基于NETs探討三七總皂苷干預(yù)動脈粥樣硬化伴急性心肌損傷的效應(yīng)及機制研究＊

楊禎妮，李深廣，陳 瑜，2，熊敏琪，2＊＊，張 騰，2＊＊

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海 200437；2. 上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所 上海 200437）

近年來，全球心血管疾?。–ardiovascular disease，CVD）患病率和死亡率顯著上升，2020年12月JACC發(fā)表的《全球心血管疾病和危險因素負(fù)擔(dān)1990-2019》顯示[1]，全球CVD 患病人數(shù)從1990 年的2.71 億增加到2019 年的5.23 億，CVD 死亡人數(shù)從1990 年的1210 萬增加到2019 年的1860 萬。目前，CVD 是全球的主要死亡原因，占全球所有死亡人數(shù)的1/3，而AS導(dǎo)致的死亡占CVD總死亡的3/4[2-3]。

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是CVD 的主要病理基礎(chǔ)，AS的發(fā)展往往伴隨著動脈狹窄導(dǎo)致的心肌缺血缺氧，臨床上AS 伴急性心肌損傷是最常見的情況，多靶點積極治療方案對于降低AS 致殘致死率具有重要意義。

中性粒細(xì)胞是人體數(shù)量最多的天然免疫效應(yīng)細(xì)胞，最先被招募于炎癥部位。中性粒細(xì)胞除了經(jīng)典的吞噬、脫顆粒作用以外，還可以通過NETosis 形式釋放中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（Neutrophil extracellular traps，NETs）捕獲并殺傷病原體。NETs 已證實參與AS 始動和調(diào)控環(huán)節(jié)，NETs 激活巨噬細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β），從而激活了輔助性T 細(xì)胞17（TH17），擴大了免疫細(xì)胞在粥樣硬化灶的聚集，最后引起慢性炎癥反應(yīng)[4]。目前研究提示NETs 加重急性心肌損傷，與急性心肌梗死的不良預(yù)后存在明顯的相關(guān)性。研究表明NETs 通過ROS 依賴性途徑形成大量NETs 加重小鼠急性心肌損傷，并且，通過輸注脫氧核糖核酸Ⅰ（Deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）降解NETs 后，缺血再灌注的損傷心肌得到改善。然而，NETs在急性心肌梗死中的作用及機制尚未完全闡明，盡管面臨挑戰(zhàn)，NETs 的研究在CVD 中的新見解有望為AS伴急性心肌損傷的治療提供新的途徑。

三七又名田七，五加科人參屬植物，是中藥寶庫中的一顆明珠，明代著名藥學(xué)家李時珍稱其為“金不換”。清代藥學(xué)著作《本草綱目拾遺》中記載“人參補氣第一，三七補血第一，味同而功亦等，故稱人參三七，為中藥中之最珍貴者”。三七具有化瘀止血、活血定痛的功效，是中華名貴藥材，在經(jīng)方中有400多年的歷史，其在心血管系統(tǒng)的用藥價值得到廣泛的關(guān)注和認(rèn)可。

PNS作為三七主要活性成分，其在AS中的作用得到廣泛認(rèn)可，本課題組前期研究提示PNS 組具有顯著抗AS斑塊形成和減輕斑塊組織炎癥等作用[5-6]，隨著研究的深入，本文進(jìn)一步從NETs這一炎癥始動因素為切入點，探討PNS對AS伴急性心肌損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J小鼠為背景的ApoE-/-小鼠21只，體質(zhì)量（19±2）g，8 周齡，SPF 級，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK（蘇）2010-0001。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物實驗中心，動物倫理審批號：YYLAC-2020-079-2-3。在溫度18-22℃，相對濕度35%-55%環(huán)境中給予光照（12 h）/暗室（12 h）交替。

1.2 藥物與試劑

PNS（純度≥98%）（批號：D339879）：購于上海泛亞生物醫(yī)藥集團(tuán)；0.9% 生理鹽水注射液（批號：D21071702）：購于華裕（無錫）制藥有限公司。ISO（純度≥99%）：購于東京化成工業(yè)株式會社（TCI）。Ly6G抗體（批號：551461）：購于美國BD Biosciences 公司。MPO 抗體（批號：PA5-16672）：購于美國Thermo Fisher公司。Cit-H3 抗體（批號：ab5103）：購于美國Abcam公司。山羊抗兔小鼠二抗（批號：8890s）：購于美國Cell Signaling Technology 公司。驢抗兔二抗（批號：ab150073）購于：美國Abcam公司。

1.3 主要儀器

冰凍切片機（型號：CM3050S）、正置熒光顯微鏡（型號：DM6000B）、正置顯微鏡（型號：DM2000），德國Leica 公司；電子天平（型號：FA1004B），上海精密科學(xué)儀器有限公司；組織脫水機（型號：TP1020），組織包埋機（型號：EG1150C），石蠟切片機（型號：RM2235），冰凍切片機（型號：CM3050S），德國Leica公司。

1.4 體內(nèi)實驗

所有實驗動物用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按隨機數(shù)字表法將其分為3 組，每組7 只。分別為ApoE-/-組、ISO 組、PNS 組。從動物8 周齡開始，PNS 組腹腔注射200 mg·kg-1·d-1，溶于0.9%生理鹽水，每只100 μL，ISO 組和ApoE-/-組給予等體積生理鹽水，每天定點給藥，連續(xù)8周，同時所有動物給予高脂飼料加速AS 發(fā)病過程。所有小鼠連續(xù)給藥8 周后ISO 組、PNS組疊加腹腔注射ISO（溶于0.9%生理鹽水）10 mg·kg-1，每只100 μL，每天定點注射1 次，連續(xù)5 天，并觀察統(tǒng)計動物死亡數(shù)據(jù)。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 主動脈根部斑塊病理檢測

動物處死，分離主動脈及心臟，心房連同主動脈根部用OCT 包埋，液氮速凍，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，使用冰凍切片機將冰凍組織制成10 μm冰凍切片。采用HE 染色法觀察，冰凍切片經(jīng)蘇木素浸染、伊紅浸染、梯度乙醇脫水、中性樹脂封固后在正置顯微鏡下觀察。觀察斑塊的組織結(jié)構(gòu)，采用Image Pro Plus 6.0 軟件分析，測量斑塊/血管腔面積比，并計算平均值。采用油紅O 染色法觀察，冰凍切片經(jīng)60%乙醇分化，取油紅飽和液滴染5-10 min 后，60%乙醇分化后蘇木素復(fù)染核，水洗、甘油明膠封片。在正置顯微鏡下觀察，采用Image Pro Plus 6.0 軟件分析，測量脂質(zhì)沉積面積/斑塊面積比，并計算平均值。

1.5.2 心肌組織病理檢測

切割下心室部分采用4%多聚甲醛浸泡固定，蒸餾水沖洗后進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋，制成4 μm 連續(xù)切片。采用HE 染色法觀察，石蠟切片經(jīng)脫蠟至水、蘇木素浸染、伊紅浸染、梯度乙醇和二甲苯脫水、中性樹脂封片后，正置顯微鏡隨機取5 個以上視野測量病變部位，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析，測量心肌損傷部位面積，并計算平均值。采用天狼星紅染色法觀察，石蠟切片經(jīng)脫蠟至水、蘇木素浸染、天狼星紅浸染、梯度乙醇和二甲苯脫水、中性樹脂封片。正置顯微鏡隨機取5 個以上視野測量病變部位，采用Image Pro Plus 6.0 軟件分析，進(jìn)行心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）分析,CVF=膠原面積/總面積。并計算平均值。

1.5.3 主動脈根部斑塊MPO、Ly6G抗原活性

采用免疫組織化學(xué)法檢測。將斑塊冰凍切片用TBS 清洗后，5% BAS+10%山羊血清+10%驢血清封閉，滴加一抗鼠Ly6G（1∶1000）單克隆抗體，滴染熒光二抗山羊抗小鼠（1∶1000），滴加復(fù)染一抗兔MPO（1∶500），滴染熒光二抗驢抗兔（1∶1000）。正置熒光顯微鏡熒光激發(fā)成像并觀察記錄，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析計算斑塊部位目的抗原平均熒光強度。

1.5.4 心肌組織Ly6G、Cit-H3抗原活性

采用免疫組織化學(xué)法檢測。將心肌石蠟切片常規(guī)脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù)、5% BAS+10%山羊血清+10%驢血清封閉，滴加一抗Cit-H3 單克隆抗體（1∶1000），熒光二抗驢抗兔（1∶1000），復(fù)染一抗Ly6G 單克隆抗體（1∶500），滴染熒光二抗山羊抗小鼠（1∶1000）。正置熒光顯微鏡熒下觀察，采用Image Pro Plus 6. 0 軟件分析計算心肌部位目標(biāo)抗原平均熒光強度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件分析。實驗數(shù)據(jù)為計量資料均符合正態(tài)分布，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PNS 組對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊形成的抑制作用

ApoE-/-組和ISO 組小鼠主動脈內(nèi)膜出現(xiàn)大量斑塊（圖1），經(jīng)過比較斑塊/管腔相對面積，與ApoE-/-組相比，ISO 組斑塊相對面積未見明顯差異（P＞0.05）。與ApoE-/-組和ISO 組相比，PNS 組均能顯著減小斑塊面積，差異具有統(tǒng)有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠主動脈H&E染色（×50）

2.2 PNS 組對ApoE-/-小鼠主動脈脂質(zhì)沉積的抑制作用

ApoE-/-組和ISO 組小鼠主動脈斑塊部位出現(xiàn)大量脂滴沉積（圖2），比較量化后脂質(zhì)/斑塊面積相對值，PNS 組與ApoE-/-組和ISO 組比較，PNS 組均能顯著減少斑塊上的脂質(zhì)沉積，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠主動脈根部油紅O染色（×50），局部放大圖片（×200）

2.3 PNS 組對ApoE-/-小鼠心肌纖維化形成的抑制作用

與ApoE-/-組相比，ISO 組小鼠心肌組織可見大面積廣泛性纖維化形成（圖3），比較量化后的心肌纖維化損傷面積與心肌橫截面面積比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與ISO 組相比，PNS 組能顯著減少心肌纖維化損傷，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠心肌HE染色（×50），局部放大圖片（×200）

2.4 PNS 組對ApoE-/-小鼠心肌膠原纖維沉積的抑制作用

與ApoE-/-組相比，ISO 組小鼠心肌組織間隙大量膠原纖維浸潤（圖4），比較量化后的CVF 值，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與ISO 組相比，PNS 組能減少心肌纖維化面積，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組小鼠心肌組織天狼星紅染色（×200）

2.5 PNS組對斑塊中Ly6G、MPO表達(dá)的抑制作用

ApoE-/-組和ISO 組小鼠斑塊中可見大量Ly6G、MPO 表達(dá)（圖5），比較斑塊內(nèi)Ly6G、MPO 的平均熒光強度，ApoE-/-組與ISO 組相比，Ly6G、MPO 表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。與ApoE-/-組和ISO 組相比，PNS 組Ly6G、MPO表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

圖5 各組小鼠主動脈根部斑塊Ly6G、MPO免疫組織化學(xué)法染色（×400）

2.6 PNS 組減少心肌纖維化部位Cit-H3 和Ly6G 的產(chǎn)生

與ApoE-/-組相比，ISO 組小鼠心肌損傷部位中可見大量Cit-H3、Ly6G 表達(dá)（圖6），經(jīng)比較斑塊內(nèi)Cit-H3、Ly6G 的平均熒光強度，ISO 組小鼠斑塊內(nèi)Cit-H3、Ly6G 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與ISO 組相比，PNS 組Cit-H3、Ly6G表達(dá)顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。

圖6 各組小鼠心肌損傷部位Cit-H3、Ly6G免疫組織化學(xué)法染色（×400）

3 討論

NETs 從2004 年被發(fā)現(xiàn)以來，其在心血管領(lǐng)域的研究已經(jīng)得到迅速發(fā)展。NETs 促進(jìn)免疫反應(yīng)的發(fā)展及持續(xù)，在AS 形成中發(fā)揮重要調(diào)控作用[7]。大量實驗和臨床文獻(xiàn)將NETs 與許多CVD 聯(lián)系起來，NETs 可以加速CVD 發(fā)展，其分泌到胞外的DNA、組蛋白以及蛋白酶等NETs組分可作為自身抗原引起炎癥[8-9]。NETs在急性心肌梗死、不穩(wěn)定斑塊和血栓形成中具有重要的作用，這提示NETs具有作為治療靶點的潛力。

PNS 作為三七的主要有效成分，對多種心血管疾病均有良好的防治作用，且安全無明顯毒副作用。近年來，有關(guān)三七及PNS 治療心血管系統(tǒng)疾病的報道較多，在一系列有關(guān)PNS 治療CVD 的藥理學(xué)作用研究中，其對于NETs的作用探索還是一個盲點。

ISO 皮下注射建立的心肌缺血模型是一種相對無創(chuàng)、簡單的經(jīng)典模型[10]，本研究中在高脂飲食8 周后疊加注射5 天ISO 模擬臨床上的AS 伴急性心肌損傷的病理進(jìn)程，結(jié)果提示，ISO 在對心肌造成損傷的方面效果顯著，在本模型中ISO 沒有顯著加劇AS中斑塊的面積，但是在脂質(zhì)沉積方面的作用顯著，提示本研究中ISO 對于斑塊的影響還處于AS 早期階段，ISO 對小鼠的刺激僅增加了內(nèi)膜損傷部位的脂質(zhì)沉積，還未進(jìn)展到斑塊形成階段。相比于近期一篇研究采用6周的高脂飲食疊加ISO注射模擬與本研究相似臨床模型中顯示，ISO 刺激6 周會增加高脂飲食ApoE-/-小鼠的斑塊面積[11]。本文擬探索的側(cè)重點是動脈粥樣硬化伴急性心肌損傷情況下PNS 多靶點效應(yīng)和可能的機制，因此采用短期注射ISO 造模，誘導(dǎo)急性心肌損傷模型符合臨床，以期為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，并且本研究中斑塊部位病理染色結(jié)果也提示了該復(fù)合模型建立的可行性以及對于臨床中病癥發(fā)展過程較高的模擬性。此外，基于前期研究基礎(chǔ)[5]，PNS 采用腹腔注射方式給藥，保證了其在小鼠體內(nèi)的生物利用度。

綜上，本文在動物實驗層面，通過高脂飲食的ApoE-/-小鼠疊加注射ISO 的模型，從抑制相關(guān)免疫機制觸發(fā)這一方面，系統(tǒng)評價了PNS對AS伴急性心肌損傷的治療作用，對PNS 干預(yù)NETs 的藥理學(xué)機制進(jìn)行了分析與探索。

本研究結(jié)果顯示，PNS 可以減輕ISO 小鼠斑塊面積和斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積，改善ISO小鼠心肌損傷，減輕心肌組織排列紊亂和心肌組織膠原纖維沉積。Ly6G 作為中性粒細(xì)胞標(biāo)志物，可以評價病變部位中性粒細(xì)胞粘附情況。MPO 是缺血損傷過程中的關(guān)鍵炎癥酶和治療靶點，在病理過程中通過促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生介導(dǎo)氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞極化等炎癥相關(guān)信號通路[12]。同時MPO、Cit-H3 作為NETs 的主要組分，是用于評價中性粒細(xì)胞NETs 釋放的高度特異性標(biāo)志物，免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果提示，PNS 可以減輕斑塊內(nèi)Ly6G、MPO 和心肌部位Ly6G、Cit-H3 的表達(dá)。本文結(jié)果提示PNS抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs進(jìn)而減緩AS和急性心肌損傷的進(jìn)一步加重。

以上，PNS的雙重治療效果為理解AS及其并發(fā)癥的病理機制提供了新的思路，有望進(jìn)一步挖掘PNS 其在更多領(lǐng)域和層面發(fā)揮理想的多重治療效果。