基于神經(jīng)示蹤技術(shù)對胃病常用腧穴與胃關(guān)聯(lián)機制研究的進展及存在問題＊

張麗麗，于 成，陳碧瑋，楊凱偉，張海燕，陳少宗＊＊

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 濟南 250355；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 濟南 250014；3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)針灸研究院 濟南 250355）

針灸治療胃部疾病具有多種取穴組方的方案，常用腧穴主要分布于腹部、背部、下肢部，取穴組方以腹部腧穴與下肢腧穴聯(lián)合應(yīng)用為主，或者背部腧穴與下肢腧穴聯(lián)用，Meta 分析表明，這些不同的取穴組方方案對胃部疾病都有積極的治療作用[1-5]，為了研究不同腧穴與胃之間的聯(lián)系機制，眾多研究運用神經(jīng)示蹤技術(shù)對這一問題進行了探索，獲得許多有價值的結(jié)果[6-11]，本文對這一方向的研究進行了系統(tǒng)回顧，并就存在的問題進行了討論。

1 針灸臨床治療胃部疾病取穴規(guī)律研究

參考杜元灝等[12]統(tǒng)計的針灸疾病譜，選取適宜針灸的胃部相關(guān)疾病，主要包括功能性消化不良、胃下垂、慢性胃炎以及胃脘痛（中醫(yī)病名）。檢索中國知網(wǎng)、維普網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺，收集關(guān)于針灸治療胃部常見病取穴規(guī)律相關(guān)文獻，檢索時間為2012年1 月1 日-2022 年5 月1 日。檢索詞為主題詞+自由詞方式進行組合，中文檢索詞包括：“針刺”“針灸”“電針”“體針”“毫針”“功能性消化不良”“胃下垂”“慢性胃炎”“胃脘痛”“胃痛”“取穴”“選穴”“取穴規(guī)律”“選穴規(guī)律”，最終納入23 篇文獻。 利用SPSS Modeler18.0、Microsoft Excel2016 等數(shù)據(jù)挖掘工具二次統(tǒng)計總結(jié)胃部常見疾病的取穴規(guī)律（見表1、表2、圖1）。

圖1 胃部疾病常用腧穴關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 針灸治療胃部相關(guān)疾病常用腧穴情況

表2 胃部疾病常用腧穴二次統(tǒng)計情況（使用頻次＞30%）

研究發(fā)現(xiàn)，雖然針灸治療同一種胃部疾病的取穴組方也有多個方案，涉及眾多腧穴，但針灸治療這5種常見胃部疾病的腧穴具有高度重合性，高度重合腧穴有足三里、中脘、內(nèi)關(guān)、胃俞、脾俞5 個腧穴，其分布主要涉及四個部位：腹部（中脘）、背部（胃俞、脾俞）、上肢部（內(nèi)關(guān)）、下肢部（足三里）。

2 利用神經(jīng)示蹤技術(shù)對治療胃部疾病常用腧穴與胃的聯(lián)系機制研究

胃部常見疾病的發(fā)病機制與胃腸動力紊亂、胃排空障礙、自主神經(jīng)失衡、胃黏膜炎癥性病變等因素密切相關(guān)[35-38]，胃受外源性交感神經(jīng)[39-40]、迷走神經(jīng)以及內(nèi)源性腸神經(jīng)系統(tǒng)的支配[41]，針刺對胃腸功能調(diào)節(jié)的作用機制依賴于神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫免疫網(wǎng)絡(luò)[42]，神經(jīng)系統(tǒng)在胃腸運動中起關(guān)鍵作用[43]，針刺對胃腸運動功能的調(diào)節(jié)取決于3 個水平：局部腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）、自主神經(jīng)系統(tǒng)（ANS）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）[44]。本文主要對利用神經(jīng)示蹤技術(shù)研究胃部疾病常用腧穴與胃在神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)機制進行綜述。檢索PubMed、中國知網(wǎng)、維普網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺，搜集關(guān)于胃部疾病常用腧穴的神經(jīng)示蹤研究，檢索時限均從建庫至2022年5月1日。此外，追溯納入文獻的參考文獻，以補充獲取相關(guān)文獻。檢索采取主題詞和自由詞相結(jié)合的方式。中文檢索詞包括：經(jīng)脈、腧穴、穴位、穴區(qū)、穴、神經(jīng)示蹤、神經(jīng)示蹤劑、示蹤劑、示蹤技術(shù)、示蹤。英文檢索詞包括：Meridians, acupuncture point,acupoint, acupuncture area, acupuncture, acupuncture therapy, electro-acupuncture, needling, filiform needle,nerve tracer, tracer, neuronal tracers, neural tracing technique, neuro-anatomical tracing, tracer technique 等。中文數(shù)據(jù)庫檢索策略：（'經(jīng)脈' OR '腧穴' OR '穴位'OR '穴區(qū)' OR '穴'） AND（'神經(jīng)示蹤' OR '神經(jīng)示蹤劑' OR '示蹤劑' OR '示蹤技術(shù)' OR '示蹤'），Pubmed 檢索策略見圖2，檢索結(jié)果見圖3。

圖2 文獻檢索策略（以Pubmed為例）

圖3 文獻篩選流程圖

2.1 常用腧穴與胃的關(guān)聯(lián)機制研究現(xiàn)狀

神經(jīng)示蹤技術(shù)主要依賴于軸突運輸，根據(jù)示蹤劑的不同示蹤特點，可將其分為多個種類，根據(jù)其軸突運輸?shù)姆较颍煞譃轫樞?、逆行兩個類別；根據(jù)其軸突運輸是否跨越突觸，可分為跨突觸、非跨突觸兩類。逆行神經(jīng)示蹤主要適用于觀察神經(jīng)纖維的起源細胞到特定的靶區(qū)，順行神經(jīng)示蹤劑適用于觀察單個或多組細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的投射[45]，跨突觸神經(jīng)示蹤劑則可以有效地實現(xiàn)多級神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的標(biāo)記[46]，這些技術(shù)在穴位-靶器官的關(guān)聯(lián)機制研究中發(fā)揮了重要作用，陶之理[11,47]較早地將神經(jīng)示蹤技術(shù)運用到針灸學(xué)科，利用辣根過氧化物酶（HRP）研究腧穴和內(nèi)臟間的神經(jīng)支配聯(lián)系[48]。對于研究腧穴-靶器官的關(guān)聯(lián)機制主要采用逆行神經(jīng)示蹤法，2000 年以前主要使用的神經(jīng)示蹤劑為HRP[10,49-52]或CB-HRP[53-57]，2000 年以后神經(jīng)示蹤劑種類逐漸增多，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）、雙苯甲亞胺（Bisbenzimide，Bb）、霍亂毒素亞單位B 結(jié)合熒光素等熒光類示蹤劑逐漸運用[7-8,58-62]，實現(xiàn)了腧穴-內(nèi)臟神經(jīng)環(huán)路的多重標(biāo)記，同時病毒類跨突觸示蹤劑的發(fā)展也為針刺效應(yīng)的腦環(huán)路研究提供了新方法[9,63-64]。

神經(jīng)系統(tǒng)決定的腧穴與靶器官的關(guān)聯(lián)機制涉及3 個層次：第1 個層次的機制是腧穴-靶器官關(guān)聯(lián)的外周（脊神經(jīng)節(jié)）機制，包括長軸突反射、短軸突反射2種形式；第2個層次的機制是腧穴-靶器官關(guān)聯(lián)的脊髓機制，包括內(nèi)臟軀體共同匯聚機制、脊髓反射（傳入-傳出反射）、背根反射（DRR）3 種形式[65（]見圖4），外周途徑的完整性是針刺對靶器官發(fā)揮效應(yīng)的必要條件[66-67]；第3 個層次的機制是腧穴-靶器官關(guān)聯(lián)的高位中樞機制。背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal root ganglion，DRG）是腧穴與內(nèi)臟感覺信號傳入的基本環(huán)節(jié)[68]，脊髓是大部分軀體和內(nèi)臟感覺信息整合的中繼站[69]，兩者是軀體與內(nèi)臟信號整合的重要部位。目前對常用腧穴與胃之間關(guān)聯(lián)機制的研究主要為外周DRG 和脊髓水平[6-9,60]，對腦干及腦干以上水平的聯(lián)系機制研究相對較少。

圖4 腧穴-靶器官相關(guān)節(jié)段性聯(lián)系脊髓機制、外周機制示意圖[65]

2.2 軀干部常用腧穴與胃的關(guān)聯(lián)機制研究

胃部疾病在軀干部常選用的腧穴為中脘（腹部）、脾俞（背部）、胃俞（背部），相關(guān)神經(jīng)示蹤研究結(jié)果見表3、表6。

表3 腹部常用腧穴/腧穴-胃的神經(jīng)示蹤情況

表4 胃部疾病四肢部常用腧穴/腧穴-胃在外周神經(jīng)節(jié)及脊髓的神經(jīng)示蹤情況

表5 胃部疾病四肢部常用腧穴/腧穴-胃在脊髓及腦的神經(jīng)示蹤情況

表6 胃部疾病常用腧穴在背根神經(jīng)節(jié)的陽性標(biāo)記情況

現(xiàn)代針灸學(xué)認為[65]腧穴的作用包括節(jié)段性效應(yīng)和超神經(jīng)節(jié)段的整體性效應(yīng)，或稱為特異性和廣譜性效應(yīng)[70]，與靶器官處于相同神經(jīng)節(jié)段的腧穴其作用是節(jié)段性和整體性效應(yīng)的疊加，而與靶器官距離較遠的腧穴往往只有整體性效應(yīng)[65,70]，刺激與靶器官相同節(jié)段的腧穴可以特異性地激活相應(yīng)節(jié)段的交感和迷走神經(jīng)[71]。胃感覺傳入主要為T6-T10神經(jīng)節(jié)段[72]，研究顯示中脘、胃俞、脾俞與胃在胸段DRG 有重疊的神經(jīng)節(jié)段[6,8,73]，在DRG 還存在軀體-內(nèi)臟雙標(biāo)記神經(jīng)元，因此DRG 是腧穴-胃信號傳入、整合的重要部位，信號經(jīng)DRG 進入脊髓背角進一步匯聚、整合通過軀體-內(nèi)臟反射、背根反射對胃產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，同時在椎旁神經(jīng)節(jié)也觀察到脾俞的逆行標(biāo)記，因此軀干部腧穴可能通過感覺及交感途徑對胃產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，Li 等[74]的研究也證實在保證交感神經(jīng)完整的前提下針刺健康大鼠氣海、梁門、胃俞等腹部腧穴會抑制胃動力，切斷交感神經(jīng)效應(yīng)消失，在切斷迷走神經(jīng)或脊髓化大鼠中該效應(yīng)幾乎不受影響。雖然軀干部的腧穴對胃有抑制作用，但并不是單方向抑制，其效應(yīng)與機體病理狀態(tài)密切相關(guān)，有研究證實中脘、胃俞的針刺信號可在DVC匯聚整合后經(jīng)迷走神經(jīng)促進胃的運動[75-76]，當(dāng)胃動力低下時針刺軀干部腧穴能促進胃動力，但其促進作用較肢體遠端腧穴弱[77]，因此軀干部腧穴對胃除節(jié)段性效應(yīng)外，其針刺信號可經(jīng)脊髓上行至高位中樞進一步發(fā)揮對胃的“泛調(diào)節(jié)”作用，包括神經(jīng)傳出、神經(jīng)內(nèi)分泌傳出、神經(jīng)免疫傳出[67]，但其機制較為復(fù)雜仍需進一步研究。

中脘、胃俞、脾俞雖然與胃均有重合的神經(jīng)節(jié)段，但中脘、胃俞神經(jīng)節(jié)段支配集中于T10-T11，而脾俞稍偏于上部與胃的神經(jīng)支配更為密切，Xu 等[78]的研究表明處于相似神經(jīng)節(jié)段支配的腧穴其感覺及運動神經(jīng)元是分離的，因此其針刺作用的神經(jīng)通路可能并不相同，同時相同節(jié)段的腧穴配伍使用是否會產(chǎn)生協(xié)同作用也需要進一步研究。

2.3 四肢部常用腧穴與胃的關(guān)聯(lián)機制研究

針灸治療胃部疾病四肢部的腧穴主要為足三里（下肢）、內(nèi)關(guān)（上肢），相關(guān)神經(jīng)示蹤研究結(jié)果見表4-6。

對于足三里穴有3項研究使用的是逆行非跨突觸神經(jīng)示蹤劑，一項研究使用跨突觸神經(jīng)示蹤劑。利用非跨突觸神經(jīng)示蹤劑的研究結(jié)果存在一定差異，衣華強等[7]采用PI、Bb進行示蹤，結(jié)果顯示足三里感覺神經(jīng)元主要位于DRG T6-L2節(jié)段，Cui等[79]和Wang 等[80]采用霍亂毒素亞單位B 結(jié)合Alexa Fluor 熒光素的示蹤劑，Cui 等[79]研究顯示DRG L3-L6節(jié)段存在陽性神經(jīng)元，Wang 等[80]的研究結(jié)果為L4-L6，陶之理[47]采用HRP 的研究結(jié)果為T6-T12、L1-L7、S1-S3，出現(xiàn)上述差異性主要考慮與神經(jīng)示蹤劑、實驗操作等因素不同有關(guān)： PI 和Bb 屬于熒光染料，常用于逆行示蹤且不跨突觸，可以實現(xiàn)熒光雙標(biāo)記[81]，缺點是分子量小、易于擴散，同時存在過路纖維攝入問題；CTB 來源于霍亂毒素能夠與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 的戊多糖鏈結(jié)合從而粘附于細胞表面[82]，特異性地標(biāo)記神經(jīng)細胞[83]，主要用于逆行非跨突觸的神經(jīng)示蹤[84]，性質(zhì)相對穩(wěn)定[85]；HRP 是從辣根中提取出來的一組同功酶的混合物，可以被神經(jīng)終末或受損的軸索攝取然后逆行標(biāo)記神經(jīng)元，同時具備一定的跨突觸特性[86]，缺點是參與細胞代謝，在溶酶體時間過久容易造成降解，還存在“再攝取”現(xiàn)象[87]，因此上述神經(jīng)示蹤劑性質(zhì)不同，故攝取和運輸?shù)馁|(zhì)量、在組織中擴散的趨勢及效率、產(chǎn)生局部壞死的能力也不同[45]，除示蹤劑不同外注射部位深度及方向、兩種示蹤劑注射的間隔時間、取材時間、動物物種等也存在差異（表4），諸多因素可能造成結(jié)果間存在差異，綜合上述研究結(jié)果足三里穴與胃可能在胸腰段DRG 存在密切聯(lián)系，有待進一步研究。Lee 等[9]采用跨突觸神經(jīng)示蹤劑探究足三里與胃的神經(jīng)環(huán)路，結(jié)果顯示兩種信號在延髓、腦橋、中腦、間腦、端腦各級中樞均有匯聚，其中孤束核（NTS）、迷走神經(jīng)背核（DMV）、最后區(qū)（AP）、中縫大核（NRM）、臂旁核（PBN）、藍斑（LC）、中央杏仁核（CeA）等核團有大量陽性標(biāo)記（見表4），由NTS、DMV、AP 構(gòu)成的迷走背核復(fù)合體（DVC）是調(diào)節(jié)胃運動和分泌的重要中樞，大量研究證實NRM、PBN、LC、CeA 等核團均與DVC有密切的纖維聯(lián)系，同時以DVC為基本中樞發(fā)揮對胃的調(diào)控作用[88]。Li 等[74]的研究也證實足三里穴能夠促使健康大鼠胃動力增加，但迷走神經(jīng)或脊髓被切斷后該效應(yīng)消失，因此足三里的針刺信號與胃的傳入信號在脊髓水平匯聚整合后可上達高位中樞的眾多核團，最終主要經(jīng)DVC-迷走神經(jīng)對胃功能進行調(diào)節(jié)，所以DVC 是針刺調(diào)節(jié)胃腸功能的重要靶點，未來可以利用光遺傳、化學(xué)遺傳等技術(shù)以DVC 為核心開展針刺調(diào)節(jié)胃腸功能的中樞整合機制研究[88]。

內(nèi)關(guān)穴神經(jīng)支配主要為C5-T1節(jié)段[89]，與胃處于不同的神經(jīng)節(jié)段，對此有研究[90-91]表明內(nèi)關(guān)主要通過迷走神經(jīng)對胃發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，Jang等[92]研究證實內(nèi)關(guān)的針刺信號可以上達孤束核，脊髓與孤束核之間存在相互聯(lián)系的神經(jīng)環(huán)路[93-96]，針刺內(nèi)關(guān)穴后NTS 出現(xiàn)放電，切斷迷走神經(jīng)則沒有放電，因此內(nèi)關(guān)的針刺信號也經(jīng)迷走神經(jīng)對胃產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，與足三里的神經(jīng)通路有一定相似性，但二者中樞DMV的投射部位存在一定差異[97]，其具體差異機制有待深入研究。

3 小結(jié)

利用神經(jīng)示蹤技術(shù)對腧穴-胃之間神經(jīng)解剖學(xué)聯(lián)系的研究為針刺治療胃部疾病提供了有力的形態(tài)學(xué)依據(jù)，不同部位的腧穴與胃在神經(jīng)解剖學(xué)中的聯(lián)系并不相同，軀干部的常用腧穴基本與胃處于相同的神經(jīng)節(jié)段，能夠通過激活交感神經(jīng)發(fā)揮對胃腸的調(diào)節(jié)作用，四肢部腧穴其針刺信號主要經(jīng)脊髓上達高位中樞經(jīng)迷走神經(jīng)發(fā)揮對胃的調(diào)控作用，同時所有常用腧穴均能通過高位中樞發(fā)揮對胃功能調(diào)節(jié)的整體性效應(yīng)，但針刺信號與胃的傳入信號在高位中樞的整合機制較為復(fù)雜需進一步研究。

目前在腧穴-胃神經(jīng)解剖學(xué)聯(lián)系的研究中，因?qū)嶒瀯游?、神?jīng)示蹤劑、手術(shù)操作流程、取材時間等相關(guān)因素的不同導(dǎo)致結(jié)果存在差異，降低研究之間的可比性。因此未來的研究應(yīng)盡量選取擴散穩(wěn)定、標(biāo)記效率高、抗淬滅的神經(jīng)示蹤劑，統(tǒng)一實驗動物、操作流程等一系列要素；其次，支配腧穴的神經(jīng)節(jié)段分布高峰不同，因此與胃關(guān)聯(lián)的密切程度也不同，該差異是否直接影響針刺對胃部調(diào)節(jié)效應(yīng)的大??？除常用腧穴之外是否還有其他的腧穴也與胃有密切的神經(jīng)解剖學(xué)聯(lián)系？左右側(cè)腧穴的作用機制是否存在差異？不同腧穴間配伍是協(xié)同還是拮抗作用？上述問題均有待進一步研究；第三，目前多數(shù)研究以外周或中樞脊髓水平為主，對腦干及以上水平的研究較少。隨著新興的實驗技術(shù)的發(fā)展，跨突觸神經(jīng)示蹤劑的不斷成熟，未來可以綜合光遺傳、化學(xué)遺傳、鈣成像、膜片鉗、Cre-LoxP 技術(shù)研究針刺作用的神經(jīng)生物學(xué)機制，為針灸臨床選穴組方提供科學(xué)指導(dǎo)。