電針內(nèi)關(guān)、公孫穴對功能性消化不良大鼠海馬GluR1、GluR2及內(nèi)臟高敏性的影響＊

覃思敏，謝云方，邢博文，展立芬，伍萍香，江 鈺，石海斌，劉未艾＊＊

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 長沙 410005；2. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 ?？?570216；3. 張家界市中醫(yī)院 張家界 427000）

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是指以胃十二指腸區(qū)域反復(fù)出現(xiàn)餐后飽脹早飽、上腹痛等上腹部不適癥狀，常規(guī)檢查中無任何可能解釋癥狀的器質(zhì)性改變的疾病，是最普遍的功能性胃腸病（Functional gastrointestinal disorders，F(xiàn)GIDs）之一。內(nèi)臟高敏性是指內(nèi)臟痛閾值降低引起內(nèi)臟疼痛不適感，是FD 最主要病理特征之一，與海馬區(qū)功能異常密切相關(guān)[1-2]。目前FD暫無公認(rèn)且療效確切的治療方案，臨床上常運用莫沙比利等五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）受體激動劑藥物聯(lián)合抗抑郁藥物治療FD，雖有療效，但存在藥物副作用大的問題[3]。待以尋求安全有效的治療方案。

針灸作為一種經(jīng)典的中醫(yī)傳統(tǒng)療法，具有療效確切[4]、無毒副作用等獨特優(yōu)越性，已被廣泛應(yīng)用于FD的防治。FD屬中醫(yī)痞滿范疇，課題組前期對古籍中痞滿的選穴規(guī)律進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)關(guān)、公孫穴是治療痞滿的首要配伍穴位[5]。現(xiàn)代研究也證實，針刺內(nèi)關(guān)、公孫穴能有效改善FD 臨床癥狀[6]，但其作用途徑仍有待闡明。故本研究通過觀察電針內(nèi)關(guān)、公孫穴對FD大鼠海馬GluR1、GluR2 及內(nèi)臟敏感性的影響，探討其可能的作用機制及腧穴的特異性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

采用湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供健康SPF級SD 大鼠50 只（SYXK（湘）2019-0009），體質(zhì)量200-250 g，雌雄各半，月齡3-4 月。飼養(yǎng)溫度維持在20-25℃，濕度維持在50%-70%。所有動物方案均通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)動物倫理委員會（LLBH-202103040007）。

1.2 主要儀器與試劑

DYCZ-40K 轉(zhuǎn)印電泳儀（中國北京六一生物科技有限公司），ChemiScope 6000化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司），JY 96-IIN超聲細(xì)胞粉碎（寧波新芝生物科技有限公司），離心機（TGL-1 湖南星科科學(xué)儀器有限公司），Nikon E100 生物顯微鏡（尼康映像儀器銷售有限公司），華佗牌SDZ-V 型電針儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），12Fr 一次性使用無菌導(dǎo)尿管（江蘇省華星醫(yī)療器械實業(yè)有限公司），一次性使用針灸針（0.16×7 mm）（吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，CWBOI CW0014S），GLUR1 抗體（Bioss，BS-10042R），GLUR2 抗體（Bioss，BS-1798R），GAPDH（安諾倫生物科技有限公司，YM3029，稀釋比：20000∶1），HRP goat anti-mouse IgG SA00001-1（萊恩生物科技有限公司，稀釋比：5000∶1），HRP goat anti-rabbit IgG SA00001-2（萊恩生物科技有限公司，稀釋比:6000∶1），PBS 緩沖液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI-9062），DAB 顯色液（武漢賽維爾生物科技有限公司，G1211），蘇木素（武漢賽維爾生物科技有限公司，G1004），蘇木素返藍(lán)液（武漢賽維爾生物科技有限公司，G1340），檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（武漢賽維爾生物科技有限公司，G1202），4%多聚甲醛溶液（廣州賽國生物科技有限公司，BL539A），二甲苯透明(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，10023418)，水合氯醛（上海麥克林生化科技有限公司），黛力新（丹麥靈北有限公司），莫沙必利片（成都康弘有限公司）。

1.3 模型制備方法

參照王煜姣等[7]方法造模，于每天8∶00 置于束縛盒中限制3 h，同時夾尾30 min、搖晃5 min，14∶00置于盛有溫水（21±1）℃的大塑料桶中游泳10 min。隔日禁食，隔日足量給食。模型組、雙穴組（內(nèi)關(guān)、公孫穴）、非經(jīng)非穴組連續(xù)3 周進(jìn)行造模。造模結(jié)束后，大鼠表現(xiàn)為靠邊扎堆、打斗減少、攻擊性減少、易受驚嚇、毛發(fā)干枯不順、糞便變軟，佐以曠場試驗驗證造模成功。

1.4 干預(yù)方法

除空白組正常飼養(yǎng)外，其余各組分別按不同干預(yù)方法處理21 天。模型組、雙穴組、非經(jīng)非穴組同時進(jìn)行捆綁束縛30 min，按大鼠體質(zhì)量灌服等量生理鹽水。雙穴組參照[8]全國中醫(yī)藥行業(yè)高等教育十二五規(guī)劃教材《實驗針灸學(xué)》及華興邦的大鼠穴位圖譜；進(jìn)行定位選穴“內(nèi)關(guān)穴”“公孫穴”；用乙醇擦拭穴位，一次性使用針灸針行針刺治療，針刺深度為3-10 mm 之間，采用平補平瀉手法，捻轉(zhuǎn)角度為180°，頻率為每分鐘120次，持續(xù)捻轉(zhuǎn)0.5-2 min不等；行針結(jié)束后，選同側(cè)的內(nèi)關(guān)和公孫穴分別連接電針儀導(dǎo)線的正負(fù)極，采用疏密波（20/100 Hz）進(jìn)行刺激，刺激強度以局部皮膚肌肉輕微顫動為準(zhǔn)，電針刺激時間為每次30 min，每日1 次。非經(jīng)非穴組穴位定位[9]于在脅下髂嵴上20-25 mm、后正中線旁開20 mm 處，針刺手法及電針方法同雙穴組，選同側(cè)非經(jīng)非穴與大鼠尾部分別連接電針儀導(dǎo)線的正負(fù)極。西藥組按大鼠體質(zhì)量1 mL/100 g的灌服莫沙比利與黛力新溶液，兩藥間隔半小時。大鼠給藥量參照正常成人（70 kg）的臨床用量，按照實驗動物與人劑量換算公式計算（大鼠的劑量＝6.3×mg/kg），換算得出大鼠灌胃等效劑量。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

曠場實驗行為學(xué)評價：實驗用自制立方形紙質(zhì)曠場箱，長×寬×高為100 cm×100 cm×40 cm。內(nèi)側(cè)壁及底面為黑色，用白線劃分為20 cm×20 cm 面積相等的25 塊。實驗開始后每周在四周由全封閉的遮光簾隔離開并杜絕參照物且安靜的環(huán)境條件下進(jìn)行。實驗前先置大鼠于測試曠場箱內(nèi)適應(yīng)2 min，操作者握住大鼠尾根部1/3 處，輕輕將大鼠放入曠場箱的正中格內(nèi)，觀察3 min 內(nèi)大鼠活動情況。取出大鼠后，用毛巾蘸清水及低濃度乙醇徹底擦拭箱底，并等待其揮發(fā)擴散，避免留有氣味而干擾下一只大鼠的觀察結(jié)果。觀察各組大鼠造模前后的行為變化并進(jìn)行比較。觀察如下指標(biāo)：①總穿格數(shù)：三爪以上跨入相臨格的次數(shù)；②站立次數(shù)：兩前肢向上抬起離開箱底面或攀伏在側(cè)壁上，以后腿支撐使身體豎立的次數(shù)。③修飾次數(shù)：兩前肢理毛、抓癢、洗臉、舔足的次數(shù)。

大鼠結(jié)直腸擴張容量閾值測定：大鼠在實驗前24 h禁食不禁水，在清醒狀態(tài)下進(jìn)行，采用12 Fr一次性使用無菌導(dǎo)尿管作為結(jié)腸擴張球囊，將其外側(cè)軟閥開口端接“Y”形三通管，分別與血壓計水銀柱及氣囊口相連。將球囊插入大鼠直腸5 cm后，緩慢向球囊注氣，記錄大鼠拱背抬高離開瓶底或明顯收縮變平時水銀柱刻度，該值為痛閾值[10]，擴張壓力范圍0-80 mmHg。連續(xù)2-3次測定，取平均值。

海馬組織HE 染色：腹腔注射麻醉（麻醉藥物及劑量：10%水合氯醛以4 mL·kg-1注射）。每組隨機取5只進(jìn)行心臟灌注固定，斷頭剝離腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，包埋，沿海馬吻合位置以4 μm 行冠狀切片；取海馬組織切片，脫蠟，水化，染色后脫水封片，于顯微鏡下觀察海馬組織形態(tài)。

海馬GluR1、GluR2 蛋白含量免疫組化測定：取海馬組織切片，置于修復(fù)緩沖液修復(fù)，冷卻后放入PBS緩沖液中晃動，采用血清封閉后洗滌，加入一抗，4℃孵育過夜，再次洗滌后加入二抗，室溫孵育50 min，置入新鮮配制的DAB 顯色液中，采用顯微鏡進(jìn)行顯色觀察，染色后取出，流水沖洗，復(fù)染3 min 左右返藍(lán)，沖洗完畢后脫水晾干封片；顯微鏡鏡檢，圖像采集，用Image J 軟件對GluR1、GluR2 的免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析，計算并統(tǒng)計平均光度值，進(jìn)行分析。

海馬GluR1、GluR2 蛋白含量Western blot 測定：5 只大鼠麻醉后直接斷頭取腦剝離海馬組織，沖洗后放入液氮保存。取海馬組織，按照BCA 蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度。制膠后取100 μL蛋白上清，加入25 μL 上樣緩沖液混勻，沸水煮5 min，速冷后開始電泳，將切膠、NC 膜及轉(zhuǎn)膜緩沖液至于轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，后用1×pBST 配制5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2.5 h，用1×pBST 稀釋將一抗按照比例稀釋后與膜一同放入4℃冰箱過夜，次日室溫放置30 min 進(jìn)行孵育。分別用1×PBST 稀釋HRP 標(biāo)記的二抗，將稀釋后的二抗與膜共同室溫孵育1.5 h；顯色曝光并拍照記錄，Image J 對圖像進(jìn)行定量分析，以GAPDH 作為內(nèi)參對蛋白條帶進(jìn)行對比分析。

1.6 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 28.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，全部計量資料用樣本含量、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（即n，）表示，所有數(shù)據(jù)都進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗。符合正態(tài)性，多組間比較采用單因素方差分析與LSD 檢驗，不符合方差齊性采用Welch 檢驗及Tamhane’s T2 檢驗，同組前后對比采用配對t檢驗；不符合正態(tài)性，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗與Bonferroni 檢驗，同組前后對比采用配對Wilcoxon 檢驗，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評分比較

2.1.1 一般行為學(xué)評價

造模前各組大鼠反應(yīng)靈敏，性情溫順，精神良好，皮毛光澤，皮膚黏膜紅潤，糞便質(zhì)軟成形，干稀適中。造模后各組大鼠均出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，精神欠佳，食量欠佳，體質(zhì)量增長緩慢，皮毛枯澤，皮膚黏膜色澤變淡，大便不規(guī)則，便質(zhì)時干時稀。提示造模成功。

2.1.2 曠場實驗結(jié)果

由表1 可知：造模前各組水平、垂直及修飾運動（總穿格數(shù)、站立次數(shù)、修飾次數(shù)）無明顯差異（P＞0.05），提示大鼠在陌生環(huán)境下具有較強的主動探索行為及反應(yīng)。造模后，各組水平、垂直及修飾運動明顯減少（P＜0.01），組間比較無差異（P＞0.05），提示大鼠運動、探索行為及攝食愉悅感均下降，對環(huán)境好奇度降低，呈倦怠抑郁樣行為，提示造模成功。詳見表1。

表1 各組大鼠曠場實驗比較（n=10）

表1 各組大鼠曠場實驗比較（n=10）

注：與造模前對比，▲▲P＜0.01。

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2.2 各組大鼠內(nèi)臟痛閾值

與空白組相比，模型組大鼠內(nèi)臟痛閾值明顯降低（P＜0.01），易出現(xiàn)腹背肌肉收縮、腹部上抬，提示大鼠內(nèi)臟敏感性增強、痛閾降低；與模型組對比，西藥組、雙穴組FD大鼠內(nèi)臟痛閾值均有明顯的提高（P＜0.01），非經(jīng)非穴組痛閾值有所升高，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），提示電針內(nèi)關(guān)、公孫治療有效；與非經(jīng)非穴組對比，雙穴組內(nèi)臟痛閾值增高（P＜0.01），提示內(nèi)關(guān)、公孫穴在改善FD 內(nèi)臟敏感性方面可能存在腧穴特異性；與西藥組對比，兩組無顯著性差異（P＞0.05），提示內(nèi)關(guān)、公孫穴與西藥療效相當(dāng)。見表2。

表2 各組大鼠痛閾值變化比較（n=10，，mmHg）

表2 各組大鼠痛閾值變化比較（n=10，，mmHg）

注：與空白組對比，▲▲P＜0.01；與模型組對比，★★P＜0.01；與非經(jīng)非穴組對比，△△P＜0.01。

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2.3 各組海馬區(qū)HE染色

空白組海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常；與空白組相比，模型組海馬可見個別神經(jīng)元細(xì)胞變性，固縮，細(xì)胞間隙變大，胞體增大，空泡樣性狀明顯；與模型組相比，雙穴組及西藥組海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清晰，趨于完整，細(xì)胞間隙變小，未見固化萎縮的神經(jīng)元及空泡樣性狀改變；與非經(jīng)非穴組相比，雙穴組海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)更為清晰，細(xì)胞間隙較?。辉斠妶D1。

圖1 不同組別大鼠海馬神經(jīng)元的影響（×400）

2.4 各組海馬免疫組化檢測

與空白組對比，模型組大鼠海馬GluR1 蛋白含量升高、GluR2 蛋白含量下降（P＜0.01）；與模型組對比，雙穴組、西藥組可下調(diào)海馬GluR1、上調(diào)GluR2 蛋白含量（P＜0.01），非經(jīng)非穴組無差異（P＞0.05），提示電針內(nèi)關(guān)、公孫治療有效；與非經(jīng)非穴組對比，雙穴組顯著下調(diào)海馬GluR1、上調(diào)GluR2 蛋白含量（P＜0.01），提示內(nèi)關(guān)、公孫穴在改善FD 海馬GluR1、GluR2 蛋白含量方面可能存在腧穴特異性；與西藥組對比，兩組無顯著性差異（P＞0.05），提示二者對海馬GluR1、GluR2 蛋白含量調(diào)節(jié)相當(dāng)。見圖2、3。

圖2 不同組別大鼠GluR1、GluR2蛋白表達(dá)的影響（×400）

圖3 不同組別大鼠海馬GluR1、GluR2OD值（n=5，）

2.5 各組海馬Western blot檢測

與空白組對比，模型組大鼠海馬GluR1 蛋白含量升高、GluR2 蛋白含量下降（P＜0.01）；與模型組對比，雙穴組、西藥組可下調(diào)海馬GluR1、上調(diào)GluR2 蛋白含量（P＜0.01，P＜0.05），非經(jīng)非穴組無差異（P＞0.05）；與非經(jīng)非穴組對比，雙穴組顯著下調(diào)海馬GluR1、上調(diào)GluR2 蛋白含量（P＜0.01，P＜0.05）；與西藥組對比，兩組無顯著性差異（P＞0.05）。本結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，提示電針內(nèi)關(guān)、公孫穴可下調(diào)GluR1、上調(diào)GluR2蛋白含量，可能存在腧穴特異性。見圖4、5。

圖4 不同組別大鼠GluR1、GluR2蛋白免疫印跡圖

圖5 不同組別大鼠GluR1、GluR2蛋白表達(dá)的影響（n=5，）

3 討論

功能性消化不良（FD）屬中醫(yī)“痞滿”“胃痞”范疇，雖以胃脘部疼痛不適為主要表現(xiàn)，但其發(fā)病與情志密切相關(guān)，當(dāng)考慮精神心理治療[11]。古人云“善醫(yī)者，必先醫(yī)其心，而后醫(yī)其身”，從近代醫(yī)者臨床運用中發(fā)現(xiàn)，近代醫(yī)家重視心主神志這一功能對脾胃的影響，在調(diào)治脾胃病時常加以調(diào)養(yǎng)心神之法，運用中藥、針灸等治療脾胃病，屢試不爽、療效頗佳[12-14]。中醫(yī)針灸療法因其獨特的理論體系能從整體而有效地運用于FD 的防治，達(dá)到身心同治的目的。內(nèi)關(guān)穴聯(lián)絡(luò)心包，宣上導(dǎo)下；公孫為脾經(jīng)之絡(luò)穴，聯(lián)絡(luò)脾、胃二經(jīng)，調(diào)理脾胃，疏通腸道；《針灸大成》[15]記載“肚疼須是公孫妙，內(nèi)關(guān)相應(yīng)必然瘳”，二穴屬八脈交會穴，兩穴配伍使用，能達(dá)調(diào)養(yǎng)心神、健運脾胃之效。二穴配伍治療FD能有效緩解癥狀，改善患者情緒，但目前作用機制不明[9]。

內(nèi)臟高敏是FD 患者內(nèi)臟疼痛的主要原因，內(nèi)臟高敏反應(yīng)分為外周敏化和中樞敏化兩種，外周敏化指的是對初級傷害感器的增敏，而中樞增敏指的是損傷期間或損傷后中樞突觸傳遞的持續(xù)變化。以往對內(nèi)臟高敏反應(yīng)機制的研究多集中在外周敏化和脊髓背角突觸可塑性變化方面。海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，參與疼痛與認(rèn)知情緒的調(diào)控，由于疼痛的反復(fù)發(fā)作，誘發(fā)持續(xù)的異位沖動，導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)和神經(jīng)活動的功能變化，并最終導(dǎo)致產(chǎn)生“傷害性疼痛記憶”[16]，這可能是患者精神心理的異常與腹痛癥狀反復(fù)的原因所在。海馬區(qū)長期突觸可塑性主要表現(xiàn)形式長時程增強（Long termpotentiation，LTP）和長期抑制作用（Long-term depression，LTD)，需依靠海馬神經(jīng)元突觸后氨基羥甲基惡唑丙酸受體（a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionate receptor，AMPAR）胞吞和胞吐實現(xiàn)[17]。AMPAR 是由GluR1-4 組成的異源四聚體離子通道，以GluR1 和GluR2 蛋白起決定作用[18]。作為廣泛存在于大腦中的谷氨酸受體，介導(dǎo)大多數(shù)快速興奮性突觸傳遞，是處理海馬突觸后信號的輸入的主要場所，其快速激發(fā)神經(jīng)傳遞、增強突觸強度的作用，是調(diào)節(jié)突觸LTP 傳輸和表達(dá)關(guān)鍵[19-21]。海馬給予AMPARs抑制劑可顯著減緩FGIDs大鼠內(nèi)臟痛敏行為[22]。GluR1 是大鼠表達(dá)長時程增強LTP 的關(guān)鍵亞基，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟痛刺激導(dǎo)致AMPAR 的GluR1 的高表達(dá)可被非選擇性AMPAR 拮抗劑所抑制，并可有效緩解內(nèi)臟疼痛[23]。GluR2是AMPAR 控制Ca2+通透的關(guān)鍵亞基，正常情況對Ca2+不通透。有實驗研究表明，慢性束縛應(yīng)激導(dǎo)致海馬CA1 區(qū)GluR2 mRNA 表達(dá)下降，形成Ca2+通透的AMPAR，鈣超載，繼發(fā)引起“細(xì)胞死亡程序”的轉(zhuǎn)錄活化，同步增強興奮性氨基酸的毒性作用，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元退行性變[24]。

本實驗結(jié)果提示：①電針內(nèi)關(guān)、公孫穴治療能有效升高FD 大鼠內(nèi)臟痛閾值，降低海馬GluR1 蛋白含量、增加GluR2 蛋白表達(dá)，改善海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這可能是電針內(nèi)關(guān)、公孫穴治療FD 作用機制之一。②電針內(nèi)關(guān)、公孫療效與西藥莫沙比利聯(lián)合黛力新相當(dāng)，與臨床研究大致相同[11]。電針作為FD 最常見的非藥物治療手段，能有效避免長期服用西藥帶來的毒副作用，值得臨床進(jìn)一步推廣運用。③相較電針非經(jīng)非穴，電針內(nèi)關(guān)、公孫穴療效更優(yōu)?！夺樉拇蟪伞酚涊d道“肚疼須是公孫妙，內(nèi)關(guān)相應(yīng)必然瘳”，內(nèi)關(guān)、公孫屬于八脈交會穴，與奇經(jīng)八脈脈氣相通，內(nèi)關(guān)為手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴，聯(lián)絡(luò)心包、三焦二經(jīng)，穴所通的陰維脈，為手足三陰經(jīng)之綱維；公孫為脾經(jīng)之經(jīng)穴，聯(lián)絡(luò)脾、胃二經(jīng)，穴所通的沖脈，為十二經(jīng)脈之海；二穴聯(lián)用，經(jīng)脈臟腑相關(guān)，多經(jīng)司控多臟，具有暢情志，調(diào)氣機，安脾胃之功。近代研究也證實，針刺胃經(jīng)穴或心包經(jīng)穴均有調(diào)整胃機能的功能[25]。這可能是二穴對FD 治療存在腧穴特異性而非經(jīng)非穴效果欠佳的原因所在。

綜上所述，電針內(nèi)關(guān)、公孫穴可降低FD 大鼠內(nèi)臟高敏性，其作用機制可能與下調(diào)海馬區(qū)GluR1 蛋白含量、上調(diào)GluR2蛋白含量，改善海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)；二穴對FD治療可能存在腧穴特異性。