護(hù)肝布祖熱方對大鼠肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷的影響及機(jī)制Δ

阿依孜巴·圖爾洪 ，楊建華 ，王曉梅 ，王新玲 ，胡君萍 （.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 8300；.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 8300）

膽汁淤積是多種肝膽疾病常見的基本病理改變[1]。作為一種進(jìn)行性肝病，該癥與肝外膽管、肝內(nèi)膽管梗阻或肝細(xì)胞分泌膽汁方式改變所致膽汁流中斷有關(guān)，表現(xiàn)為有毒膽汁成分（包括膽汁酸、膽固醇和膽紅素等）在肝臟內(nèi)過度蓄積，從而損害肝細(xì)胞，最終引發(fā)肝臟炎癥、肝纖維化甚至肝硬化[2]。WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肝硬化是中低收入國家人群第八大死亡原因，且對于終末期肝病患者而言，唯一可用的治療方法是肝移植[3]。由于目前缺乏治療膽汁淤積性肝病的有效藥物，因此中醫(yī)藥治療膽汁淤積的療效及其作用機(jī)制研究備受學(xué)界關(guān)注。

護(hù)肝布祖熱方（Hugan buzure formula，HBF）是保肝護(hù)肝的經(jīng)典方之一，由菊苣根、菊苣子、芹菜根、芹菜子、茴香根皮、小茴香、菟絲子7味藥材組成，具有補(bǔ)益肝胃、散氣止痛、利膽、利水的功效，用于臨床治療急慢性乙型肝炎、黃疸性肝炎、急慢性膽囊炎、膽管炎等肝膽疾病，其成方制劑為護(hù)肝布祖熱顆粒。本課題組前期研究表明，HBF對四氯化碳誘導(dǎo)的人肝星狀細(xì)胞損傷和大鼠急性肝損傷、肝纖維化均具有良好的改善作用[4—6]，但其是否具有體內(nèi)抗膽汁淤積作用尚不清楚。有文獻(xiàn)報道，該方主要活性成分芹菜素可通過影響法尼酯X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）信號通路對膽汁淤積性肝病發(fā)揮改善作用[7]，由毛菊苣加工制成的單味制劑清熱卡森顆?？赏ㄟ^調(diào)控該通路而改善大鼠的肝內(nèi)膽汁淤積[8]。此外，F(xiàn)XR受體在抑制膽汁酸合成酶、抑制肝攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體、誘導(dǎo)膽汁外流轉(zhuǎn)運(yùn)體、促進(jìn)肝臟膽汁酸代謝等方面也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，因此被稱為“膽鹽受體”，是目前肝內(nèi)膽汁淤積的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)[9]?；诖?，本文研究了HBF對大鼠肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷的影響，并從FXR信號通路角度初步探討了其潛在機(jī)制，旨在為拓展該方的臨床用途提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本文所用主要儀器有Multiskan GO型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、Eclipse Ni-U 型顯微鏡（日本Nikon 公司）、QuantStudioTM6 Flex 型實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國Life Technologies 公司）、FluorChem E 0723 型超靈敏全自動成像分析系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

菊苣根（批號JJZ-YP-200527）、菊苣子（批號JJZYP-191209）、茴香根皮（批號HXGP-YP-210115）均購自新疆寶康藥業(yè)有限公司，芹菜根（批號Z30142203）、芹菜子（批號G30131002）均購自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院，小茴香（批號XHX-YP-170803）、菟絲子（批號150701）均購自新疆和濟(jì)中藥飲片有限公司，以上藥材經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院胡君萍教授鑒定均為真品。

α-異硫氰酸萘酯（alpha-naphthyl isothiocyanate，ANIT）對照品（貨號551-06-4，純度98%）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）膠囊（陽性對照，貨號L20237A，規(guī)格250 mg）購自德國Losan Pharma 公司；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號分別為20210708、20210708、20210708、20210707、20210709、20210618、20210709、20210708、20210709）均購自南京建成生物工程研究所；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑（批號G1003）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒（批號分別為AL50946A、AL51019A）均購自日本Takara公司；兔源FXR 抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗（貨號分別為25055-1-AP、SA00001-1）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔源膽鹽輸出泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（bile salt export pump，BSEP）、多藥耐藥蛋白2（multidrug resistance protein 2，MRP2）抗體和鼠源β-微管蛋白（β-tubulin）抗體（貨號分別為AF7593、DF3873、AF7018）均購自美國Affinity 公司；鼠源鈉離子依賴性?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Na+-taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）抗體（貨號YT5372）購自蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司；兔源核因子κB p65（nuclear factor kappa B p65，NF-κB p65）抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗（貨號分別為8242T、7074S）均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體重（200±20）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（新）2018-0002。所有大鼠均飼養(yǎng)于受控環(huán)境（溫度23～24 ℃，相對濕度50%～60%，光照/黑暗循環(huán)12 h）中，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為IACUC-20180222-62。

2 方法

2.1 HBF藥液的制備

參照HBF原方組成，稱取芹菜根、菊苣子、茴香根皮各212 g，芹菜子、菊苣根、小茴香各106 g，菟絲子53 g，粉碎，混合，加水煎煮3 次，煎煮時間分別為2、1.5、1 h；合并3次煎液，濃縮得到干浸膏233.2 g，得率為23.16%。給藥前，用水溶解，制成不同濃度的HBF藥液，備用。

2.2 分組、給藥與造模

將大鼠隨機(jī)分為對照組（control組）、模型組（model組）、UDCA組（陽性對照，60 mg/kg）和HBF低、中、高劑量組[HBF-L、HBF-M、HBF-H 組，0.4、0.8、1.6 g/kg（按生藥總量計）]，每組6 只。UDCA 的劑量參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]設(shè)置；HBF的臨床人用劑量為18 g/d，折算得大鼠中劑量為0.8 g/kg，再以此為基礎(chǔ)得低、高劑量分別為0.4、1.6 g/kg。各藥物組大鼠每天灌胃相應(yīng)藥液1 次，連續(xù)7 d；control組和model組大鼠灌胃等體積水。所有大鼠在造模前均禁食不禁水12 h；實(shí)驗(yàn)第5天，除control組大鼠灌胃等體積橄欖油外，其余各組大鼠均單次灌胃ANIT 橄欖油溶液（100 mg/kg）建立肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷模型[2，11]。

2.3 大鼠生理狀況觀察

實(shí)驗(yàn)期間，每天記錄各組大鼠的死亡情況，以及尿色、脫毛、精神狀態(tài)等生理狀況的變化情況。

2.4 標(biāo)本采集與處理

實(shí)驗(yàn)第7天末次給藥（即ANIT造模48 h）后，麻醉大鼠并于腹主動脈取血，以3 000 r/min 離心10 min，收集上層血清，于—80 ℃下保存，用于血清生化指標(biāo)的檢測。隨后，處死各組大鼠，取一部分肝組織固定在4%多聚甲醛中，用于組織病理形態(tài)觀察；其余肝組織立即凍存于液氮中，于—80 ℃下保存，用于相關(guān)蛋白及mRNA 的檢測。

2.5 大鼠血清生化指標(biāo)檢測

取—80 ℃下保存的血清樣品，按相關(guān)試劑盒說明書操作，以酶標(biāo)儀檢測各組大鼠血清中肝功能指標(biāo)（AST、ALT、ALP、TBA、DBIL、TBIL）含量和氧化應(yīng)激指標(biāo)（MDA、GSH、SOD）水平。

2.6 大鼠肝組織病理形態(tài)觀察

取固定于4%多聚甲醛中的肝組織適量，脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度4～5 μm），經(jīng)HE 染色后，置于顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織的病理形態(tài)變化。

2.7 大鼠肝組織中炎癥和FXR 信號通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)檢測

采用實(shí)時定量PCR法進(jìn)行檢測。取—80 ℃下保存的肝組織適量，用Trizol 試劑提取總RNA（50 mg）并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以上述cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20 μL）包括：正、反引物各0.8 μL，TB Green Premix Ex Taq（2×）10 μL，ROX Reference Dye 2（50×）0.4 μL，cDNA 模板 2 μL，滅菌水6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，采用2—ΔΔCt法計算各組大鼠肝組織中炎癥相關(guān)因子[腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）]和FXR信號通路相關(guān)因子[FXR、小異源二聚體伴侶受體（small heterodimer partner，SHP）、NTCP、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽2（organic anion-transporting polypeptide 2，OATP2）、BSEP、MRP2、膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）]mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果以control 組為參照進(jìn)行歸一化處理。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計、合成，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列及產(chǎn)物長度

2.8 大鼠肝組織中FXR 信號通路相關(guān)蛋白和NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測

采用Western blot法進(jìn)行檢測。取—80 ℃下保存的肝組織適量，經(jīng)裂解、研磨、靜置后，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，測定蛋白濃度后煮沸變性；取變性蛋白樣品適量，經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)膜，封閉；加入FXR、MRP2、BSEP、NTCP、β-tubulin 和NF-κB p65 一抗（稀釋比例分別為1∶4 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000、1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；加入相應(yīng)二抗（稀釋比例1∶2 000），于室溫下孵育1 h；以化學(xué)發(fā)光法顯色，使用全自動成像分析系統(tǒng)成像。以β-tubulin為內(nèi)參，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值，用以表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 HBF對大鼠一般生理狀況的影響

造模前，各組大鼠的精神狀態(tài)、活動、尿色、毛發(fā)等生理狀況均正常。造模后，與control 組比較，其余各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的活動減少、皮膚瘙癢、尿黃等；與model 組比較，各藥物組大鼠的上述生理狀況均有一定程度的改善。各組大鼠均未死亡。

3.2 HBF對大鼠血清中肝功能指標(biāo)的影響

與control 組比較，model 組大鼠血清中AST、ALT、ALP、TBA、DBIL、TBIL 含量均顯著升高（P＜0.01）。與model組比較，HBF-H組大鼠上述指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），而HBF-L組、HBF-M組、UDCA組大鼠均只有部分指標(biāo)顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 HBF 對大鼠血清中肝功能指標(biāo)的影響（±s，n＝6）

表2 HBF 對大鼠血清中肝功能指標(biāo)的影響（±s，n＝6）

a：與control組比較，P＜0.01；b：與model組比較，P＜0.01；c：與model組比較，P＜0.05。

TBIL/（μmol/L）0.57±0.20 61.90±7.97a 60.64±11.43 63.06±11.15 51.17±8.27 43.51±11.80b組別control組model組UDCA組HBF-L組HBF-M組HBF-H組AST/（U/L）42.12±5.61 58.95±5.95a 38.59±9.53b 71.11±7.43 58.45±10.70 47.94±13.96c ALT/（U/L）33.28±5.85 108.06±16.3a 107.80±7.90 106.60±19.55 106.49±24.67 88.83±6.71c ALP/（U/L）167.89±60.66 776.37±118.52a 556.58±90.79b 619.04±117.93b 546.78±53.39b 505.55±127.52b TBA/（μmol/L）13.70±3.97 315.20±16.39a 276.66±22.59b 295.18±12.90 272.62±26.22b 229.86±34.31b DBIL/（μmol/L）0.84±0.06 29.43±9.37a 21.73±6.76 24.88±13.04 18.88±5.89c 16.40±4.68b

3.3 HBF對大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與control組比較，model組大鼠血清中MDA水平顯著升高，GSH、SOD 水平均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。與model 組比較，HBF-M 組、HBF-H 組、UDCA組大鼠血清中MDA、GSH 水平均顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05），HBF-L組大鼠血清中僅MDA水平顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 HBF 對大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（±s，n＝6）

表3 HBF 對大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響（±s，n＝6）

a：與control組比較，P＜0.01；b：與control組比較，P＜0.05；c：與model組比較，P＜0.05；d：與model組比較，P＜0.01。

組別control組model組UDCA組HBF-L組HBF-M組HBF-H組MDA/（μmol/L）3.93±0.26 16.87±2.29a 13.53±1.93c 12.58±2.69d 12.37±2.80d 12.12±3.28d GSH/（μmol/L）13.64±1.97 6.67±5.03a 17.60±4.21d 10.62±3.78 11.56±4.18c 13.42±2.71d SOD/（U/mL）269.43±17.21 247.49±9.91b 239.36±19.33 242.49±18.38 242.65±15.76 254.78±10.75

3.4 HBF對大鼠肝組織病理形態(tài)的影響

control 組大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肝索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列緊密，界限清晰且大小正常，未見明顯異常；model 組大鼠肝組織受損嚴(yán)重，細(xì)胞邊界缺失，中央靜脈周圍可見肝細(xì)胞灶性壞死，伴明顯的炎癥細(xì)胞浸潤；UDCA 組大鼠肝組織中肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整，未見明顯壞死；HBF-L 組大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)有所好轉(zhuǎn)，但仍伴有少量肝細(xì)胞灶性壞死和炎癥細(xì)胞浸潤；HBF-M組大鼠大部分肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，伴有少量肝細(xì)胞灶性壞死和炎癥細(xì)胞浸潤；HBF-H組大鼠肝組織形態(tài)與control組相似，肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)保持完整，較model組顯著好轉(zhuǎn)。結(jié)果見圖1。

圖1 HBF 對大鼠肝組織病理形態(tài)變化影響的顯微圖（HE染色）

3.5 HBF對大鼠肝組織中炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

與control 組比較，model 組大鼠肝組織中促炎因子TNF-α、IL-1β mRNA 的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與model 組比較，HBF-H 組大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β mRNA 的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），HBF-M 組大鼠肝組織中僅TNF-α mRNA的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 HBF 對大鼠肝組織中炎癥相關(guān)因子mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝6）

表4 HBF 對大鼠肝組織中炎癥相關(guān)因子mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝6）

a：與control組比較，P＜0.01；b：與control組比較，P＜0.05；c：與model組比較，P＜0.05；d：與model組比較，P＜0.01。

IL-1β/GAPDH 1.02±0.21 1.57±0.20b 1.18±0.31 2.38±0.69 1.52±0.52 0.96±0.32c組別control組model組UDCA組HBF-L組HBF-M組HBF-H組TNF-α/GAPDH 1.12±0.65 8.12±2.66a 7.53±3.42 7.80±2.11 4.88±2.34c 2.92±2.90d

3.6 HBF對大鼠肝組織中FXR信號通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

與control 組比較，model 組大鼠肝組織中FXR、SHP、MRP2、BSEP、NTCP、OATP2 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，CYP7A1 mRNA 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。與model 組比較，HBF-H 組大鼠上述指標(biāo)均顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05 或P＜0.01），而HBF-L 組、HBF-M 組、UDCA 組大鼠均只有部分指標(biāo)顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表5。

表5 HBF 對大鼠肝組織中FXR 信號通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝6）

表5 HBF 對大鼠肝組織中FXR 信號通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝6）

a：與control組比較，P＜0.01；b：與control組比較，P＜0.05；c：與model組比較，P＜0.01；d：與model組比較，P＜0.05。

CYP7A1/GAPDH 1.00±0.08 11.07±3.87b 3.07±1.19d 3.81±1.19d 3.71±1.52d 2.40±1.22d組別control組model組UDCA組HBF-L組HBF-M組HBF-H組FXR/GAPDH 1.08±0.44 0.29±0.14a 0.54±0.28 0.41±0.25 0.53±0.26 0.69±0.36d SHP/GAPDH 1.01±0.12 0.18±0.18a 0.49±0.08c 0.34±0.28 0.52±0.18c 0.68±0.08c MRP2/GAPDH 1.11±0.47 0.58±0.15b 1.19±0.27d 1.28±0.32c 1.46±0.52c 1.51±0.42c BSEP/GAPDH 1.13±0.70 0.48±0.25b 1.35±0.41c 1.00±0.48 1.41±0.38c 1.49±0.43c NTCP/GAPDH 1.00±0.07 0.24±0.05a 0.61±0.06c 0.45±0.26 0.49±0.05c 1.11±0.23c OATP2/GAPDH 1.14±0.61 0.42±0.24a 0.74±0.46 0.50±0.21 0.62±0.32 0.95±0.45d

3.7 HBF 對大鼠肝組織中FXR 信號通路相關(guān)蛋白及NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

與control 組比較，model 組大鼠肝組織中FXR、MRP2、BSEP、NTCP蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低，NFκB p65 蛋白的相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。與model組比較，HBF-H組大鼠上述指標(biāo)均顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05或P＜0.01），而HBF-L組、HBF-M組、UDCA組大鼠均只有部分指標(biāo)顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05 或P＜0.01）。結(jié)果見圖2、表6。

圖2 HBF 對大鼠肝組織中FXR 信號通路相關(guān)蛋白及NF-κB p65蛋白表達(dá)影響的電泳圖

表6 HBF 對大鼠肝組織中FXR 信號通路相關(guān)蛋白及NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）

表6 HBF 對大鼠肝組織中FXR 信號通路相關(guān)蛋白及NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）

a：與control組比較，P＜0.01；b：與model組比較，P＜0.01；c：與model組比較，P＜0.05。

NF-κB p65/β-tubulin 0.52±0.09 1.05±0.07a 0.82±0.10b 0.83±0.11b 0.73±0.09b 0.65±0.15b組別control組model組UDCA組HBF-L組HBF-M組HBF-H組FXR/β-tubulin 0.94±0.12 0.65±0.18a 0.92±0.14b 0.81±0.15 1.05±0.11b 1.11±0.16b MRP2/β-tubulin 1.16±0.20 0.80±0.13a 0.80±0.19 0.71±0.18 0.84±0.16 1.06±0.09c BSEP/β-tubulin 1.05±0.19 0.66±0.10a 0.88±0.12c 0.61±0.11 0.85±0.14c 0.99±0.20b NTCP/β-tubulin 1.03±0.16 0.69±0.22a 0.71±0.16 0.71±0.06 0.86±0.16 1.03±0.22b

4 討論

ANIT是常用的肝臟毒性物質(zhì)，可阻斷膽汁流動，使膽汁酸在肝臟內(nèi)蓄積，導(dǎo)致膽汁淤積[12]。因此，本研究采用ANIT 誘導(dǎo)建立大鼠膽汁淤積性肝損傷模型，用以探討HBF 防治膽汁淤積的作用及潛在機(jī)制。AST、ALT、ALP、TBA、DBIL、TBIL 是臨床評價膽汁淤積性肝損傷的基本血清生化指標(biāo)，ANIT干預(yù)后48 h，血清中的上述指標(biāo)均可達(dá)到峰值[11]。本研究結(jié)果顯示，model 組大鼠血清中AST、ALT、ALP、TBA、DBIL、TBIL 含量均顯著高于control 組，其肝組織受損嚴(yán)重，可見肝細(xì)胞灶性壞死和炎癥細(xì)胞浸潤，提示ANIT 致膽汁淤積性肝損傷大鼠模型復(fù)制成功。與model 組比較，HBF 和UDCA均能不同程度地逆轉(zhuǎn)上述肝功能指標(biāo)的升高，并能不同程度地改善肝組織病理形態(tài)變化，其中HBF-H組大鼠上述肝功能指標(biāo)均顯著低于model 組，肝組織形態(tài)與control組相似。

氧化應(yīng)激在多種肝臟疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。GSH、SOD、MDA是評估人體抗氧化能力的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與model 組比較，HBF-H 組大鼠肝組織中MDA水平顯著降低，GSH水平顯著升高，提示高劑量的HBF 可以緩解大鼠膽汁淤積性肝損傷造成的氧化應(yīng)激?？梢?，HBF 對ANIT 誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷有良好的防治作用。

肝細(xì)胞是具有極性結(jié)構(gòu)的上皮細(xì)胞，分為膽小管區(qū)和基底外側(cè)區(qū)。作為肝細(xì)胞的基底側(cè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，膽汁酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體NTCP和OATP2負(fù)責(zé)膽汁酸的重吸收，而膽汁酸可負(fù)向降低NTCP 和OATP2 的表達(dá)[13]。作為膽小管區(qū)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的BSEP 和MRP2 能促使膽汁酸、膽鹽從肝細(xì)胞排泄到膽管[11]。此外，CYP7A1 是膽汁酸合成的關(guān)鍵酶，F(xiàn)XR 的激活會誘導(dǎo)SHP 的表達(dá)，從而抑制CYP7A1的活性[14]。FXR是首個被學(xué)界正式確認(rèn)的核受體，廣泛分布于肝臟、腸道、腎臟和腎上腺等器官/組織[15]。膽汁酸是天然的FXR 配體[16]，上述細(xì)胞因子均由FXR直接或間接調(diào)控，F(xiàn)XR與類視黃醇X受體形成的異源二聚體可通過激活SHP 來調(diào)節(jié)膽汁酸的穩(wěn)態(tài)。在病理狀態(tài)下，NTCP 表達(dá)的下調(diào)可能導(dǎo)致膽汁酸的攝入減少，從而導(dǎo)致膽汁淤積的發(fā)生或現(xiàn)有膽汁淤積性疾病的加重[15]。膽汁酸的蓄積可觸發(fā)肝細(xì)胞中促炎因子的產(chǎn)生，從而啟動炎癥反應(yīng)[12]。NF-κB p65 是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)膽汁淤積性肝損傷模型大鼠受到炎癥因子TNF-α、IL-1β 刺激時，NF-κB p65 蛋白的表達(dá)將會升高，從而進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)[17]。此外，還有研究表明，F(xiàn)XR也可通過與NF-κB亞基結(jié)合來抑制NF-κB的活性，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[13]。本研究結(jié)果顯示，高劑量的HBF 可顯著上調(diào)模型大鼠肝組織中FXR、BSEP、MRP2、NTCP mRNA 及蛋白的表達(dá)，抑制NF-κB p65 蛋白的表達(dá)，同時還可上調(diào)SHP、OATP2 mRNA的表達(dá)，下調(diào)CYP7A1和促炎因子TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)，表明HBF 可能通過調(diào)控FXR 信號通路、抑制炎癥反應(yīng)來預(yù)防大鼠膽汁淤積性肝損傷。

綜上所述，HBF對大鼠肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷具有預(yù)防作用，此作用可能是通過激活FXR 信號通路、減輕炎癥和氧化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)的。