川陳皮素對慢傳輸型便秘小鼠的治療作用及機(jī)制研究＊

黃 禮，韋 祎，劉英蓮＊＊

（1. ?？谑械谌嗣襻t(yī)院 海口 571100；2. 海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院 ?？?571199）

慢傳輸型便秘（Slow transit constipation，STC）是一種以結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能障礙為特點(diǎn)的腸道疾病，伴有腸內(nèi)容物在結(jié)腸上傳輸緩慢，糞便次數(shù)減少且干燥等臨床現(xiàn)象[1]。由于現(xiàn)代飲食、生活習(xí)慣等方式的多樣，導(dǎo)致STC患病率高居不下，使患者的生活質(zhì)量變差，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重，嚴(yán)重時(shí)可引起腸道危重急病，危害生命，而且病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，因此STC 的臨床治療和機(jī)制研究刻不容緩。有研究顯示，STC 可能與腸神經(jīng)系統(tǒng)（Enteric nervous system，ENS）、胃腸道Cajal 間質(zhì)細(xì)胞（Interstitial cell of Cajal，ICCs）和平滑肌細(xì)胞組成的腸運(yùn)動(dòng)調(diào)控有關(guān)，ENS 或ICCs 失調(diào)可導(dǎo)致平滑肌松弛，引起結(jié)腸運(yùn)動(dòng)減弱，促成STC 疾病的產(chǎn)生，而調(diào)節(jié)ENS 和ICCs，可改善STC[2]。干細(xì)胞因子/酪氨酸激酶受體（Stem cell factor-C-kit，SCF/C-kit）信號通路在疼痛感知、胃腸動(dòng)力紊亂和炎癥異常激活中均有重要作用，參與STC 中ENS 和ICCs 失調(diào)[3]。推測，STC 主要的發(fā)病機(jī)制可能是SCF/c-kit 信號通路。眾多研究發(fā)現(xiàn)STC 治療方式常以西藥為主，長期服用可引起心血管、內(nèi)分泌等系統(tǒng)的不良反應(yīng)，因此尋找一種高效且低毒副作用的治療藥物成為最新研究方向[1-3]。中醫(yī)藥作為新型研究項(xiàng)目，在治療胃腸疾病方面效果顯著，有很多中藥單體均表現(xiàn)出強(qiáng)有力的治療效果并且副作用小。中藥陳皮具有治療胸腹脹滿、脾虛飲食減少、消化不良以及惡心嘔吐等疾病，常與其他藥材同用達(dá)到通潤腸道治療便秘的作用，而川陳皮素（Nobiletin，NOB）作為從陳皮分離出的一種黃酮類化合物，具有抗真菌、抗炎作用，可雙向調(diào)控大鼠空腸段平滑肌的收縮性，促進(jìn)胃腸動(dòng)力[4-5]。說明NOB針對胃腸蠕動(dòng)具有一定的科學(xué)依據(jù)，但NOB 對STC 是否有治療作用尚未可知，并且具體的治療機(jī)制也不明確。因此，本研究通過構(gòu)建STC 小鼠模型，探討NOB 對STC小鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能的影響及其作用機(jī)制，為臨床開發(fā)治療STC相關(guān)藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級KM小鼠72只，雌性，8周齡，體質(zhì)量25-28 g，購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2020-0019。小鼠于SPF 條件下飼養(yǎng)，溫度（24±1）℃，相對濕度50%-55%，明暗光照各12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

鹽酸洛哌丁胺購自美國sigma 公司；川陳皮素（純度＞98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；莫沙必利、活性炭、阿拉伯樹膠粉購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；小鼠5-羥色胺（5-HT）、血管活性肽（VIP）和一氧化氮合酶（NOS）ELISA 試劑盒購自武漢華美生物有限公司；小鼠一氧化氮（NO）ELISA 試劑盒購自上海心語生物科技有限公司；SCF 抗體、c-kit 抗體和β-actin抗體購自英國Abcam公司；電泳儀（型號：164-5050）美國BIO-RAD 公司；正置顯微鏡（型號：DM4B）購自德國徠卡公司；全功能酶標(biāo)儀（型號：SpectraMax iD3）購自美國Molecular Devices 公司。生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（型號：BL-420F）購自長春添月科技有限公司；自制銀絲電極，直徑0.4 mm，長12 mm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 STC模型構(gòu)建及分組

將KM 小鼠隨機(jī)分為正常組（CON）、模型組（MOD）、陽性對照組（PC）和NOB 低（NOB-L）、中（NOB-M）、高劑量（NOB-H）組，每組12 只。除CON組外，其余組小鼠均采用鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)STC 小鼠模型[6]：小鼠按照3 mg·kg-1·d-1劑量灌服鹽酸洛哌丁胺，每天2次（9∶00和17∶00），連續(xù)14天。檢測造模后各組小鼠排便量及糞便含水量情況，若造模后數(shù)據(jù)明顯低于造模前，確定STC 小鼠建模成功[6]，剔除造模不成功的小鼠并及時(shí)補(bǔ)充。造模成功后，NOB-L、NOBM 和NOB-H 組小鼠給予10、20、40 mg·kg-1·d-1的NOB灌胃，PC 組小鼠給予2.5 mg·kg-1·d-1莫沙必利灌胃，CON 組和MOD 組小鼠給予等量生理鹽水，每天1 次，共2周。

1.3.2 排便量和糞便含水量測定

在造模前、造模后及藥物干預(yù)后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將各組小鼠置于代謝籠中自由飲水活動(dòng)24 h，收集小鼠糞便，統(tǒng)計(jì)排便量并稱重記錄，隨后將糞便放入65℃烘箱中烘干6 h 后稱取干重，計(jì)算其含水量。糞便含水量（%）=（糞便濕重-糞便干重）/糞便濕重×100%。

1.3.3 活性炭推進(jìn)實(shí)驗(yàn)檢測腸道傳輸功能

藥物干預(yù)結(jié)束后，各組小鼠按照0.1 mL·10 g-1劑量灌胃活性炭混懸液（濃度為：100 g·L-1，配置方法：稱取阿拉伯樹膠粉50 g，加水400 mL，煮沸至溶液透明，稱取活性炭25 g 加入上述溶液中煮沸3 次，待溶液涼后加水定容至500 mL）；灌胃完30 min 后，采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉各組小鼠，沿腹部中線切開腹腔，暴露全部腸道，在松弛狀態(tài)下測量從幽門到直腸末端腸道的全長及活性炭混懸液在腸道內(nèi)推進(jìn)的長度，并計(jì)算腸道推進(jìn)率。腸道推進(jìn)百分率（%）=（活性炭前端與幽門的距離/腸道全長）×100。

1.3.4 結(jié)腸肌電測定

活性炭推進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠仰臥于手術(shù)臺(tái)上，在距離盲腸約1.5 cm 結(jié)腸漿肌層內(nèi)植入兩根銀絲電極，兩者相距約0.5 cm，同時(shí)引入BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，0.5 h 后開始測定，靈敏度選擇：標(biāo)準(zhǔn)電壓1 mV·cm-1，時(shí)間常數(shù)1 s，高頻濾波1 Hz，連續(xù)記錄1 h。將各組結(jié)果每180 s 作為一個(gè)時(shí)間單位，并計(jì)算出該時(shí)間內(nèi)慢波頻率和振幅的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)；變異系數(shù)（%）=（標(biāo)準(zhǔn)差/均數(shù)）×100。

1.3.5 HE染色

取各組小鼠結(jié)腸組織1 cm，采用4%甲醛固定，剩余結(jié)腸組織采用PBS 沖洗干凈后裝入凍存管-80℃保存。取已固定24 h 的結(jié)腸組織，放入由低到高濃度乙醇除去組織水分，以二甲苯替換組織中的酒精，浸蠟包埋冷卻凝固成蠟塊；將蠟塊切成薄片（厚5 μm）、展片、置于載玻片上45℃烘干；制備好的石蠟切片經(jīng)脫蠟、至水、蘇木精水溶液-酒精伊紅溶液分批染色，再次脫水、透明，中性樹膠封固。切片于顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)變化。

1.3.6 ELISA 法檢測結(jié)腸組織中5-HT、VIP、NO 和NOS水平

取100 mg 結(jié)腸組織放入0.9 mL 預(yù)冷的PBS（pH=7.4）置于勻漿機(jī)中充分研磨均勻，3000 r·min-1離心20 min，取20 μL 上清，按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行加樣、室溫溫育、洗板，最后在波長450 nm 處進(jìn)行比色讀數(shù)，測定結(jié)腸組織中5-HT、VIP、NO和NOS水平。

1.3.7 Western blot 檢測結(jié)腸組織中c-kit 和SCF 蛋白表達(dá)

取適量結(jié)腸組織，采用RIPA 裂解液抽提組織蛋白，使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。取25 μg 蛋白樣品與SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液混合，100℃加熱5 min 充分變性蛋白，電泳1.5 h 分離蛋白，切膠、剪膜、濾紙、轉(zhuǎn)PVDF 膜，室溫封閉1 h，依次加入c-ki（t1∶1000）、SCF（1∶1000）和內(nèi)參β-actin（1∶1000）抗體，4℃孵育過夜。次日，TBST 洗脫3 次，加入稀釋過的HRP 標(biāo)記的二抗（1∶10000）室溫孵育1 h，TBST洗脫3 次，按照ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒說明書進(jìn)行顯影拍照。采用Image J軟件計(jì)算各個(gè)蛋白灰度值，計(jì)算出目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參β-actin的灰度值。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 NOB對小鼠排便量和糞便含水量的影響

由表1 和表2 可知，各組小鼠造模前24 h 排便量和糞便含水量無顯著差異（P＞0.05），造模后，與CON組比較，MOD、PC、NOB-L、NOB-M、NOB-H 組小鼠24 h 排便量和糞便含水量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明出現(xiàn)STC疾病現(xiàn)象，即糞便次數(shù)減少且干燥；經(jīng)藥物干預(yù)后，與CON 組比較，MOD 組小鼠排便量和糞便含水量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與MOD 組比較，PC、NOB-M、NOB-H 組小鼠排便量和糞便含水量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且PC 和NOB-H 組更顯著，而NOB-L 組小鼠以上檢測無顯著差異（P＞0.05）。提示NOB 對STC 小鼠的排便情況有緩解作用，且緩解程度與給藥劑量呈正比。

表1 各組小鼠各時(shí)間點(diǎn)24 h排便量變化（，n=12）

表1 各組小鼠各時(shí)間點(diǎn)24 h排便量變化（，n=12）

注：與CON組比較，*P＜0.05；與MOD組比較，#P＜0.05。

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表2 各組小鼠各時(shí)間點(diǎn)24 h糞便含水量變化（，n=12）

表2 各組小鼠各時(shí)間點(diǎn)24 h糞便含水量變化（，n=12）

注：與CON組比較，*P＜0.05；與MOD組比較，#P＜0.05。

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2.2 NOB對小鼠腸道推進(jìn)率的影響

與CON 組比較，MOD 組小鼠腸道推進(jìn)率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與MOD 組比較，NOB-L 組小鼠腸道推進(jìn)率無顯著性差異（P＞0.05），而PC、NOBM、NOB-H 組小鼠腸道推進(jìn)率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中PC 和NOB-H 組腸道推進(jìn)率最高。表明NOB可有效促進(jìn)腸道推進(jìn)，加快排便。見表3。

表3 NOB對小鼠腸道推進(jìn)率的影響（，n=12）

表3 NOB對小鼠腸道推進(jìn)率的影響（，n=12）

注：與CON組比較，*P＜0.05；與MOD組比較，#P＜0.05。

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2.3 NOB對小鼠結(jié)腸肌電慢波活動(dòng)的影響

如表4所示，與CON 組比較，MOD 組小鼠頻率、頻率變異系數(shù)和振幅變異系數(shù)升高，振幅降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與MOD 組比較，PC、NOB-M、NOB-H組小鼠頻率、頻率變異系數(shù)和振幅變異系數(shù)降低，振幅升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而NOB-L組小鼠以上檢測無顯著性差異（P＞0.05），PC 和NOBH 組結(jié)腸肌電效果最佳，說明NOB 具有增強(qiáng)結(jié)腸肌電活動(dòng)的能力。

表4 NOB對小鼠結(jié)腸肌電慢波活動(dòng)的影響（，n=12）

表4 NOB對小鼠結(jié)腸肌電慢波活動(dòng)的影響（，n=12）

注：與CON組比較，*P＜0.05；與MOD組比較，#P＜0.05。

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2.4 NOB干預(yù)后小鼠結(jié)腸組織病理變化

如圖1所示，CON組結(jié)腸組織黏膜層完整，杯狀細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量正常。MOD 組結(jié)腸組織肌層變薄，黏膜層破損，腺體腔變窄、杯狀細(xì)胞減少，并且固有層及黏膜下層有大量炎癥細(xì)胞浸潤；NOB-L 組結(jié)腸組織病理變化與模型組相似，出現(xiàn)明顯的腺體腔變窄、杯狀細(xì)胞減少現(xiàn)象。與模型組比較，PC、NOB-M、NOB-H 組結(jié)腸組織有所改善，且PC、NOB-H 組改善最為明顯，表現(xiàn)為肌層變厚，杯狀細(xì)胞和腺體腔恢復(fù)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤，基本接近于CON 組；而NOB-M 組結(jié)腸組織肌層比PC、NOB-H 組肌層薄，存在少數(shù)腺體腔變窄。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化（HE，100×）

2.5 NOB對小鼠結(jié)腸組織5-HT、VIP、NO和NOS水平的影響

如表5 所示，與CON 組比較，MOD 組小鼠結(jié)腸組織中5-HT、VIP、NO 和NOS 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與MOD 組比較，PC、NOB-M、NOB-H組小鼠結(jié)腸組織中5-HT、VIP、NO 和NOS 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中PC 和NOB-H 組小鼠結(jié)腸組織中5-HT、VIP、NO 和NOS 水平降低更明顯，而NOB-L 組小鼠以上檢測無顯著性差異（P＞0.05）。說明NOB 可降低STC 小鼠結(jié)腸組織中腸神經(jīng)遞質(zhì)的活性。

表5 NOB對小鼠結(jié)腸組織中5-HT、VIP、NO和NOS水平的影響（，n=12）

表5 NOB對小鼠結(jié)腸組織中5-HT、VIP、NO和NOS水平的影響（，n=12）

注：與CON組比較，*P＜0.05；與MOD組比較，#P＜0.05。

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2.6 NOB對小鼠結(jié)腸組織中c-kit、SCF表達(dá)的影響

如圖2 所示，與CON 組比較，MOD 組小鼠結(jié)腸組織中c-kit 和SCF 蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與MOD 組比較，PC、NOB-M、NOB-H 組小鼠結(jié)腸組織中c-kit和SCF 蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中NOB-H 組c-kit 和SCF 蛋白水平最高，而NOB-L 組小鼠以上檢測無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織中SCF/c-kit信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討論

NOB 是從蕓香科川橘、酸橙、柑橘等果皮、葉和莖中提取出的一種多甲氧基黃酮類化合物，因其具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗誘變等多種生物活性而引起關(guān)注，但近幾年研究發(fā)現(xiàn)NOB 在治療腸道疾病上也有重大作用，例如，研究證實(shí)，NOB通過抑制NF-κB信號通路的表達(dá)，減少腸道內(nèi)NOS、炎癥因子等含量，誘導(dǎo)腸平滑肌收縮和腸動(dòng)力平衡，從而減輕炎癥性腸病引起的腹瀉；NOB還可影響腸道微生物的組成和活性，促進(jìn)腸道對物質(zhì)的吸收，增強(qiáng)腸道蠕動(dòng)[7-8]。Wu等[9]研究顯示，NOB對結(jié)腸組織中NO呈劑量依賴性抑制。但NOB在STC 疾病中是否有治療作用，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOB 對STC 的治療作用與藥物劑量呈正比，高劑量NOB 所得結(jié)果與莫沙必利結(jié)果一致，表示高劑量NOB的有效性；即高劑量NOB可能通過上調(diào)SCF和c-kit蛋白表達(dá)，降低結(jié)腸組織中神經(jīng)遞質(zhì)的含量，增強(qiáng)STC小鼠結(jié)腸肌電活動(dòng)和腸道推進(jìn)，從而減輕結(jié)腸損傷，改善排便障礙，達(dá)到治療STC的效果。

臨床試驗(yàn)中STC 疾病女性發(fā)病率高于男性，并且雌性小鼠采用洛哌丁胺誘導(dǎo)便秘效果最佳[10-12]。因此本研究采用雌性小鼠通過鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)STC 小鼠模型，結(jié)果顯示，STC 小鼠排便量、糞便含水量和腸道推進(jìn)率明顯降低，結(jié)腸組織損傷顯著，與姚一博等[13]研究一致，呈明顯的結(jié)腸功能障礙，表明STC 小鼠模型構(gòu)建成功。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)STC 小鼠結(jié)腸肌電活動(dòng)、腸神經(jīng)傳遞及結(jié)腸中SCF和c-kit蛋白表達(dá)均發(fā)生變化。

結(jié)腸肌電運(yùn)動(dòng)與ICCs 有關(guān)。ICCs 作為腸道起搏器，在腸道內(nèi)產(chǎn)生電振蕩，引起平滑肌收縮從而波動(dòng)結(jié)腸肌電慢波（慢波）[14-15]。夏旭婷等[16]研究表明，STC小鼠可引起Ca2+濃度降低，ICCs數(shù)量減少，慢波電流大量產(chǎn)生，導(dǎo)致慢波頻率升高，振幅降低，慢波波形紊亂，使鄰近的平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生不協(xié)調(diào)的收縮，從而引起結(jié)腸運(yùn)動(dòng)障礙。本研究結(jié)果顯示，NOB-H組小鼠排便量、糞便含水量和腸道推進(jìn)率明顯升高，結(jié)腸組織損傷減輕，提示STC 有所改善。同時(shí)，NOB-H 組小鼠慢波頻率、頻率和振幅的變異系數(shù)明顯降低，振幅明顯升高。說明NOB 可調(diào)節(jié)STC 小鼠的結(jié)腸肌電，進(jìn)而影響平滑肌收縮的節(jié)律，促進(jìn)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，改善結(jié)腸功能障礙，加快排便。

SCF 和c-kit 蛋白可調(diào)控腸道神經(jīng)的傳遞[17]。SCF結(jié)合c-kit 激活各種細(xì)胞信號的級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)ICCs細(xì)胞增殖生長；而ICCs 作為腸神經(jīng)遞質(zhì)作用的靶細(xì)胞，可調(diào)節(jié)ENS 中多種腸神經(jīng)遞質(zhì)（例如：5-HT、VIP、NO）表達(dá)和信號傳導(dǎo)，引起腸神經(jīng)傳遞，從而影響腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)[18]。其中5-HT、VIP、NO 等腸神經(jīng)遞質(zhì)均與腸蠕動(dòng)相關(guān)。腸神經(jīng)遞質(zhì)受到刺激時(shí)，5-HT 作用于腸神經(jīng)元釋放VIP、NO，VIP 和NO 作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，影響腸道蠕動(dòng)反射和平滑肌的舒張；而過量的NO 可導(dǎo)致腸道平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度減少，使腸道平滑肌過度舒張，出現(xiàn)腸痙攣現(xiàn)象[19]。NOS是合成NO的限速酶，研究指出，便秘小鼠腸道中NOS 活性被抑制時(shí)，可減少NO 的生成，緩解便秘[20]。眾多研究表明，STC 可下調(diào)SCF/c-kit 信號通路，結(jié)腸組織中5-HT、VIP、NO、NOS含量升高，對胃腸道呈下行性抑制，ICCs和ENS 損害，腸神經(jīng)傳遞減弱，胃腸蠕動(dòng)緩慢，腸道代謝紊亂，產(chǎn)生便秘[21-22]。本研究結(jié)果顯示，NOB-H 組小鼠結(jié)腸組織中c-kit 和SCF 蛋白水平明顯升高，5-HT、VIP、NO、NOS 水平明顯降低，說明NOB 通過上調(diào)SCF 和c-kit 蛋白表達(dá)，降低腸神經(jīng)遞質(zhì)活性，增強(qiáng)腸神經(jīng)傳遞能力，從而調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)。

4 結(jié)論與創(chuàng)新

NOB 通過調(diào)節(jié)結(jié)腸肌電、增強(qiáng)腸道神經(jīng)傳遞、促進(jìn)腸道推進(jìn)，從而改善STC 小鼠排便情況，其作用機(jī)制可能與上調(diào)SCF 和c-kit 蛋白表達(dá)有關(guān)。由于本研究沒有加入SCF/c-kit信號通路抑制劑（ISCK03），故無法確定是通過影響SCF/c-kit信號通路來調(diào)控，后續(xù)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，關(guān)于治療STC 的中醫(yī)藥較多，但NOB 治療STC 的研究從未有過先例，本研究首次揭示NOB 對鹽酸洛哌丁胺所致小鼠STC 的緩解作用，并科學(xué)闡釋其作用機(jī)制，對于NOB 在胃腸動(dòng)力異常的臨床運(yùn)用上具有重要意義。