基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動物實(shí)驗(yàn)的杜仲腰痛丸治療腰椎間盤突出癥慢性下肢痛的作用研究＊

陳祁青，馬 東，趙繼榮，黃軍凱，楊云云，朱 寶，趙 寧

（1. 甘肅省中醫(yī)院 蘭州 730050；2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院 蘭州 730030）

腰椎間盤突出癥是（Lumbar disc herniation，LDH）常見的骨科慢性疾患之一，會導(dǎo)致腰痛、放射狀腿痛和感覺障礙[1]。發(fā)病率約占人口1.00%，多發(fā)于20-40歲人群。主要由于髓核中的水潴留減少，髓核和纖維環(huán)內(nèi)1 型膠原蛋白比例增加，膠原蛋白和細(xì)胞外物質(zhì)的破壞，以及基質(zhì)等降解系統(tǒng)的活性上調(diào)金屬蛋白酶表達(dá)、細(xì)胞凋亡和炎癥通路。最終，導(dǎo)致炎癥趨化因子的局部增加和突出的髓核對神經(jīng)施加機(jī)械壓迫而產(chǎn)生腰腿痛等癥狀[2-3]。近年來，伴隨著當(dāng)下生活辦公方式的轉(zhuǎn)變，LDH 發(fā)病率仍呈上升趨勢，給人們帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)與精神負(fù)擔(dān)。

杜仲腰痛丸是趙繼榮主任醫(yī)師將中醫(yī)理論與臨床實(shí)踐相結(jié)合，經(jīng)相關(guān)藥理研究后組方而成，由杜仲、牛膝、狗脊、酒萸肉、槲寄生、川芎、當(dāng)歸、細(xì)辛、紅花、赤芍、乳香、沒藥等17 種中藥組成，具有補(bǔ)腎壯腰、活血化瘀、通絡(luò)止痛之功。方鵬飛等[4]研究發(fā)現(xiàn)，杜仲腰痛丸能夠有效地提高患者APTT、PGI2、TT 及PT 值，降低血瘀癥積分等相關(guān)凝血指標(biāo)（TXA2、BPC、D-D、FIB），有效改善LDH 患者血瘀狀態(tài)，減輕腰背部疼痛，提高日常生活能力。趙寧等[5]研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用經(jīng)皮激光汽化減壓術(shù)聯(lián)合脊柱調(diào)衡手法及杜仲腰痛丸能夠有效改善LDH 患者VAS疼痛評分，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。王國慧等[6]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，杜仲腰痛丸聯(lián)合電針刺激能夠顯著降低LDH 患者CRP、TNF-α 及IL-6 等血清炎性細(xì)胞因子的水平，改善VAS 評分，從而緩解患者腰部及下肢部的疼痛、麻木、酸楚癥狀。相關(guān)前期研究發(fā)現(xiàn)，杜仲腰痛丸對LDH 療效顯著，其主要機(jī)理在于藥物成分能夠有效降低機(jī)械壓迫后相關(guān)神經(jīng)根組織的水腫，促進(jìn)炎性物質(zhì)的吸收，改善微循環(huán)，從而發(fā)揮出良好的消炎止痛效果，并促使突出的相關(guān)髓核組織達(dá)到一種“無害化”的療效作用[7-8]。雖然杜仲腰痛丸臨床療效突出，但其對于治療LDH 的作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。為此，本研究通過動物實(shí)驗(yàn)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法聯(lián)合分子對接技術(shù)對杜仲腰痛丸治療LDH 的有效成分以及作用機(jī)制進(jìn)行探討分析，以期為臨床的使用和進(jìn)一步研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 藥物與試劑

具體內(nèi)容見表1。

表1 主要藥物與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

具體內(nèi)容見表2。

表2 主要儀器與設(shè)備

1.3 動物與飼養(yǎng)

選取72只6-8周齡，重量為250±20 g的實(shí)驗(yàn)用SD大鼠（雄性），其購置于南京醫(yī)科大學(xué)【SCXK（蘇）2019-0018】。實(shí)驗(yàn)倫理編號：（1ACUC-1909034）。動物飼養(yǎng)、灌胃等相關(guān)實(shí)驗(yàn)均在南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動物中心SPF 級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室溫度控制在22℃，濕度50%，噪聲37-45 dB，光照12 h明/暗循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)庫軟件準(zhǔn)備

TCMSP數(shù)據(jù)平臺下載相關(guān)中藥及靶標(biāo)；GeneCards、OMIM、DrugBank 及PharmGkb 數(shù)據(jù)平臺下載相關(guān)疾病基因；并且TCMSP數(shù)據(jù)平臺是以系統(tǒng)模塊化藥理學(xué)研究為基礎(chǔ)，對中藥單體中的潛在靶標(biāo)、有效活性成分、藥代動力學(xué)以及相關(guān)疾病數(shù)據(jù)進(jìn)行有效整合構(gòu)建而成，為系統(tǒng)的研究中藥單體成分的作用機(jī)理、闡明其相關(guān)靶標(biāo)以及發(fā)現(xiàn)有效活性物質(zhì)提供了可靠的基礎(chǔ)公共平臺；而DrugBank數(shù)據(jù)平臺是以臨床試驗(yàn)藥物相關(guān)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，為研究者提供了全面而豐富的藥物靶標(biāo)信息和相關(guān)藥物數(shù)據(jù)。OMIM、GeneCards以及PharmGkb 數(shù)據(jù)平臺都是以文獻(xiàn)為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建，各數(shù)據(jù)庫優(yōu)勢互補(bǔ)。R 語言軟件進(jìn)行Venn 圖繪制；Uniport 數(shù)據(jù)平臺與Perl 語言軟件進(jìn)行藥物靶點(diǎn)ID的轉(zhuǎn)換；Cytoscape 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖構(gòu)建；STRING網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)平臺進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建；利用Cytoscape軟件中CytoNCA 插件進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)核心篩選；R 語言軟件進(jìn)行疾病藥物相關(guān)基因symbol的ID 轉(zhuǎn)換并做GO和KEGG 分析；PubChem 與PDB 數(shù)據(jù)平臺下載蛋白與受體并用PyMol和AutoDockTools軟件進(jìn)行分子對接。

2 方法

2.1 杜仲腰痛丸對LDH 慢性下肢痛模型大鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 藥物配比

實(shí)驗(yàn)大鼠的給藥劑量以藥理試驗(yàn)中，人與動物的體表面積等效劑量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行換算，將杜仲腰痛丸（規(guī)格：40 g/瓶，生藥：0.2 g/粒）使用水溶配制為含生藥濃度：0.05 g·mL-1的藥液。相關(guān)模型制備完畢后，將杜仲腰痛丸藥液以0.26 g·kg-1為標(biāo)準(zhǔn)對治療組大鼠進(jìn)行灌胃。

2.1.2 動物分組

以隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：正常組（無任何手術(shù)處理，正常飼養(yǎng)）、模型組及治療組，每組24只。

2.1.3 造模

動物模型參照Shamji 等[9]采用自體髓核移植法建立腰椎間盤突出癥慢性下肢痛模型大鼠，模型大鼠建立之后7天內(nèi)以2次/日為間隔對其腹部進(jìn)行順時(shí)針按摩（每只10 min），以防止麻醉后發(fā)生腸粘連，有效減輕術(shù)后腹脹以及輔助排便，同時(shí)進(jìn)行疼痛行為學(xué)（運(yùn)動行為異常，有垂足跛行現(xiàn)象）觀察確保造模成功。

2.1.4 干預(yù)方式

對造模成功后的大鼠進(jìn)行分組干預(yù)，其中將杜仲腰痛丸藥液以0.26 g·kg-1為標(biāo)準(zhǔn)對治療組大鼠進(jìn)行灌胃（2 次/日）；模型組與正常組則以同等劑量的生理鹽水進(jìn)行灌胃。

2.1.5 檢測指標(biāo)

（1）機(jī)械痛閾值檢測

將大鼠置于半透明玻璃電子VonFrey 測痛儀中，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)15 min，對大鼠足底進(jìn)行刺激，觀察是否能夠引起大鼠舔足以及縮足的相關(guān)陽性反應(yīng)，若出現(xiàn)則記錄該讀數(shù)數(shù)值，且該數(shù)值則為機(jī)械縮足反射閾值（MWT），閾值記錄分為造模前0 天、造模后2 天、7 天、14 天、藥物干預(yù)0 天、藥物干預(yù)2 天、7 天、14 天、21 天、28 天共9 個(gè)時(shí)間點(diǎn)。以5 min 為間隔標(biāo)準(zhǔn)對單只大鼠在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行5 次檢測并記錄相應(yīng)MWT，同時(shí)去除單只檢測值中的最高和最低MWT，取平均值為最終取值。

（2）熱痛閾值檢測

實(shí)驗(yàn)開始前熱板痛覺測試儀設(shè)定為恒定溫度，置大鼠于半透明熱板痛覺測試儀玻璃箱中，開始前適應(yīng)15-30 min，記錄大鼠開始出現(xiàn)抬足、舔足、逃避的陽性反應(yīng)時(shí)間為熱縮足反射潛伏期閾值（TWL），閾值記錄分為造模前0 天、造模后2 天、7 天、14 天、藥物干預(yù)0天、藥物干預(yù)2天、7天、14天、21天、28天共9個(gè)時(shí)間點(diǎn)。為避免大鼠熱損傷，單次檢測時(shí)間不超過30 s。以5 min 為間隔標(biāo)準(zhǔn)對單只大鼠在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行5 次檢測并記錄相應(yīng)TWL，同時(shí)去除單只檢測值中的最高和最低TWL，取平均值為最終取值。

2.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，使用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理計(jì)數(shù)資料，秩和檢驗(yàn)或Ridit分析處理等級資料，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.2.1 杜仲腰痛丸有效成分及靶標(biāo)獲取

使用TCMSP 數(shù)據(jù)平臺下載獲得杜仲腰痛丸中杜仲、牛膝、狗脊、酒萸肉、槲寄生、川芎、當(dāng)歸、細(xì)辛、紅花、赤芍、乳香、沒藥等17 種中藥單體的有效活性成分，設(shè)定口服生物利用度OB 值≥30%及類藥性DL 值≥0.18 為篩選標(biāo)準(zhǔn)下載藥物相關(guān)靶標(biāo)和有效成分；使用Uniprot 數(shù)據(jù)平臺并設(shè)定物種選擇為HUMAN、基因選擇為Reviewed 已證實(shí)一項(xiàng)，下載相關(guān)藥物靶標(biāo)基因以及基因symbol相關(guān)注釋文件。

2.2.2 獲取LDH相關(guān)疾病靶標(biāo)

以“Lumbar Disc Herniation”為檢索詞使用DrugBank、GeneCards、PharmGkb 及OMIM 數(shù)據(jù)平臺下載疾病相關(guān)基因，使用R 語言軟件對下載的疾病相關(guān)基因進(jìn)行去重取并集并合并成Venn 圖。再運(yùn)行R 語言軟件將下載的相關(guān)中藥靶標(biāo)與疾病基因進(jìn)行共有靶標(biāo)篩選處理并制成Venn圖。

2.2.3 構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過Perl語言軟件建立藥物成分基因與靶標(biāo)關(guān)系以及疾病節(jié)點(diǎn)屬性的相關(guān)文件，使用Cytoscape 軟件運(yùn)行該節(jié)點(diǎn)文件繪制成藥物、成分及疾病相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖；利用Cytoscape 軟件中“Degree 值”計(jì)算功能獲得該網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖中藥物有效成分的相應(yīng)Degree 值，其中“Degree 值”越大表明該節(jié)點(diǎn)成分的治療作用越突出。

2.2.4 繪制PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

將相關(guān)交集靶標(biāo)導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù)平臺，設(shè)置物種為“Homo sapiens”選項(xiàng)，以0.9 為最低互動參數(shù)，刪除無連接鍵的游離節(jié)點(diǎn)，下載獲得TSV 文件格式的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。使用Cytoscape 軟件運(yùn)行該TSV 文件并利用CytoNCA 插件進(jìn)行靶標(biāo)蛋白的篩選處理，以基因所在各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)均大于中位值為標(biāo)準(zhǔn)使用R語言軟件進(jìn)行2 次篩選獲得PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的核心靶標(biāo)。

2.2.5 GO與KEGG分析

使用R 語言軟件對LDH 與杜仲腰痛丸中相關(guān)交集靶標(biāo)文件進(jìn)行處理，并將其中相關(guān)基因Symbol 轉(zhuǎn)換為基因ID，再次使用R 語言軟件運(yùn)行轉(zhuǎn)換后的文件，以Pvalue 值=0.05、Q value 值=0.05、Pvalue Cutoff 值=1、Q value Cutoff 值=1 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，使用R 語言軟件中的Bioconductor 工具包運(yùn)行篩選后的文件得到GO和KEGG相關(guān)分析結(jié)果、柱狀圖以及氣泡圖。

2.2.6 Vina分子對接

使用PubChem 數(shù)據(jù)平臺檢索篩選后的PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶標(biāo)，獲取相應(yīng)靶標(biāo)的SDF 文件；使用Unipor 數(shù)據(jù)平臺獲取核心靶標(biāo)的對應(yīng)ID，通過PDB 數(shù)據(jù)平臺檢索該靶標(biāo)ID 下載對應(yīng)PDB 文件；使用AutoDockTools 軟件處理SDF 和PDB 文件轉(zhuǎn)換為PDBQT 格式文件。最后使用PyMol軟件運(yùn)行PDBQT文件完成分子對接。

3 結(jié)果

3.1 杜仲腰痛丸干預(yù)機(jī)械痛閾值比較

造模前3 組MWT 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；組內(nèi)比較，造模后2天、7天及藥物干預(yù)后0天、2天時(shí)，模型組與治療組MWT較造模前顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)藥物干預(yù)后2天、7天、14天、21天、28天時(shí)，治療組MWT較前一時(shí)間點(diǎn)減小（其中模型組在藥物干預(yù)后14 天及21 天時(shí)，MWT 較前一時(shí)間點(diǎn)減?。?，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組間比較，在藥物干預(yù)后2天、7天、14天、21天、28 天時(shí)，治療組與模型組MWT 較正常組恢復(fù)快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組間比較，在藥物干預(yù)后2 天、7 天、14 天、21 天、28 天時(shí)，治療組MWT 較正常組、模型組恢復(fù)快，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明杜仲腰痛丸能夠有效緩解LDH 慢性下肢痛大鼠模型的疼痛癥狀，且在大致藥用劑量下，治療效果會隨著時(shí)間的增加變得越加顯著。（見表3、圖1）

圖1 機(jī)械痛閾值比較結(jié)果分析

表3 機(jī)械痛閾值比較結(jié)果分析

3.2 杜仲腰痛丸干預(yù)熱痛閾值比較

各組造模前TWL 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；組內(nèi)比較，造模后2 天、7天及藥物干預(yù)后0 天、2 天時(shí)，模型組與治療組TWL 較造模前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藥物干預(yù)后2天、7天、14天、21天時(shí)，治療組TWL較前一時(shí)間點(diǎn)提高（其中模型組在藥物干預(yù)后28 天時(shí)，TWL 較前一時(shí)間點(diǎn)提高），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組間比較，在藥物干預(yù)后2 天、7 天、14 天、21 天、28 天時(shí)，治療組與模型組TWL 較正常組恢復(fù)快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組間比較，在藥物干預(yù)后2 天、7 天、14 天、21 天、28 天時(shí)，治療組TWL 較正常組、模型組恢復(fù)快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明杜仲腰痛丸能夠有效緩解LDH 慢性下肢痛大鼠模型的疼痛癥狀，且在大致藥用劑量下，治療效果會隨著時(shí)間的增加變得越加顯著（見表4、圖2）。

圖2 熱痛閾值比較結(jié)果分析

表4 熱痛閾值比較結(jié)果分析

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

3.3.1 杜仲腰痛丸有效成分與靶標(biāo)

檢索TCMSP 數(shù)據(jù)平臺，設(shè)定口服生物利用度OB值≥30%及類藥性DL 值≥0.18 為篩選標(biāo)準(zhǔn)下載獲得藥物有效成分335 種，其中赤芍29 種，牛膝4 種，川芎7種，當(dāng)歸2種，杜仲28種，甘草92種，紅花22種，槲寄生7種，沒藥45種，木香6種，乳香8種，三七8種，山茱萸20種，細(xì)辛8種，延胡索49種，狗脊與土鱉蟲未檢索到。檢索Uniprot 數(shù)據(jù)平臺去重后剩余靶標(biāo)共計(jì)321個(gè)。

3.3.2 篩選LDH相關(guān)疾病靶標(biāo)

通過檢索DrugBank 數(shù)據(jù)平臺檢索去重下載得到LDH 相關(guān)疾病靶標(biāo)10 個(gè)，GeneCards 數(shù)據(jù)平臺檢索去重下載得到164個(gè)，OMIM數(shù)據(jù)平臺檢索去重下載得到10個(gè)、PharmGkb 數(shù)據(jù)平臺檢索去重下載得到1552個(gè)；將各數(shù)據(jù)平臺靶標(biāo)相關(guān)數(shù)據(jù)整合去重后共得到1734個(gè)LDH 相關(guān)疾病靶標(biāo)。運(yùn)行R 語言軟件對杜仲腰痛丸治療LDH 的相關(guān)靶標(biāo)與疾病相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行處理后取交集得到相關(guān)性靶標(biāo)90個(gè)（如圖3、圖4）。

圖3 不同數(shù)據(jù)庫LDH疾病靶標(biāo)并集Venn圖

圖4 杜仲腰痛丸靶標(biāo)與LDH靶標(biāo)交集Venn圖

3.3.3 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)果

運(yùn)行Cytoscape 軟件繪制成藥物、成分及疾病相關(guān)靶標(biāo)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖（圖5），該圖中節(jié)點(diǎn)數(shù)為117 個(gè)，產(chǎn)生相互作用關(guān)系的邊共有414 條，其中杜仲腰痛丸各單味藥化合物成分共計(jì)有199 種作用于90 個(gè)相關(guān)靶標(biāo)發(fā)揮治療LDH的效果。

圖5 杜仲腰痛丸調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

3.3.4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果

將90個(gè)交集靶標(biāo)導(dǎo)入至STRING數(shù)據(jù)平臺得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)TSV 文件，使用Cytoscape 軟件運(yùn)行該文件得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖6），圖中基因節(jié)點(diǎn)數(shù)為73，相互作用關(guān)系線條數(shù)為350；利用軟件自帶CytoNCA 插件進(jìn)行靶標(biāo)蛋白的篩選處理，以基因所在各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)均大于中位值為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行2 次篩選得到9 個(gè)PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心靶標(biāo)（圖7）；構(gòu)建該9個(gè)靶標(biāo)與對應(yīng)有效化合物成分的網(wǎng)絡(luò)可視化圖（圖8），計(jì)算有效化合物成分Degree 值篩選得到前5 的成分分別為quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、licochalcone a（甘草查爾酮a）、kaempferol（山奈酚）以及naringenin（柚皮素）。

圖6 藥物-疾病交集靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶標(biāo)

圖8 成分-靶標(biāo)篩選網(wǎng)絡(luò)圖

3.3.5 GO及KEGG富集分析結(jié)果

將LDH 與杜仲腰痛丸的90 個(gè)交集靶標(biāo)導(dǎo)入至R語言軟件，設(shè)定過濾條件為矯正后P值，利用軟件自帶Bioconductor 程序包處理后得到GO 及KEGG 分析結(jié)果。結(jié)果顯示共有2302 條GO 相關(guān)條目，其中2118 條涉及生物過程（BP）條目、53 條涉及分子組成（CC）條目、131條涉及分子功能（MF）條目；KEGG 結(jié)果顯示共得到157 條相關(guān)信號通路，依據(jù)P 值的大小篩選獲得GO分析中前10的條目以及KEGG分析中前20的信號通路繪制相關(guān)柱狀圖和氣泡圖（如圖9、圖10）。

圖9 GO富集分析網(wǎng)絡(luò)圖（排名前10）

圖10 KEGG富集分析網(wǎng)絡(luò)圖（排名前30）

BP 分析結(jié)果顯示杜仲腰痛丸治療LDH 涉及的主要生物過程有細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激與氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對細(xì)菌源性分子的反應(yīng)以及對脂多糖的反應(yīng)等；CC分析結(jié)果顯示交集靶標(biāo)主要參與的分子組成有膜區(qū)、膜微區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、與膜筏等；MF 分析結(jié)果顯示交集靶標(biāo)主要涉及產(chǎn)生影響的分子功能有細(xì)胞因子受體結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以及磷酸酶結(jié)合等。KEGG 分析結(jié)果顯示杜仲腰痛丸能夠有效緩解LDH患者的臨床癥狀主要是通過AGERAGE、IL-17、P13-Akt 以及TNF 等信號通路來實(shí)現(xiàn)的。

3.3.6 分子對接結(jié)果分析

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖Degree 值大小篩選得到位于前3的靶標(biāo)基因JUN、RELA、MAPK1 以及位于前3 的成分槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）和甘草查爾酮A（licochalcone a）完成分子對接。一般認(rèn)為分子對接中結(jié)合能數(shù)值越小，其分子間具有越高的結(jié)合穩(wěn)定性，當(dāng)結(jié)合能數(shù)值（Binding energy）＜-4.25 kcal·mol-1時(shí)表明分子受體與相關(guān)配體間具有一定的結(jié)合活性；＜-5.0 kcal·mol-1時(shí)表明分子間具有較好的結(jié)合活性；＜-7.0 kcal·mol-1時(shí)則表明該受體與相關(guān)配體間具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[10]。根據(jù)表5 分子對接結(jié)果顯示槲皮素、木犀草素、甘草查爾酮A 三種關(guān)鍵藥物成分與相關(guān)核心靶標(biāo)MAPK1、JUN、RELA 之間的結(jié)合能值均＜-7.0 kcal·mol-1，說明兩者間具有強(qiáng)烈的分子結(jié)合活性。使用Pymol 軟件進(jìn)行分子對接可視化分析（圖11）。結(jié)果顯示槲皮素與MAPK1 主要通過氫鍵位點(diǎn)附近的MET-108、LEU-103、ASP-167、GLU-71四個(gè)氨基酸鍵產(chǎn)生結(jié)合；木犀草素與JUN 主要通過氫鍵位點(diǎn)附近的DA-37、DG-38、DT-5、DA-6、DG-8 五個(gè)氨基酸鍵產(chǎn)生結(jié)合；甘草查爾酮A 與RELA 主要通過氫鍵位點(diǎn)附近的ASN-283、THR-284、GLN-226、TYR-297四個(gè)氨基酸鍵產(chǎn)生結(jié)合。

圖11 分子對接模式圖

表5 杜仲腰痛丸關(guān)鍵成分與對應(yīng)核心靶標(biāo)的分子對接

4 討論

中醫(yī)將LDH 歸類于“腰痛病”或“痹證”的范疇，并認(rèn)為其主要病機(jī)為肝腎虧虛、濕熱積聚、筋脈受損而致使血脈瘀阻，不通則痛[11]。其中90% LDH 患者可通過積極適當(dāng)?shù)姆鞘中g(shù)治療獲得較滿意的療效[12]。西醫(yī)臨床保守治療多選擇非甾體類與激素類相聯(lián)合的方式，該方式治療過程中可發(fā)生消化道相關(guān)不良反應(yīng)，因此探尋可代替的安全且有效的臨床保守治療手段尤為必要[13]。杜仲腰痛丸為甘肅省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有較好的活血化瘀、補(bǔ)腎壯腰、通路止痛之功。經(jīng)臨床多年使用證實(shí)該藥單獨(dú)使用或聯(lián)合其他療法對LDH 腰腿痛具有較好的臨床療效，且未出現(xiàn)消化道等不適反應(yīng)，是一種安全有效的中醫(yī)藥保守治療選擇[14-15]。且本研究通過觀察杜仲腰痛丸干預(yù)LDH 慢性下肢痛大鼠模型后發(fā)現(xiàn)，杜仲腰痛丸能夠有效地緩解LDH 慢性下肢痛大鼠模型的疼痛行為、改善其機(jī)械刺激與熱刺激痛覺過敏現(xiàn)象，且隨著藥物干預(yù)時(shí)間的延長，其治療效果也越顯著。

通過此次杜仲腰痛丸治療LDH 的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析，結(jié)果顯示槲皮素、木犀草素及甘草查爾酮A為其主要有效成分。槲皮素類屬于多酚類化合物，在抗炎及抑制病毒活性等方面有著廣泛的作用[16]。Muto等[17]發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過對模型大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中纖維酸性蛋白有效抑制來減輕其神經(jīng)性疼痛，這可能是杜仲腰痛丸治療LDH 時(shí)能夠發(fā)揮較好止痛效果的作用機(jī)制原因之一。木犀草素是黃酮類的主要成分，廣泛分布于植物中，在鎮(zhèn)痛效果中起著關(guān)鍵作用。Zhou 等[18]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可通過調(diào)節(jié)脊髓背角中的p38 MAPK活性來阻礙神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和NLRP3炎癥小體的活化，從而抑制神經(jīng)炎癥，緩解小鼠疼痛。甘草查爾酮A 是一種從甘草根中提取的生物活性查爾酮成分，其在藥物治療中具有顯著的抗炎、抗氧化、抗菌和抗腫瘤特性。研究發(fā)現(xiàn)，甘草查耳酮A 可抑制多種促炎介質(zhì)（IL-1β、PGE 2、IL-6、NO、LTB）[19]。此外，Phan 等[20]研究發(fā)現(xiàn)甘草查耳酮A 可以顯著抑制T 淋巴細(xì)胞中IL-2 的釋放和增殖，T 淋巴細(xì)胞是調(diào)節(jié)炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞。此結(jié)果表明甘草查耳酮A 是一種且有效的抗炎劑，于臨床具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛效果。以上研究表明通過篩選獲得的杜仲腰痛丸關(guān)鍵成分槲皮素、木犀草素及甘草查耳酮A 能夠有效減緩機(jī)體促炎介質(zhì)的釋放，抑制炎癥的發(fā)生，從而發(fā)揮治療LDH 的作用。

本研究通過PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)打分過濾后得到MAPK1、STAT3、MAPK14 等9 個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)。An 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，MAPK1 可以有效抑制NEAT1 的表達(dá)并通過miR-211-5p 軸減輕了脊髓損傷的炎癥反應(yīng)。RELA是NF-κB 家族成員中一種炎癥反應(yīng)基因的有效轉(zhuǎn)錄激活因子，可通過暴露于病原體和炎性細(xì)胞因子來激活許多炎癥和免疫反應(yīng)基因的表達(dá)[22]。STAT3 是細(xì)胞對細(xì)胞因子和生長因子的反應(yīng)所必需的7種轉(zhuǎn)錄因子之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞存活和免疫反應(yīng)。其中STAT1 和STAT3 通路的相互調(diào)節(jié)可引導(dǎo)細(xì)胞從存活轉(zhuǎn)向凋亡或從炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)向抗炎反應(yīng)[23]。MAPK14在緩解應(yīng)激信號自噬對炎癥的抑制控制方面發(fā)揮著重要作用，其可通過對ULK1 激酶活性的有效抑制，破壞其與ATG13 復(fù)合物之間的相互作用，緩解了自噬對炎癥的抑制，實(shí)現(xiàn)機(jī)體全面的免疫反應(yīng)[24]。FOS 是AP-1 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，Makino 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS的上調(diào)表達(dá)可能是促進(jìn)椎間盤退變發(fā)展的重要因素之一，且使用AP-1 選擇性抑制劑T-5224 證明抑制c-Fos/AP-1 可防止椎間盤退變和相關(guān)疼痛，從而起到治療LDH的作用。

GO分析及KEGG分析同樣與抗氧化、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。依據(jù)GO 分析結(jié)果，杜仲腰痛丸中關(guān)鍵化合物成分主要是通過對細(xì)胞化學(xué)應(yīng)激與氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對細(xì)菌源性分子的反應(yīng)以及對脂多糖的反應(yīng)等生物過程的調(diào)控參與膜區(qū)、膜微區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、與膜筏等分子組成，從而對細(xì)胞脫氧核糖核酸-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合及蛋白磷酸酶結(jié)合等分子功能產(chǎn)生影響來發(fā)揮治療LDH 的功效。而KEGG 分析結(jié)果顯示杜仲腰痛丸治療LDH可能與P13-Akt、TNF、IL-17 以及AGE-RAGE 等信號通路有關(guān)。其中P13K-Akt 信號通路涉及許多生物過程，包括細(xì)胞存活、凋亡和炎癥。研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥環(huán)境中，P13K-Akt 通路的激活可以有效地 保護(hù)髓核細(xì)胞免于凋亡并促進(jìn)其增殖。此外，AKT 的自噬可以促進(jìn)髓核細(xì)胞抗氧化能力的增強(qiáng)[26-27]。TNF-α 是一種多效性促炎細(xì)胞因子，屬于TNF 配體超家族。Wang等[28]在豬模型椎間盤中注入TNF-α 后，出現(xiàn)退行性特征，包括纖維環(huán)破裂、髓核基質(zhì)降解、細(xì)胞聚集和血管化，表明對TNF 通路的有效抑制可以減緩椎間盤的退變及炎癥反應(yīng)，從而緩解機(jī)體疼痛癥狀。IL-17 是一種促炎細(xì)胞因子，在介導(dǎo)自身免疫中起關(guān)鍵作用。Wang等[29]研究發(fā)現(xiàn)靶向IL-17A 的單克隆抗體可改善放射學(xué)和非放射學(xué)中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎患者的體征和癥狀，以及脊柱和骶髂關(guān)節(jié)的MRI 炎癥，且在對非甾體抗炎藥療效差的患者以及用腫瘤壞死因子抑制劑治療失敗的患者中作用也很明顯。AGEs 是異質(zhì)分子，來源于葡萄糖或其他糖類對包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸在內(nèi)的大分子的翻譯后非酶修飾，并通過與其受體RAGEs結(jié)合，可以促進(jìn)氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生[30]。研究發(fā)現(xiàn)，AGE 積累與軟骨內(nèi)骨化有關(guān)，并通過AGE-RAGE通路誘導(dǎo)椎間盤細(xì)胞肥大和成骨分化[31]。且Lin 等[32]發(fā)現(xiàn)，AGEs 的積累與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，并會導(dǎo)致髓核細(xì)胞氧化微環(huán)境的改變，進(jìn)而引起椎間盤退變。因此，通過AGE-RAGE 通路靶向清除AGEs 可以有效調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來延緩椎間盤的退變。

本研究所篩選獲得的核心成分與關(guān)鍵靶標(biāo)全部成功對接，且槲皮素、木犀草素及甘草查爾酮a三種關(guān)鍵成分與核心靶標(biāo)MAPK1、JUN、RELA 之間的結(jié)合能值均小于-7.0 kcal·mol-1，表明其分子間的結(jié)合活性較為強(qiáng)烈。

本研究通過運(yùn)用生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[33-34]構(gòu)建及分子對接的前沿技術(shù)聯(lián)合動物實(shí)驗(yàn)，從微觀層面展示了杜仲腰痛丸能夠有效緩解LDH患者臨床癥狀主要是通過槲皮素、木犀草素、甘草查爾酮a、山奈酚、柚皮素等有效成分作用于JUN、MAPK1、RELA、MYC、STAT3、ESR1、MAPK14、FOS、TP53等多種基因靶標(biāo)，從而影響PI3K-Akt信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路及AGE-RAGE等信號通路而發(fā)揮功效，此研究為后續(xù)臨床應(yīng)用杜仲腰痛丸治療LDH常見疼痛癥狀提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，證實(shí)了中藥可以從多靶點(diǎn)、多成分、多通路對疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后進(jìn)行干預(yù)。但是本文僅從網(wǎng)絡(luò)計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測出發(fā)，未考慮到藥物間成分含量在進(jìn)入人體內(nèi)代謝后各成分間的藥理學(xué)變化，所以更深入的分子機(jī)制仍然需要進(jìn)一步驗(yàn)證。