酵母微囊作為口服藥物遞送載體的研究進(jìn)展Δ

劉瑛琪 ，李靜如 ，孟 繁 ，邢昊楠 ，鄭愛萍 （1.華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北 唐山 06310；.軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850）

藥物遞送載體的主要作用是提高藥物穩(wěn)定性、增加溶解度、增強(qiáng)靶向性等，對(duì)于口服制劑的遞送載體還需具備克服胃液破壞和腸道消化酶降解等能力。載體材料依據(jù)來源不同可分為天然材料及化學(xué)合成材料兩大類，其中天然來源的載體材料（如外泌體[1]、白蛋白[2]、鐵蛋白[3]、細(xì)菌外膜囊泡[4]等）在生物安全性及耐受性方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，備受學(xué)者關(guān)注。作為天然微生物，酵母具有生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)周期短、尺寸（2～4 μm）較均一、水中分散性好、使用成本低等優(yōu)點(diǎn)，加之其具有真核細(xì)胞的典型結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜均有一定的強(qiáng)度和通透性，是理想的微囊材料[5]。釀酒酵母是一種常見的酵母，廣泛用于釀酒、面包等食品發(fā)酵領(lǐng)域，被美國(guó)FDA 認(rèn)證為一種安全的微生物；同時(shí)，釀酒酵母能有效刺激機(jī)體的非特異性免疫，常被作為免疫佐劑[6—7]。已有研究證實(shí)，以來源于釀酒酵母的酵母微囊為遞送載體的藥物在抗菌、抗病毒、抗腫瘤等需要免疫激活的疾病治療中具有較好的應(yīng)用前景[6]。本文綜述了酵母微囊的組成、制備方法及其在疫苗、抗腫瘤藥物等遞送領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，以期為酵母微囊的進(jìn)一步研發(fā)和應(yīng)用提供思路。

1 酵母微囊的主要組成

釀酒酵母的細(xì)胞壁占細(xì)胞干重的20%～30%，由β-葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)、脂類和少量幾丁質(zhì)組成[8]。其中，β-葡聚糖由β-1，3-葡聚糖和β-1，6-葡聚糖組成，兩者質(zhì)量比約為85∶15。β-1，3-葡聚糖是葡聚糖網(wǎng)絡(luò)剛性結(jié)構(gòu)的主要成分，也是酵母微囊的免疫活性來源[5，9]。β-1，3-葡聚糖的骨架結(jié)構(gòu)有利于卷曲以形成螺旋結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可被受體特異性識(shí)別，從而引起特殊的生物學(xué)效應(yīng)，如該成分可被髓樣淋巴細(xì)胞（如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞）上高度表達(dá)的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）特異性識(shí)別，從而激活固有免疫[10—11]。同時(shí)，細(xì)胞壁外層的甘露聚糖及其連接的糖蛋白可通過糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidyl inositol，GPI）錨定在β-1，6-葡聚糖分支上（圖1）[12]。層層多糖和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成了厚度為110～200 nm的交聯(lián)多孔狀酵母細(xì)胞壁[13]，起到了支撐細(xì)胞和促進(jìn)物質(zhì)交換的作用。酵母微囊主要來源于酵母細(xì)胞壁成分中的β-葡聚糖，其高度交聯(lián)的葡聚糖網(wǎng)絡(luò)具有多孔剛性結(jié)構(gòu)，其篩孔可用于裝載小分子藥物或納米顆粒[14—15]。

圖1 酵母微囊的主要組成及制備過程

2 酵母微囊的制備與載藥原理

將酵母細(xì)胞進(jìn)行酸堿處理溶解細(xì)胞膜后，使用有機(jī)溶劑洗滌除去其內(nèi)容物和細(xì)胞壁表面除β-葡聚糖以外的其他多糖，即可得表面粗糙多孔、核心中空的亞微米橢球狀酵母微囊（圖1）。其中，酸堿溶劑和有機(jī)溶劑處理的時(shí)長(zhǎng)對(duì)微囊的物理化學(xué)性質(zhì)（如粒徑、表面Zeta 電位）有一定影響，進(jìn)而可影響藥物包封率和載藥量[13]。此外，載藥溫度也會(huì)影響藥物裝載效率，研究發(fā)現(xiàn)，酵母微囊所載藥物的有效擴(kuò)散系數(shù)與溫度成線性關(guān)系，較低的溫度可有助于減少小分子藥物的泄漏[16]。

酵母微囊內(nèi)部中空、表面多孔且?guī)ж?fù)電荷，多數(shù)藥物均可被封裝在酵母微囊內(nèi)部或附著于酵母微囊表面（圖2），進(jìn)而被機(jī)體吸收。對(duì)于藥物的裝載有如下幾種途徑：（1）帶正電荷的藥物分子可通過靜電相互作用被吸附到帶負(fù)電荷的酵母微囊內(nèi)部。例如，Hou 等[17]利用靜電作用將鼠結(jié)腸癌細(xì)胞裂解物和聚精氨酸包裹在酵母微囊內(nèi)部，成功實(shí)現(xiàn)了抗原的口服遞送。（2）帶負(fù)電荷的藥物可先通過非共價(jià)相互作用（例如氫鍵或疏水作用等）與含亞胺或酰胺的載體材料組裝成帶正電荷的藥物顆粒，隨后再通過靜電相互作用將上述藥物顆粒封裝到帶有負(fù)電荷的酵母微囊中。例如，Aouadi等[18]根據(jù)靜電吸附原理合成干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）和聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）復(fù)合物，再將酵母微囊包裹在外，從而實(shí)現(xiàn)了siRNA 的口服遞送。（3）不帶電的藥物則可通過被動(dòng)擴(kuò)散和疏水作用裝載到酵母微囊內(nèi)部。例如，Salari等[19]利用疏水作用將小檗堿裝載到酵母微囊中；Mirza 等[20]利用被動(dòng)擴(kuò)散作用將百里酚包封到酵母微囊中，藥物包封率可達(dá)95%；Sun等[21]首先利用堿性溶液將甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）擴(kuò)散至酵母微囊內(nèi)，然后再降低溶液pH（酸性條件下，MTX 的溶解度將降低）使MTX 沉淀在酵母微囊內(nèi)部，再用水凝膠固定，最終獲得了高載藥量的MTX 酵母微囊。（4）對(duì)于因自身性質(zhì)無法被裝載的部分藥物，可將其附著在衍生化酵母微囊的表面，并通過注射途徑來實(shí)現(xiàn)藥物的體內(nèi)遞送。例如，Soto等[22]通過還原胺化和點(diǎn)擊化學(xué)等步驟，使酵母微囊發(fā)生衍生化，進(jìn)而使有效載荷藥物或包含有效載荷藥物的納米顆粒（包括離子化合物、疏水化合物、蛋白質(zhì)分子等）通過共價(jià)和非共價(jià)作用附著在酵母微囊表面，利用酵母微囊的高靶向性將藥物遞送至免疫細(xì)胞內(nèi)，從而提高藥物的利用度。

圖2 酵母微囊的載藥原理

3 酵母微囊在胃腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收及靶向機(jī)制

多肽、蛋白質(zhì)和核酸類藥物/疫苗容易在胃酸性環(huán)境下降解，且胃腸道吸收較差，因此難以通過口服途徑給藥。研究證實(shí)，唾液及胃液無法消化β-葡聚糖，且酵母微囊在胃酸的低pH 環(huán)境中仍能保持穩(wěn)定，故將藥物包封在酵母微囊內(nèi)可保護(hù)藥物免受胃酸影響。Shi等[23]研究了載藥酵母微囊在胃酸中的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，裝載順鉑的酵母微囊在模擬胃酸環(huán)境下幾乎不釋放藥物，表明其穩(wěn)定性良好；Sabu等[24]以酵母微囊聯(lián)合海藻鹽為載體口服遞送胰島素，發(fā)現(xiàn)該載體可保護(hù)胰島素不被胃酸降解，并可將胰島素通過淋巴系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)襟w循環(huán)，進(jìn)而成功降低小鼠血糖水平。

微皺褶細(xì)胞（microfold cell，MC）作為腸道黏膜相關(guān)淋巴組織特化毛囊上皮細(xì)胞，具有運(yùn)輸微生物和可溶性大分子藥物的作用。酵母微囊經(jīng)過胃到達(dá)腸道后，微囊表面的β-葡聚糖可靶向腸道MC表面的C型植物凝集素樣受體dectin-1，從而協(xié)助MC特異性識(shí)別酵母微囊并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至派爾斑（Peyer’s patches，PP）。PP 作為抗原加工和免疫細(xì)胞成熟的場(chǎng)所，含有豐富的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞[25]。作為免疫佐劑的酵母微囊進(jìn)入PP 后可靶向至表面表達(dá)dectin-1[起到關(guān)鍵識(shí)別作用的dectin-1 由1 個(gè)胞外羧基末端C 型凝集素識(shí)別結(jié)構(gòu)域（carbohydrate recognition domain，CRD）、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)含免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）的細(xì)胞質(zhì)域組成，可通過CRD識(shí)別β-葡聚糖，從而識(shí)別酵母微囊]的樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，從而利用ITAM來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子、炎癥小體激活與抗原呈遞等胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[26—27]；同時(shí)，酵母微囊可刺激樹突細(xì)胞的成熟，上調(diào)細(xì)胞表面功能分子的表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-12、IL-23 等分泌，減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量并促進(jìn)抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生[28]。隨后，酵母微囊表面的β-葡聚糖結(jié)構(gòu)被消化為可溶性片段并分泌至胞外，通過補(bǔ)體受體3（complement receptor 3，CR3）被自然殺傷細(xì)胞和中性粒細(xì)胞識(shí)別，刺激自然殺傷細(xì)胞成熟并產(chǎn)生穿孔素和顆粒酶素[29]。進(jìn)入淋巴組織的藥物可通過淋巴管依次到達(dá)鎖骨下靜脈和肺動(dòng)脈，最終到達(dá)包含肝、脾、肺、腎的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（mononuclear phagocyte systems，MPS）[30]，進(jìn)而進(jìn)入體循環(huán)，最終蓄積在脾、淋巴結(jié)和骨髓[31]，從而提高藥物利用度?？梢?，酵母微囊可通過口服途徑將所載藥物遞送至腸道黏膜，并在腸道內(nèi)實(shí)現(xiàn)淋巴靶向、免疫激活，并在一定程度上發(fā)揮免疫佐劑的作用，在疫苗、免疫治療藥物遞送方面顯示出極佳的應(yīng)用前景。

4 酵母微囊在藥物遞送中的應(yīng)用

4.1 口服疫苗

腸道內(nèi)分布著約70%的免疫細(xì)胞，是體內(nèi)最大的免疫器官。相比于常規(guī)的注射類疫苗，口服疫苗有望通過刺激腸道內(nèi)豐富的免疫細(xì)胞，產(chǎn)生局部黏膜免疫反應(yīng)，從而防止病原體入侵腸道。但由于疫苗的有效抗原大多屬于蛋白質(zhì)，口服疫苗普遍存在抗原易被胃腸道消化酶降解、無法有效穿透腸黏液層到達(dá)淋巴細(xì)胞的問題。因此，口服疫苗需要合適的遞送載體以克服消化道環(huán)境的影響，保證抗原有效傳遞并被腸道的免疫細(xì)胞所識(shí)別、攝取。酵母微囊是理想的口服遞送載體，其能在胃液中保持穩(wěn)定，并可保護(hù)裝載的抗原不被胃蛋白酶降解，同時(shí)其微米級(jí)粒徑和親水表面也有助于穿透腸上皮屏障并靶向淋巴組織，從而引發(fā)有效的免疫反應(yīng)[32]。

受酵母微囊孔隙大小和親水性質(zhì)的限制，部分抗原難以被裝載到酵母微囊中，為解決該問題，有學(xué)者考慮將抗原連接到酵母微囊的表面，并選擇合適的載體予以保護(hù)。例如，Liu 等[33]選擇帶正電荷的層狀雙氫氧化物（layered double hydroxide，LDH）納米材料作為抗原保護(hù)劑和載體，通過靜電相互作用使其連接在帶負(fù)電荷的酵母微囊表面；給小鼠灌胃該制劑后發(fā)現(xiàn)，酵母微囊可幫助LDH 完整地到達(dá)腸道PP 內(nèi)，進(jìn)而被淋巴細(xì)胞攝取，LDH 可幫助抗原逃避溶酶體的降解并將其完整地釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)抗原的交叉呈遞，從而有效誘導(dǎo)1型/17型輔助性T細(xì)胞混合免疫應(yīng)答反應(yīng)的發(fā)生，顯著提高疫苗保護(hù)效果。為解決單純鋁佐劑不能誘導(dǎo)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答這一問題，Liu等[34]先將抗原吸附到高度帶電的氫氧化鋁或磷酸鋁凝膠上，再與酵母微囊共同孵育以制備新型疫苗；動(dòng)物研究結(jié)果顯示，酵母微囊可提高單純鋁佐劑的效力，并可成功激活小鼠1型輔助性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。Specht等[35—36]給小鼠灌胃封裝了隱球菌抗原蛋白的酵母微囊后，成功在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到高滴度的特異性抗體及明顯增多的抗原特異性CD4+T 淋巴細(xì)胞；細(xì)菌挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，酵母微囊組小鼠的存活率較空白組小鼠更高。有研究證實(shí)，酵母微囊遞送抗原可在相對(duì)較低的劑量下誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈且持久的免疫反應(yīng)，如Huang 等[37]初次給予小鼠裝載有卵清蛋白抗原的酵母微囊后，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了較為顯著的免疫反應(yīng)。以上實(shí)例證實(shí)，酵母微囊在疫苗領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

4.2 炎癥性疾病治療藥物

在抗炎方面，直接口服非甾體抗炎藥和類固醇等非靶向抗炎藥物可引發(fā)胃腸道出血和免疫抑制等副作用，而酵母微囊可克服這些缺點(diǎn)。Che等[38]將抗炎藥物吲哚美辛與PEI組裝成抗炎納米藥物顆粒并封裝在酵母微囊中，再將其分別灌胃給急性炎癥模型大鼠和正常大鼠，結(jié)果顯示，大鼠腫脹足中的抗炎藥物濃度較高，而正常足中的抗炎藥物濃度較低，表明酵母微囊具有靶向炎癥組織的能力。糖尿病作為一種慢性疾病，也被認(rèn)為是一種慢性炎癥，Sabu 等[24]將胰島素沉積到酵母微囊中，再在酵母微囊表面涂布一層藻酸鹽，以進(jìn)一步保護(hù)胰島素免受胃腸道環(huán)境的影響并延長(zhǎng)其在胃腸道的停留時(shí)間，結(jié)果顯示，該酵母微囊可將所載胰島素成功遞送至淋巴組織，再經(jīng)由淋巴循環(huán)運(yùn)輸至體循環(huán)。Zhang 等[39]先將無毒、可降解且?guī)д姾傻募{米管和微RNA365（microRNA365，miRNA365）組裝成陽(yáng)性納米顆粒，再將該納米顆粒裝載到酵母微囊中，可實(shí)現(xiàn)創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎miRNA 類藥物的口服遞送。姜黃素具有良好的抗炎效果，但其溶解度和穩(wěn)定性較差，口服生物利用度不高[40]。Young等[41]利用酵母微囊包載姜黃素并灌胃給結(jié)腸炎模型小鼠，結(jié)果顯示，小鼠體內(nèi)的促炎性細(xì)胞因子水平大大降低，表明姜黃素發(fā)揮了明顯的抗炎作用。此外有研究指出，腸道環(huán)境中的高膽汁鹽可有助于酵母微囊中姜黃素的釋放，因此酵母微囊在實(shí)現(xiàn)腸道局部遞送的同時(shí)，還具有一定的緩釋作用，可發(fā)揮更持久的抗炎活性[42]。用來治療炎癥性腸道疾病的免疫抑制劑MTX 同樣可被封裝于酵母微囊內(nèi)部，口服給藥后可通過靶向腸道巨噬細(xì)胞而發(fā)揮抗炎作用，從而減輕小鼠的結(jié)腸組織損傷[21]。上述研究表明，酵母微囊對(duì)炎癥性疾病具有高靶向性，可提高所載藥物的生物利用度。

4.3 抗腫瘤藥物

在抗腫瘤藥物方面，酵母微囊可降低細(xì)胞毒性藥物的毒副作用，實(shí)現(xiàn)口服遞送生物大分子藥物和提高藥物生物利用度的目標(biāo)。Zhou 等[43]將順鉑的前體藥物納米顆粒裝載到酵母微囊中并灌胃給小鼠后發(fā)現(xiàn)，酵母微囊中的藥物可被成功釋放到腫瘤細(xì)胞內(nèi)并保持活性，其藥效與靜脈注射相當(dāng)，且安全性更高。Hou 等[17]以鼠結(jié)腸和直腸腫瘤細(xì)胞裂解物為抗原制備了腫瘤疫苗，并將其封裝于酵母微囊中，給小鼠灌胃該制劑后發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)受到了明顯抑制。另外，可通過遞送siRNA 類藥物酵母微囊來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤基因治療。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白的上調(diào)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，Tencerova等[44]利用酵母微囊封裝靶向NF-κB的siRNA，并發(fā)現(xiàn)該制劑可抑制小鼠肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)。與此同時(shí)，酵母微囊也可提高難溶藥物的口服生物利用度。Ren等[45]將吉非替尼多功能脂質(zhì)體裝載到酵母微囊中并灌胃給小鼠后發(fā)現(xiàn)，該制劑可表現(xiàn)出比市售藥品更高的生物利用度和抗腫瘤效果。Li等[46]也發(fā)現(xiàn)，以酵母微囊封裝卡巴他賽可提高藥物的生物利用度并延長(zhǎng)藥物在腫瘤組織中的滯留時(shí)間。綜上可見，以酵母微囊作為抗腫瘤藥物的載體，可協(xié)助所載藥物發(fā)揮更持久的抗腫瘤作用。

5 酵母微囊的安全性

酵母作為國(guó)際上公認(rèn)的無毒可食用微生物，被廣泛應(yīng)用于制藥、畜牧和食品工業(yè)領(lǐng)域。例如，有學(xué)者以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象開展了單劑量急性、慢性毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明釀酒酵母無毒，即使灌胃劑量高達(dá)2 000 mg/kg也并未觀察到大鼠死亡或異常情況，連續(xù)給藥91 d也未見不良反應(yīng)或毒性反應(yīng)發(fā)生[47]。Beier 等[48]給小型豬口服酵母后發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞從腸道運(yùn)輸?shù)交A(chǔ)免疫細(xì)胞需要1 h，此時(shí)多數(shù)酵母細(xì)胞存在于腸道淋巴組織中；24 h 后，酵母細(xì)胞并未在豬PP 中被檢出，表明酵母細(xì)胞已被完全降解?？梢姡诜湍妇哂辛己玫陌踩?。但有研究指出，酵母微囊的主要成分β-葡聚糖具有一定的毒性效應(yīng)（如導(dǎo)致肝脾腫大和肉芽腫形成），但僅在靜脈注射時(shí)出現(xiàn)，口服給藥仍顯示安全無毒[49]。綜上，酵母微囊屬于酵母加工品，保留了釀酒酵母口服安全性高的特點(diǎn)，在用于口服藥物遞送的報(bào)道中，尚未發(fā)現(xiàn)其具有毒副作用。

6 總結(jié)與展望

酵母微囊制備簡(jiǎn)單、安全無毒，大量的β-葡聚糖保障了藥物在胃液中的穩(wěn)定性，故酵母微囊具備作為口服藥物遞送載體的潛力。酵母微囊結(jié)構(gòu)疏松多孔，利于載藥，其所含β-葡聚糖可被免疫細(xì)胞表面的dectin-1識(shí)別，從而激活免疫反應(yīng)，并可在被攝取后隨淋巴細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)將所載藥物運(yùn)送至病變部位。可見，酵母微囊非常適合遞送疫苗、抗炎藥物及抗腫瘤藥物，其不僅可實(shí)現(xiàn)上述藥物的口服遞送，而且能增強(qiáng)藥物的效果，提高藥物的靶向性。本文綜述了酵母微囊作為遞送載體用于疫苗、抗炎藥物、抗腫瘤藥物的遞送特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)酵母微囊作為口服藥物遞送載體具有較高的安全性，能克服惡劣的胃腸環(huán)境，靶向淋巴組織并實(shí)現(xiàn)在炎癥或腫瘤部位的聚集。雖然以酵母微囊為載體的口服疫苗和口服制劑有諸多優(yōu)點(diǎn)，但其全身轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的相關(guān)研究較少，尚需更多的基礎(chǔ)研究來明確其原理，或開發(fā)更加高效的聯(lián)合給藥系統(tǒng)并收集相關(guān)臨床證據(jù)，使其真正發(fā)揮口服藥物遞送系統(tǒng)的臨床價(jià)值。