基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討喉咽清治療咽炎的作用機(jī)制＊

張 恒，王玉鳳，唐純玉，張堅(jiān)強(qiáng)，王雄龍，李 丹，劉實(shí)琪，涂紅英，李順祥＊＊，歐陽文，4，＊＊

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 長沙 410208；2. 湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 長沙 410208；3. 湖南時(shí)代陽光藥業(yè)股份有限公司 永州 410116；4. 湖南時(shí)代陽光博士后科研流動站協(xié)作研發(fā)中心 永州410116；5. 瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院 瀏陽 410300）

咽炎（Pharyngitis）是咽部粘膜、粘膜下組織及其淋巴組織的炎癥反應(yīng)，包括急性咽炎與慢性咽炎[1-2]。近年來，隨著社會的發(fā)展與環(huán)境的改變，咽炎的發(fā)病率不斷呈上升的趨勢，該病一年四季均可染病，無論是急性咽炎還是慢性咽炎，如果反復(fù)發(fā)作，對人體特別是肺部的傷害十分嚴(yán)重，不僅會影響患者的呼吸功能，而且大大降低了患者的生活質(zhì)量。相比于西醫(yī)通過使用單一的抗生素、糖皮質(zhì)激素等藥物以達(dá)到治療咽炎的目的，中醫(yī)的治療方法療效更加顯著，且不良反應(yīng)相對較少、安全性更高[3]。因此，尋找開發(fā)出能對咽炎產(chǎn)生顯著療效的中藥制劑，一直是社會醫(yī)療中的熱點(diǎn)關(guān)注問題。

喉咽清口服液（顆粒）是湖南時(shí)代陽光藥業(yè)股份有限公司自主研制開發(fā)的國家級新藥，由土牛膝、馬蘭草、車前草、天名精四味中藥加水煎制而成，四味中藥均屬寒涼藥、歸肝經(jīng)，且均有清熱解毒的效果，四藥合用，增其清熱解毒之功，另有涼血利咽之效，臨床常用于肺胃實(shí)熱所致的咽部紅腫、咽痛、口渴、發(fā)熱、急性扁桃體炎、急性咽炎見上述證候者[4]，連續(xù)被2010、2015、2020 版《中國藥典》收錄[5]。該制劑具有良好的研究前景，并且在2020年新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的治療過程中被湖南省衛(wèi)生健康委納入《湖南省兒童新型冠狀病毒感染臨床診斷與治療專家共識（試行第一版）》[6]。大量研究表明，喉咽清在治療咽炎方面具有良好的抗炎作用[7-10]，胡蓉等[11]對喉咽清顆粒治療風(fēng)熱喉痹的臨床療效及安全性進(jìn)行研究，并將其與連花清瘟顆粒的臨床療效進(jìn)行比較，結(jié)果表明喉咽清顆粒治療風(fēng)熱喉痹的安全性、有效性均高于連花清瘟顆粒。喉咽清因其在抗炎方面安全有效，在臨床上已有多次藥物聯(lián)用研究，寧來忠[12]對喉咽清口服液聯(lián)合利巴韋林氣霧劑治療兒童急性咽炎的臨床療效進(jìn)行研究，結(jié)果顯示兩種藥物聯(lián)用后臨床總治療率升高，且無不良反應(yīng)的增加。多次研究結(jié)果表明[13-18]，當(dāng)其他藥物與喉咽清聯(lián)用后，可在臨床上獲得更好的療效并降低前者藥物的毒副作用，喉咽清還可用于放射性化療等治療方式引起的口腔潰瘍等炎癥反應(yīng)，均取得良好的臨床反饋。但是，目前對喉咽清抗炎機(jī)制的研究報(bào)道相對較少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合多向藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，具有整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)，能揭示“藥物-基因-靶點(diǎn)-疾病”之間相互作用的關(guān)系，與中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特征相吻合，能夠加速中藥藥效物質(zhì)與作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)過程，改進(jìn)藥物研究策略[19-20]。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動物實(shí)驗(yàn)對喉咽清抗炎機(jī)制進(jìn)行研究，以期為其臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 喉咽清有效成分篩選

通過傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php，TCMSP）[21]及相關(guān)文獻(xiàn)檢索喉咽清的主要活性成分。根據(jù)中藥成分藥物代謝動力學(xué)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行篩選，設(shè)置OB（口服利用度）≥30%，DL（藥物相似性）≥0.18 為篩選條件。并結(jié)合課題組前期研究結(jié)果[22]，將符合要求的活性成分同時(shí)納入，匯總后得到喉咽清的主要活性成分。

1.2 喉咽清潛在靶點(diǎn)預(yù)測、抗炎靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫、Swiss 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）[23]查詢喉咽清主要活性成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)，同時(shí)通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）[24]查詢靶點(diǎn)對應(yīng)的基因名，選擇物種為“人類（Homo sapiens）”，建立數(shù)據(jù)集，將靶點(diǎn)蛋白名稱對應(yīng)Uniprot數(shù)據(jù)集統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因名。檢索GeneCards在線數(shù)據(jù)庫（https://www. genecards. org/）[25]，選擇“antiinflammatory”為關(guān)鍵詞，獲得與抗炎相關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)集。使用TBtools 軟件[26]中“Graphics Venn”功能，提取藥物與疾病交集靶點(diǎn)作為喉咽清抗炎潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 喉咽清PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將喉咽清抗炎的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 在線數(shù)據(jù)庫（STRING: functional protein association networks(string-db.org)）獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)，選擇物種為“人類”，置信度設(shè)置為0.400，使用Cytoscape 3.9.0[27]中CytoNCA插件中的degree 值算法篩選出得分前30 的潛在核心靶點(diǎn)，將30個(gè)潛在核心靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“人類”，置信度設(shè)置為0.900，得到喉咽清潛在核心靶點(diǎn)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 “藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將“藥材-成分”、“成分-靶點(diǎn)”信息導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 繪制“藥材-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。藥材、成分、靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)圖中用節(jié)點(diǎn)表示，兩個(gè)節(jié)點(diǎn)間的相互作用用邊表示。

1.5 “核心靶點(diǎn)-活性成分”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選得到的核心靶點(diǎn)匹配相應(yīng)的活性成分，通過Cytoscape3.9.0繪制“核心靶點(diǎn)-活性成分”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 喉咽清GO及KEGG通路富集分析

通過DAVID Bioinformatics Resources 6.8在線分析平臺[28]（DAVID Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis (ncifcrf.gov)）對喉咽清核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。選取BP（生物學(xué)過程）、MF（分子功能）及KEGG富集通路前30個(gè)條目進(jìn)行氣泡圖繪制。

1.7 喉咽清活性成分和核心靶點(diǎn)分子對接驗(yàn)證

核心靶點(diǎn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)通過PDB 數(shù)據(jù)庫[29]（https://www.rcsb.org/）下載得到，活性成分的三維結(jié)構(gòu)圖通過PubChem 在線數(shù)據(jù)庫[30]（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載獲得。通過Open Babel-2.4.1 軟件[31]將活性成分的三維結(jié)構(gòu)統(tǒng)一成PDB 格式。在Autodock 4.2.6軟件[32]中將準(zhǔn)備的靶點(diǎn)蛋白與活性成分進(jìn)行前處理，隨后通過Autodocking 將處理好的蛋白與小分子進(jìn)行對接，使用Auto 工具計(jì)算成分與靶蛋白的對接結(jié)合能，再通過Pymol程序[33]將對接結(jié)果可視化。

1.8 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.8.1 實(shí)驗(yàn)動物

25 只SPF 級大鼠，周齡6-8 周，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。常規(guī)飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，自由飲食及進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)過程經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查通過。

1.8.2 試劑

喉咽清口服液，由湖南時(shí)代陽光藥業(yè)股份有限公司提供，生產(chǎn)批號：20210716；大鼠白介素6（IL-6）ELISA 試劑盒、大鼠白介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA 試劑盒、大鼠血清一氧化氮（NO）ELISA 試劑盒，貨號：G0132W，購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.8.3 儀器

TGL-16.5M 臺式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；SuPerMax 3100 型多功能酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技公司）；梅特勒ME104E 萬分之一電子天平（上海子期實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.8.4 分組、造模及給藥

將25只大鼠在實(shí)驗(yàn)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組5只。咽炎大鼠模型參照文獻(xiàn)方法[34]建立，除正常對照組外，其余各組均在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后在第1-3 天對大鼠咽部涂抹15%氨水（反復(fù)涂抹3次，使咽部黏膜充血腫脹，形成急性炎癥）。正常對照組以等量生理鹽水進(jìn)行涂抹。將氨水誘導(dǎo)的咽炎模型大鼠隨機(jī)分為喉咽清高劑量治療組（5只）、喉咽清低劑量治療組（5 只）、地塞米松治療組（5 只）及模型組（5 只）。實(shí)驗(yàn)第4 天開始每日1 次灌胃治療，給藥劑量參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人與動物體表面積折算等效比值表進(jìn)行折算（大鼠比表面積/人體比表面積=6.6），喉咽清高劑量治療組以2.67 g·kg-1進(jìn)行灌胃治療，喉咽清低劑量治療組以1.34 g·kg-1進(jìn)行灌胃治療，地塞米松治療組以5 mg·kg-1進(jìn)行灌胃治療，連續(xù)灌胃5天。

1.8.5 行為研究和咽組織病理評估

根據(jù)行為和身體評分標(biāo)準(zhǔn)，對喉咽清和地塞米松治療后的氨誘導(dǎo)咽炎大鼠模型的飲食、活動、口腔抓痕、口腔毛發(fā)、咳嗽和唾液分泌變化進(jìn)行行為學(xué)評分。根據(jù)咽炎病理評分標(biāo)準(zhǔn)，對各組大鼠黏膜增生、細(xì)胞浸潤、血管擴(kuò)張出血、腺體肥大改變進(jìn)行咽組織病理評分。

1.8.6 標(biāo)本采集及處理

末次給藥24 h 后，大鼠腹主動脈取血后處死，分離血清，用ELISA 法檢測血清中NO、TNF-α、IL-6 及IL-1β含量。取咽組織，用4%多聚甲醛固定液浸泡，標(biāo)本脫水，石蠟包埋。切片后在顯微鏡下觀察各組大鼠咽部組織情況并進(jìn)行評估。

1.8.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。使用單因素方差分析對組間數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行比較，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 喉咽清治療咽炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 有效成分及靶點(diǎn)篩選

經(jīng)篩選得到喉咽清中潛在成分65個(gè)，其中土牛膝23 個(gè)，車前草21 個(gè)，馬蘭草15 個(gè)，天名精13 個(gè)。其中牛膝、馬蘭草共有成分1 個(gè)，命名為A1；牛膝、車前草共有成分3 個(gè)，分別命名為B1、B2、B3；牛膝、車前草、馬蘭草共有成分1 個(gè)，命名為C1；車前草、馬蘭草共有成分1 個(gè)，命名為D1。喉咽清潛在活性成分篩選結(jié)果見表1，其中部分成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫中未收錄，該部分?jǐn)?shù)據(jù)結(jié)果見表2。

表2 從喉咽清中篩選出的潛在成分及其參數(shù)

將以上成分及對應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0繪制“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，喉咽清“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖如圖1所示，其中土牛膝對應(yīng)233個(gè)靶點(diǎn)，車前草對應(yīng)177個(gè)靶點(diǎn)，馬蘭草對應(yīng)75個(gè)靶點(diǎn)，天名精對應(yīng)96個(gè)靶點(diǎn)，去除各藥材重復(fù)靶點(diǎn)后進(jìn)行匯總，最終喉咽清共含333個(gè)靶點(diǎn)。

圖1 喉咽清潛在活性成分與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.1.2 喉咽清抗炎作用靶點(diǎn)預(yù)測

如圖2所示，在GeneCards數(shù)據(jù)庫共檢索得到抗炎相關(guān)靶點(diǎn)1502個(gè)，其中喉咽清抗炎的潛在作用靶點(diǎn)有165個(gè)。

圖2 喉咽清篩選成分潛在靶點(diǎn)與抗炎靶點(diǎn)韋恩圖

2.1.3 喉咽清抗炎潛在作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將165 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 在線數(shù)據(jù)庫獲得靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系，在0.4 的中等置信度條件下，網(wǎng)絡(luò)中含有165 個(gè)節(jié)點(diǎn)，3630 條相互作用關(guān)系。使用Cytoscape 3.9.0 軟件中的CytoNCA 插件對STRING 數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行degree值算法分析，將degree值排名前30 的網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)作為喉咽清的核心靶點(diǎn)，如圖3 所示。喉咽清核心靶點(diǎn)包括：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Serine/threonine protein kinase，AKT1，degree=124）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF，degree=121）、白細(xì)胞介素-6（Intedeukin-6，IL-6，degree=117）、抑癌基因P53（Tumor Protein P53，TP53，degree=109）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（Prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2，degree=108）。將30個(gè)潛在核心靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”，置信度為0.900，得到喉咽清潛在核心靶點(diǎn)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖4。

圖3 喉咽清核心靶點(diǎn)柱狀圖（前30）

圖4 喉咽清核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)（前30）

2.1.4 喉咽清“核心靶點(diǎn)-活性成分”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“2.1.3”中篩選得到的核心靶點(diǎn)匹配喉咽清中對應(yīng)的活性成分，其“核心靶點(diǎn)-活性成分”網(wǎng)絡(luò)圖如圖5所示。其中，綠色節(jié)點(diǎn)代表藥物來自土牛膝，深黃色節(jié)點(diǎn)代表藥物來自馬蘭草，橙色節(jié)點(diǎn)代表藥物來自車前草，深藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表藥物來自天名精。

圖5 喉咽清“核心靶點(diǎn)-活性成分”網(wǎng)絡(luò)圖

2.1.5 GO及KEGG通路富集分析

DAVID在線分析平臺結(jié)果顯示，得到286條GO條目與生物學(xué)過程（Biological process，BP）有關(guān)，篩選出P＜0.05 且排名前10 的條目，GO-BP 富集結(jié)果見圖6，該富集結(jié)果表明喉咽清抗炎的機(jī)制可能與對藥物的反應(yīng)、調(diào)節(jié)NO生物合成過程、抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞老化、促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，以及和細(xì)胞的增殖與分化密切相關(guān)。分子功能（Molecular function，MF）通路富集得到36條相關(guān)GO 條目，篩選出P＜0.05且排名前10的條目，得到GO-MF富集結(jié)果見圖7，該富集結(jié)果表明喉咽清抗炎機(jī)制可能和酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、影響轉(zhuǎn)錄因子活性及DNA、RNA 序列的特異性結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、調(diào)節(jié)一氧化氮合酶活性等功能密切相關(guān)。KEGG富集條目共得到102條，篩選出P＜0.05且排名前10 的條目，KEGG 通路富集結(jié)果見圖8，該通路結(jié)果表明喉咽清抗炎可能與影響腫瘤合成途徑、乙型肝炎相關(guān)通路、腫瘤壞死因子信號通路、腫瘤蛋白的合成、叉頭轉(zhuǎn)錄因子（Forkhead Box O signaling pathway，F(xiàn)OXO）信號通路等密切相關(guān)。

圖6 喉咽清抗炎潛在核心靶點(diǎn)的GO-BP富集分析（前10）

圖7 喉咽清抗炎潛在核心靶點(diǎn)的GO-MF富集分析（前10）

圖8 喉咽清抗炎潛在核心靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析（前10）

2.1.6 喉咽清分子對接驗(yàn)證結(jié)果

通過AutoDock 軟件對喉咽清復(fù)方篩選得到的活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子半柔性對接驗(yàn)證，通過圖片的形式將活性成分的優(yōu)勢構(gòu)象與核心靶點(diǎn)蛋白相互作用的關(guān)系直觀的展示出來，其分子對接結(jié)果見表3，喉咽清活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白的對接結(jié)合能均為負(fù)數(shù)，該結(jié)果表明進(jìn)行分子對接的配體與受體之間能夠自發(fā)結(jié)合。其中NRF2 蛋白與β-蛻皮甾酮、齊墩果酸、熊果酸的對接結(jié)合能均小于-39 kJ·mol-1，結(jié)合能分別為-39.92、-47.66、-46.15 kJ·mol-1；AKT1蛋白與齊墩果酸的對接結(jié)合能為-42.63 kJ·mol-1。其對接結(jié)合負(fù)能如此之大，說明受體與配體間能自發(fā)緊密結(jié)合，活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白之間的結(jié)合情況與之前的預(yù)測關(guān)系相符。

表3 喉咽清活性成分分子對接結(jié)果

如圖9-1 所示，β-蛻皮甾酮與AKT1 的TYR-350、ASN-351、ARG-367 和ARG-370 等殘基的氫鍵對接；如圖9-5 所示，齊墩果酸與NRF2 的ILE-559、GLY-367、VAL-467 和VAL-606 等殘基的氫鍵連接；如圖9-8 所示，竹節(jié)參皂苷IVa 與IL-6 的ILE-136 和LYS-128 殘基的氫鍵相連。喉咽清復(fù)方篩選所得的活性成分與核心靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的對接親和力，說明喉咽清復(fù)方可能是通過調(diào)節(jié)以上靶點(diǎn)蛋白來發(fā)揮抗炎作用，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)抗炎機(jī)制預(yù)測相吻合。

圖9 分子對接模式圖

2.2 動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

2.2.1 喉咽清對咽炎大鼠一般情況的影響

造模后，模型組大鼠撓口、咳嗽次數(shù)增加，進(jìn)食量與飲水量減少，咽部紅腫，粘液分泌物從口溢出，形成淺表潰瘍，部分模型組大鼠口腔毛發(fā)逐漸脫落；正常組大鼠行為學(xué)特征無異常，整體身體狀況良好，進(jìn)食量與飲水量正常，咽部無紅腫，咽粘膜無潰瘍，口腔毛發(fā)光澤；與模型組大鼠相比，各治療組大鼠咳喘、咽部紅腫情況、唾液量分泌情況及口腔潰瘍情況均有一定程度的改善。急性咽炎大鼠行為學(xué)評分結(jié)果見表4，各組大鼠咽部情況見圖10。

圖10 各組大鼠咽部組織情況圖

表4 急性咽炎大鼠行為學(xué)評分表

2.2.2 喉咽清對咽炎大鼠咽部組織病理學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠咽部軟腭組織結(jié)構(gòu)無異常，軟腭主要由肌、肌腱和黏膜構(gòu)成，由圖11-A1可見，大鼠咽部軟腭組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯炎癥病變的發(fā)生。與正常組相比，模型組大鼠咽部軟腭組織炎癥病變明顯，組織結(jié)構(gòu)大面積增厚肥大。與模型組相比，地塞米松治療組及喉咽清不同劑量組大鼠咽組織炎癥及咽組織增厚程度均有一定的減輕，其中地塞米松治療組及喉咽清高劑量組治療效果明顯。各組均可見咽組織增厚及炎癥反應(yīng)，說明咽炎大鼠模型造模成功（見圖11）。急性咽炎大鼠咽炎病理評分結(jié)果見表5。

表5 急性咽炎大鼠咽炎病理評分表

2.2.3 咽炎大鼠行為學(xué)評估和咽組織病理評估分析結(jié)果

行為學(xué)評分及咽組織病理評分均是各組大鼠的綜合得分，在此基礎(chǔ)上對咽炎大鼠行為學(xué)及咽組織病理評分進(jìn)行組間差異顯著性統(tǒng)計(jì)分析（見表6）。該結(jié)果表示，與空白組相比，模型組咽炎大鼠行為學(xué)及咽組織病理情況具有明顯惡化（P＜0.01）；與模型組相比，各治療組均有不同程度的改善效果。

表6 咽炎大鼠行為學(xué)及咽組織病理評分分析結(jié)果

2.2.4 喉咽清對咽炎大鼠血清NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的影響

由表7可見，與正常組相比，模型組IL-6、IL-1β含量均明顯升高（P＜0.01），TNF-α含有量同樣明顯升高（P＜0.05）；與模型對照組相比，喉咽清高劑量組TNFα、IL-6、IL-1β含有量明顯降低（P＜0.05）；喉咽清高、低劑量組IL-6含有量明顯降低（P＜0.05）。

表7 喉咽清對咽炎大鼠血清NO、TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影響（，n=5）

表7 喉咽清對咽炎大鼠血清NO、TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影響（，n=5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3 討論與展望

本文對喉咽清進(jìn)行抗炎機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測，并結(jié)合動物實(shí)驗(yàn)對關(guān)鍵炎癥因子進(jìn)行驗(yàn)證。對于本文網(wǎng)絡(luò)藥理部分，筆者按照《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價(jià)方法指南》[35-36]對文章中出現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫、軟件等進(jìn)行了溯源，以保證數(shù)據(jù)的可靠性。其中TCMSP 數(shù)據(jù)庫中藥物的口服利用度、類藥性、相關(guān)靶點(diǎn)及所參與的信號通路等數(shù)據(jù)均是通過查閱大量文獻(xiàn)所獲得，且進(jìn)行了人工驗(yàn)證，其準(zhǔn)確性及查全性可靠[37-39]。同時(shí)筆者對文中數(shù)據(jù)進(jìn)行了多次查搜，結(jié)果具有一致性，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。但由于文中所進(jìn)行的靶點(diǎn)及機(jī)制預(yù)測是分別建立在四味中藥而不是整體復(fù)方的基礎(chǔ)上，且喉咽清復(fù)方在煎煮過程中也可能存在化學(xué)成分的變化，因此本研究仍存在一定的局限性，即無法納入喉咽清煎煮后新產(chǎn)生的化學(xué)成分。

對其網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究通過成分、靶點(diǎn)匹配和通路富集，以及對藥材中成分含量的考察，發(fā)現(xiàn)喉咽清中活性成分β-蛻皮甾酮、漢黃芩素、黃芩素、山奈酚、齊墩果酸、熊果酸能對應(yīng)到較多的靶點(diǎn)數(shù)目，還有竹節(jié)參皂苷IVa、竹節(jié)參皂苷V 以及牛膝皂苷I、牛膝皂苷II、牛膝皂苷III 等成分也是其中起抗炎作用的關(guān)鍵成分。研究表明，β-蛻皮甾酮具有抗炎、抗氧化、延緩衰老等功能[40-41]，山奈酚具有抗炎抑菌、抗癌、抗動脈粥樣硬化等功能[42]，齊墩果酸具有抗炎、抗氧化、抗變態(tài)反應(yīng)等功能[43]，熊果酸具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒、保肝等作用[44]。課題組前期研究表明竹節(jié)參皂苷IVa 具有良好的抗炎作用，是喉咽清中關(guān)鍵的抗炎活性成分[22]。由此可見，喉咽清在抗炎方面具有潛在的防治作用?！盎钚猿煞?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)顯示喉咽清抗炎具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

本研究篩選得到喉咽清抗炎相關(guān)靶點(diǎn)165 個(gè)，潛在核心靶點(diǎn)30個(gè)，分別為PTGS2、AKT1、絲裂原活化蛋白激酶3（Mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、IL-6、IL-1β、IL-10、TNF、NFKBIA（NF-kappa-B inhibitor alpha）、胱天蛋白酶3（CASP3，Caspase-3）等。上述核心靶點(diǎn)與抗炎相關(guān)信號通路聯(lián)系密切，其中最典型的核心靶點(diǎn)為IL-6、TNF。IL-6 是多功能炎性細(xì)胞因子，是炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分，在炎癥反應(yīng)中起重要作用，其可以通過抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1 和腫瘤壞死因子而在細(xì)菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性肺損傷中起細(xì)胞保護(hù)和抗炎作用[45]。TNF-α同樣也是一種炎癥因子，與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，它可通過激活細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)而誘發(fā)全身炎性反應(yīng)，阻斷誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)通路上的任一環(huán)節(jié)均可在轉(zhuǎn)錄前水平抑制TNF-α的合成[46]。核心靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果顯示喉咽清治療咽炎主要涉及MAPK3、IL-6、TNF-α等靶點(diǎn)，與文獻(xiàn)報(bào)道[1,47]一致，證明了該預(yù)測的可靠性。因此，喉咽清可能通過調(diào)控IL-6和TNF-α等炎癥因子來起到抗炎的效果。通過AutoDock 軟件對活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，結(jié)果表明活性成分與核心靶點(diǎn)之間存在高度對接結(jié)合力，進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)抗炎機(jī)制的預(yù)測。

動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)喉咽清不同劑量組均可降低大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的表達(dá)，減輕大鼠咽組織炎癥程度，改善咽部組織結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮治療咽部炎癥的作用。但喉咽清高、低劑量組之間的治療效果差別不大，因此對于喉咽清的給藥劑量還需后續(xù)進(jìn)一步研究探討。此外測大鼠血清IL-1β含量時(shí)，喉咽清低劑量組測量值比正常組大鼠更低，且地塞米松治療組血清NO 含量遠(yuǎn)高于模型組，與理論值相差較大，通過對比實(shí)驗(yàn)記錄發(fā)現(xiàn)，存在問題的兩組數(shù)據(jù)均來自于體質(zhì)量增長較慢的大鼠，因大鼠個(gè)體對急性炎癥模型的抵抗力存在一定的差異性，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生部分誤差，與理論值有一定的偏差，但本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)總體上還是能對喉咽清靶向抗炎起到驗(yàn)證作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合動物實(shí)驗(yàn)的方法探討喉咽清治療咽炎的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)喉咽清能夠通過多靶點(diǎn)、多途徑的方式影響腫瘤合成途徑、基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)、炎癥相關(guān)蛋白合成等過程，作用于炎癥相關(guān)通路、腫瘤相關(guān)通路、STAT3 信號通路等產(chǎn)生抗炎的作用。