限公司合成，序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.3 主要儀器

P800 型全自動生化分析儀（日本，Roche），Multiskan FC 型酶標儀（美國，Thermo Fisher），ABI 7500 型實時熒光定量PCR 儀（美國，Thermo Fisher），3K15 型4℃離心機（德國，Sigma），37XB 型倒置生物顯微鏡（上海，精科）。

1.4 分組、模型制備與給藥

64只大鼠隨機抽取12只分為正常組，剩余均采用21 天腺嘌呤灌胃法造模處理：前14 天以200 mg·kg-1劑量灌服2.5%的腺嘌呤混懸液，后7 天灌服時濃度減半。兩組均保持雌雄對半。造模結(jié)束時兩組均隨機抽取2 只，檢測血清Scr 與BUN 水平，并觀察腎組織病理以判斷造模狀況。結(jié)果表明造模后大鼠的Scr 與BUN 水平顯著高于正常組，腎組織出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤以及部分纖維化，初步提示造模成功。將造模后的大鼠隨機分為模型組、中藥9.375 g·kg-1、18.75 g·kg-1、37.5 g·kg-1組和氯沙坦鉀組各10 只，每組雌雄各半。中藥9.375 g·kg-1、18.75 g·kg-1、37.5 g·kg-1組分別灌胃給予相應(yīng)濃度的腎衰泄?jié)釡壬程光浗M給予1.8 mg·kg-1濃度的氯沙坦鉀作為陽性對照，其余組給予生理鹽水，連續(xù)28天，每日1次。

1.5 取樣

第28 天給藥后，大鼠進行12 h 禁食不禁水處理。麻醉后收集血液，處死后迅速摘除腎臟，腎臟均脫被膜處理。血樣靜置后以3000 r·min-1離心10 min，取上清液裝于EP 管。腎臟取部分于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余組織和血清均置于-80℃冰箱中保存。

1.6 檢測指標

1.6.1 血清Scr、BUN、β2-MG和TGF-β1含量測定

按照試劑盒說明書操作，其中Scr 采用苦味酸法，BUN采用酶法，β2-MG與TGF-β1均采用ELISA法。

1.6.2 腎組織HE染色病理形態(tài)觀察

已固定的腎組織經(jīng)脫水、包埋、切除處理后，實施HE染色，在顯微鏡下觀察腎組織的病理變化。

1.6.3 RT-PCR 法測定腎組織中Smad3 與Smad4 的mRNA表達水平

TRIzol 法提取腎組織總RNA，進行RNA 濃度及純度測定。對RNA 進行去除基因組DNA 以及逆轉(zhuǎn)錄處理合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件設(shè)定：37℃ 15min，85℃ 5 s，4℃保持。PCR 擴增反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件設(shè)定：95℃ 30 s 預(yù)變性處理，兩步法（95℃ 5 s、55℃ 40 s）循環(huán)40 次，融解曲線分析。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算Smad3與Smad4的相對含量。

1.6.4 Western blot 法測定腎組織中Smad3 與Smad4的蛋白表達水平

RIPA 裂解液提取腎組織總蛋白，通過BCA 法測定蛋白濃度。蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液，上樣蛋白量為20 μg。基于SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，再電轉(zhuǎn)至NC 膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h 后，加入Smad3 與Smad4 對應(yīng)的一抗4℃孵育過夜。洗滌后加入二抗室溫孵育1 h，之后再次洗滌?，F(xiàn)配ECL 化學(xué)發(fā)光液進行顯影處理，以GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J 軟件進行Smad3 與Smad4 目的條帶光密度值分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析采用SPSS 26.0 和Prism Graphpad 8.2.1軟件，實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差（）表示。組間差異比較選用獨立樣本t檢驗（兩組）或單因素ANOVA 分析（兩組以上），Kruskal-Wallis檢驗用于兩組以上數(shù)據(jù)且方差不齊。事后比較中，若方差齊選用LSD 檢驗，不齊選用Tamhane’sT2 檢驗。以P＜0.05，P＜0.01 時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎衰泄?jié)釡珜RF 大鼠血清Scr、BUN 和β2-MG水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中Scr、BUN 和β 2-MG 水平均顯著升高（P＜0.01），且三者在雄、雌鼠間差異不明顯。與模型組相比，Scr 在各濃度中藥組中均出現(xiàn)顯著下降（P＜0.01）；BUN 與β2-MG 除中藥9.375 g·kg-1組改善不明顯以外，中藥18.75 g·kg-1與37.5 g·kg-1組均顯著下降（P＜0.01）。與氯沙坦鉀組相比，Scr、BUN 和β2-MG 含量在中藥18.75 g·kg-1與37.5 g·kg-1組中均無明顯差異（見表2）。

表2 腎衰泄?jié)釡珜RF大鼠血清中Scr、BUN和β2-MG水平的影響

2.2 腎衰泄?jié)釡珜RF大鼠腎組織病理的影響

正常組大鼠腎組織腎小球和腎小管排列整齊、形態(tài)完整，間質(zhì)內(nèi)無明顯炎性細胞浸潤與纖維病變；造模后腎小管排列無規(guī)則，出現(xiàn)不同程度擴張，伴有大量棕褐色代謝產(chǎn)物沉積，腎小球變形萎縮，數(shù)量減少，腎間質(zhì)大量炎性浸潤，伴纖維化增生。各濃度中藥干預(yù)后，較模型組而言，CRF 大鼠腎組織的炎性浸潤、纖維化增生以及代謝產(chǎn)物沉積狀況均有所改善（見圖1）。

圖1 腎衰泄?jié)釡珜RF大鼠腎組織病理的影響（200×）

2.3 腎衰泄?jié)釡珜RF 大鼠血清TGF-β1 水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中TGF-β1 水平均顯著升高（P＜0.01），雄鼠顯著高于雌鼠（P＜0.05）。與模型組相比，TGF-β1 在各濃度中藥組中均出現(xiàn)不同程度的降低，其中以中藥18.75 g·kg-1與37.5 g·kg-1組的改善具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。中藥18.75 g·kg-1與37.5 g·kg-1組與氯沙坦鉀組相比無明顯差異（見表3）。

表3 腎衰泄?jié)釡珜RF大鼠血清中TGF-β1水平的影響

2.4 腎衰泄?jié)釡珜RF 大鼠腎組織Smad3 與Smad4的mRNA表達影響

與正常組相比，模型組大鼠腎組織中Smad3 與Smad4 的mRNA 表達均顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，Smad3 與Smad4 的mRNA 表達在各濃度中藥組和氯沙坦鉀組中均出現(xiàn)不同程度的降低，Smad3 在各濃度中藥組中的改善均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），Smad4在中藥組中以18.75 g·kg-1組（P＜0.05）與37.5 g·kg-1組（P＜0.01）的改善具有統(tǒng)計學(xué)意義。中藥37.5 g·kg-1組和氯沙坦鉀組相比Smad3與Smad4的mRNA表達均無明顯差異（見圖2）。

圖2 腎衰泄?jié)釡珜RF大鼠腎組織Smad3與Smad4的基因表達影響（n=36）

2.5 腎衰泄?jié)釡珜RF 大鼠腎組織Smad3 與Smad4的蛋白表達影響

與正常組相比，模型組大鼠腎組織Smad3 與Smad4的蛋白表達均顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，各濃度中藥組中Smad3 與Smad4 的蛋白表達均出現(xiàn)下調(diào)，Smad3 與Smad4 的蛋白表達在中藥組中均以18.75 g·kg-1組（P＜0.01）與37.5 g·kg-1組（P＜0.01）改善具有統(tǒng)計學(xué)意義。與氯沙坦鉀組相比，中藥37.5 g·kg-1組Smad3 的蛋白表達無明顯差異，中藥18.75 g·kg-1與37.5 g·kg-1組Smad4的蛋白表達無明顯差異（見圖3）。

圖3 腎衰泄?jié)釡珜RF大鼠腎組織Smad3與Smad4的蛋白表達影響（n=12）

3 討論與結(jié)論

腎衰泄?jié)釡鳛閲t(yī)大師皮持衡針對CRF 而設(shè)立的主方，全方以祛邪為主：方中投川芎以辛溫走散，通陽活血使瘀血能祛；予白豆蔻燥濕而走中，大黃、豬苓通濁利尿而走下，分消走泄使得濕毒能化；加蒲公英等苦寒清熱，利濕解毒使?jié)駸崮苋?；添牡蠣咸入腎、黃芪甘入脾以益脾腎，以防攻邪傷正之患。前期研究中，腎衰泄?jié)釡蛔C實可減緩CRF 大鼠腎臟微血管毀壞，提高免疫保護；減輕受損腎小球內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)，抑制TGF-β 和結(jié)締組織生長因子的表達[7-9]，這提示腎衰泄?jié)釡委烠RF 的機理可能與干預(yù)TGF-β 相關(guān)通路有關(guān)。

3.1 腎衰泄?jié)釡珜RF 大鼠腎組織病理及腎功能的影響

本研究采用腺嘌呤灌胃復(fù)制CRF 大鼠模型，這種造模方式的機理在于高濃度的腺嘌呤可經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)換成2,8-二羥基腺嘌呤，后者難溶于水，易機械性累積于腎小管形成結(jié)晶引發(fā)持續(xù)性梗阻，終而導(dǎo)致CRF。與正常大鼠相比，造模大鼠腎組織HE 染色后表現(xiàn)出明顯的腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)異常，小管內(nèi)布滿大量的2,8-二羥基腺嘌呤結(jié)晶，間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量炎性浸潤以及部分纖維化病變，并伴隨著血清中Scr、BUN 表達水平的顯著升高，這表明造模后大鼠的腎臟結(jié)構(gòu)受損情況顯著。與模型組相比，腎衰泄?jié)釡芨纳颇I組織的病理變化，顯著降低CRF 大鼠血清中的Scr、BUN 含量，且降低程度與腎衰泄?jié)釡臐舛瘸烧蜿P(guān)系。

β2-MG 作為一種潛在的內(nèi)源性濾過標志物被廣泛報道[10]。正常情況下，血清中的β2-MG 經(jīng)過腎小球，在近端小管中以重吸收和分解代謝的方式進行轉(zhuǎn)換。一旦腎小球濾過率出現(xiàn)降低，β2-MG 的不斷堆積會使得其在血清中的含量明顯增加，檢測血清中β2-MG 的含量變化可有效評估腎小球的濾過效率[11]。與Scr、BUN 趨勢一致，本研究中CRF 大鼠血清的β2-MG含量均出現(xiàn)了顯著增加，而腎衰泄?jié)釡茌^好地降低其在血清中的含量，且18.75 g·kg-1與37.5 g·kg-1濃度的腎衰泄?jié)釡珜RF 大鼠血清中的β2-MG、CysC 含量改善與氯沙坦鉀相比均無顯著差異。

3.2 腎衰泄?jié)釡珜RF大鼠TGF-β1/Smads信號通路的影響

RIF 是腎功能不全的主要決定因素，代表著幾乎所有CKD 導(dǎo)致的CRF 共同特征表現(xiàn)，而TGF-β 是腎纖維化驅(qū)動的主要因素之一[12]。成熟的TGF-β 通過非共價方式與潛伏相關(guān)肽（Latency-associated peptides，LAP）相關(guān)聯(lián)，然后與充當(dāng)定位作用的TGF-β結(jié)合蛋白（Latent TGF-β binding proteins，LTBP）相附著，穩(wěn)定地存在于細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）中。作為哺乳動物的三種TGF-β 亞型之一，TGF-β1 是肌成纖維細胞活化的主要介質(zhì)[13]。在LAP的抑制作用下，TGF-β1/LAP/LTBP復(fù)合物中的TGF-β1處于長期的非活性狀態(tài)[14]。然而，一旦腎臟持續(xù)受損，潛伏的TGF-β1復(fù)合物在多種酶的裂解作用下釋放出大量活化的TGF-β1。本次研究中，CRF 大鼠模型血清中的TGF-β1 含量出現(xiàn)顯著升高，這些活化的TGFβ1 可與TGF-β 受體2 結(jié)合，進一步激活TGF-β 受體1以觸發(fā)細胞內(nèi)下游的信號通路傳導(dǎo)[12]。TGF-β1/Smads 信號通路是目前公認的典型TGF-β1 促纖維化通路。在活化TGF-β 受體1 的作用下，Smad2、Smad3與Smad4 結(jié)合形成Smads 復(fù)合物，共同調(diào)控纖維化前分子的轉(zhuǎn)錄，從而觸發(fā)ECM 積累以及肌成纖維細胞激活的相關(guān)生物效應(yīng)。Smad2、Smad3與Smad4在腎纖維化的調(diào)節(jié)過程中扮演著不同的角色，三者的顯著區(qū)別在于Smad3 可直接與基因啟動子中的相關(guān)元件結(jié)合以促進轉(zhuǎn)錄，而沒有DNA 結(jié)合域的Smad2 和Smad4 的效應(yīng)發(fā)揮是建立于其對Smad3的調(diào)節(jié)基礎(chǔ)[15]。本研究結(jié)果表明，腺嘌呤灌胃致CRF 大鼠腎組織中的Smad3與Smad4 表達均出現(xiàn)顯著上調(diào)，這一結(jié)果與其他研究的認識基本一致[16-17]。在腎衰泄?jié)釡母深A(yù)下，大鼠血清中的TGF-β1含量、腎組織中Smad3與Smad4的基因和蛋白表達水平均顯現(xiàn)出不同程度的改善：TGF-β1含量方面，腎衰泄?jié)釡幸?8.75 g·kg-1和37.5 g·kg-1組改善顯著；Smad3 與Smad4 的mRNA 表達方面，Smad3在各濃度腎衰泄?jié)釡芯纳骑@著，而Smad4 在腎衰泄?jié)釡幸?8.75 g·kg-1和37.5 g·kg-1組改善顯著；蛋白表達方面，Smad3 與Smad4 在腎衰泄?jié)釡芯?8.75 g·kg-1和37.5 g·kg-1組改善顯著。由此可見，腎衰泄?jié)釡诳筊IF 的機制涉及到TGF-β1/Smads 信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并可能與TGF-β1、Smad3 和Smad4 的抑制有關(guān)。

綜上所述，腎衰泄?jié)釡芙档拖汆堰使辔冈炷４笫笱逯械腟cr、BUN和β2-MG含量以改善腎臟功能，抑制炎性浸潤、纖維化增生和代謝產(chǎn)物沉積以減輕腎組織病理損傷，其對腎臟的保護機制可能與降低血清中的TGF-β1 含量以及下調(diào)腎組織中的Smad3、Smad4表達而改善RIF 有關(guān)。然而，腎纖維化形成是一個復(fù)雜的過程，腎衰泄?jié)釡珜GF-β1 相關(guān)通路的影響還待后續(xù)研究以進一步分析。