貫葉金絲桃對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究Δ

王 宏，康 利，江 茜，劉偉偉，張 巖，傅 予 （天津市醫(yī)藥科學研究所，天津 300020）

卒中是一種急性腦血管疾病，是由于腦血管突然破裂或阻塞致血液供應不足而引發(fā)的腦組織損傷性疾病?！读~刀》最新報告指出，全球卒中發(fā)病率逐年增高，現(xiàn)已成為世界第二大死亡原因和第三大殘疾原因[1]。卒中通常分為缺血性和出血性兩大類，其中缺血性腦卒中約占70%，缺血再灌注損傷是其重要的病理機制之一[2]。

貫葉金絲桃，又名圣·約翰草，為藤黃科植物貫葉金絲桃Hypericum perforatumL.的干燥地上部分，始載于《本草綱目》。該藥被2020年版《中國藥典》（一部）收錄，性寒、味辛，歸肝經(jīng)，具有疏肝解郁、清熱利濕、消腫通乳的功效[3]。貫葉金絲桃作為抗抑郁藥物在歐洲已有數(shù)百年的歷史，以其提取物為主要成分的藥物更是抑郁癥治療的首選[4]。此外有研究表明，貫葉金絲桃對卒中后抑郁表現(xiàn)出較好的治療效果[5]。近期研究指出，貫葉金絲桃對缺血性腦損傷有保護作用[6—7]。缺血性腦損傷的病理機制較為復雜，其中促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）介導的Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）信號通路已被證實與保護腦缺血再灌注損傷的作用有關[8]?；诖?，本研究擬利用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞再灌注模型，探討貫葉金絲桃對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，并初步分析其潛在分子機制是否與EPO 介導的JAK2/STAT3 信號通路有關，以期為貫葉金絲桃的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Ci-L 型顯微鏡、Ni-U 型熒光顯微鏡（日本Nikon公司），Infinite M2000型酶標儀（瑞士TECAN公司），Mini PROTEAN Tetra型電泳儀（美國Bio-Rad公司），ImageQuant LAS 500型一體化成像儀（美國GE 公司），ABI7500 型反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）儀（美國ABI公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

貫葉金絲桃藥材（產(chǎn)地四川，批號20190503）購自安徽亳州中藥材批發(fā)市場，經(jīng)天津市醫(yī)藥科學研究所王文彤研究員鑒定為藤黃科植物貫葉金絲桃H. perforatumL.的干燥地上部分；尼莫地平片（陽性對照，批號2003004，規(guī)格20 mg）購自天津市中央藥業(yè)有限公司；注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮（批號8ADTA，規(guī)格為替來他明125 mg+唑拉西泮125 mg）購自法國Virbac公司；鹽酸賽拉嗪注射液（批號20201118，規(guī)格2 mL∶0.2 g）購自吉林省華牧動物保健品有限公司。

TTC試劑（批號L09A10S83253）購自上海源葉生物科技有限公司；蘇木精、伊紅染色液（批號分別為G1140、G1100）均購自北京索萊寶科技有限公司；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（熒光素）購自瑞士Roche公司；兔源EPO、促紅細胞生成素受體（erythropoietin receptor，EPOR）、JAK2、磷酸化STAT3（p-STAT3）、STAT3多克隆抗體和鼠源β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（批號分別為08D01、ZP8069BP69、BST17874165、ZP7411BP11、BOS6738BP3380、AC-15）均購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（批號7074S）購自美國CST公司；BCA蛋白定量試劑盒、超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒、HRP 標記的山羊抗鼠IgG二抗（批號分別為OS28、EL2001001、916A035）均購自愛必信（上海）生物科技有限公司；TRIzol 試劑、HiFi-Script cDNA鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture（批號分別為01761、33020、30506）均購自江蘇康為世紀生物科技有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物長度

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠75只，體重160～180 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0006。所有動物均飼養(yǎng)于天津市醫(yī)藥科學研究所動物房內，自由攝食、飲水。本研究所涉及的動物操作均符合天津市醫(yī)藥科學研究所實驗動物倫理的相關規(guī)定，并經(jīng)過倫理委員會批準（批準編碼IMPS-EAEP-Z-Z2019017-01）。

2 方法

2.1 貫葉金絲桃提取物浸膏的制備

取貫葉金絲桃藥材5 850 g，粉碎，用70%乙醇冷浸提取7 d×3次，合并提取液，濃縮干燥，即得貫葉金絲桃提取物浸膏（每克浸膏相當于生藥14.48 g）。

2.2 大鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立

采用改良線栓法制備大鼠大腦左側中動脈閉塞再灌注模型：在麻醉（注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮25 mg/kg+鹽酸賽拉嗪注射液2.5 mg/kg，肌內注射，后同）狀態(tài)下，于大鼠頸部正中2 cm切口，鈍性分離左側頸總、頸內和頸外動脈，用3-0號無菌手術線結扎頸總和頸外動脈，用動脈夾夾閉頸內動脈遠心端；于頸內動脈近心端備線，在頸總動脈距離分叉約1 cm處用眼科剪剪一小口，將線栓送入切口，經(jīng)頸內動脈順行至線栓標記黑點處，結扎頸內動脈近心端以固定線栓，造成缺血；缺血2 h 后取出線栓，實現(xiàn)再灌注[9]。其中，部分大鼠（10 只）僅分離血管但不結扎、不插線栓，將其作為假手術組。參考Zea-Longa評分法，評分1～3分為造模成功[10]。

2.3 大鼠分組與給藥

將造模成功的大鼠按體重分為模型組、陽性對照組（尼莫地平，0.012 g/kg，以水為溶劑；劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得）和貫葉金絲桃高、低劑量組[5.212、1.303 g/kg，按生藥量計，以水為溶劑；低劑量按圣·約翰草提取物片（商品名為路優(yōu)泰）的臨床等效劑量換算而得]，同時設置假手術組，每組10只。各藥物組大鼠于術后第2天開始灌胃相應藥液，每天1 次，連續(xù)7 d。假手術組和模型組大鼠灌胃等體積水。

2.4 大鼠神經(jīng)功能評分

分別于藥物干預前（造模后第1天）和末次給藥后按Zea-Longa 評分法對各組大鼠進行神經(jīng)功能評分，具體標準如下：無神經(jīng)損傷癥狀，記0分；不能伸展對側前爪，記1分；行走時向偏癱側轉圈，記2分；向偏癱側傾倒，記3分；不能自發(fā)行走且意識喪失，記4分[10]。

2.5 大鼠腦梗死情況觀察

采用TTC 染色法進行觀察。末次給藥1 h 后，隨機取各組大鼠5只，麻醉后，迅速斷頭取腦，用預冷生理鹽水沖洗，并于—20 ℃下放置10 min，待腦組織稍硬后，切除嗅球、垂體、低位腦干，由前向后行等分冠狀位切片。將上述腦組織切片置于1%TTC 磷酸鹽緩沖液中，于37 ℃下避光溫育30 min（每隔10 min上下翻動1次）；經(jīng)4%多聚甲醛固定后，觀察各組大鼠腦組織的梗死情況（正常腦組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色）并拍照。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖片并計算腦梗死比例：腦梗死比例＝腦梗死總面積/腦切片總面積×100%。

2.6 大鼠腦皮層和海馬組織病理形態(tài)學觀察

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法進行觀察。末次給藥1 h后，取各組剩余大鼠5只，麻醉后，剖取其缺血再灌注側腦組織（假手術組大鼠取相同部位腦組織），縱切，將包含皮層和海馬的腦組織固定于4%多聚甲醛中，經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋后切片（厚度為4 μm），行HE 染色后，使用顯微鏡觀察各組大鼠腦皮層和海馬組織的病理改變情況。

2.7 大鼠腦皮層和海馬組織神經(jīng)細胞凋亡檢測

采用TUNEL染色法進行檢測。取“2.6”項下各組大鼠腦組織切片，于60 ℃下烘烤60 min，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，滴加新配制的蛋白酶K 工作液（20 mg/L），于37 ℃下孵育10 min；用磷酸鹽緩沖液清洗3次，滴加TUNEL 檢測液適量，于37 ℃下避光孵育60 min；用磷酸鹽緩沖液清洗3次，以DAPI染液染核，使用熒光顯微鏡觀察各組大鼠腦皮層和海馬組織中神經(jīng)細胞的凋亡情況（凋亡細胞被染成紅色），并采用Image Scope軟件計算其凋亡率：凋亡率＝凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

2.8 大鼠腦組織中EPO、EPOR、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達情況檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.6”項下各組大鼠的缺血再灌注側腦組織（假手術組大鼠取相同部位腦組織），加入蛋白裂解液后研磨，提取總蛋白并采用BCA法進行定量。蛋白變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移到聚二氟乙烯膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h 后，分別加入EPO、EPOR、JAK2、p-STAT3、STAT3、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶500），4 ℃孵育過夜；用TBST緩沖液清洗5 min×3次，加入相應二抗（稀釋比例均為1∶1 000），室溫孵育2 h；用TBST緩沖液清洗5 min×3 次，以超敏ECL 化學發(fā)光試劑顯色，并置于一體化成像儀下成像。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）條帶的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平，結果以假手術組為參照進行歸一化處理。

2.9 大鼠腦組織中EPO、EPOR、JAK2、STAT3 mRNA表達情況檢測

采用RT-PCR 法進行檢測。取“2.6”項下各組大鼠的缺血再灌注側腦組織（假手術組大鼠取相同部位腦組織），用TRIzol試劑提取總RNA，測定濃度并稀釋至250 mg/L，進一步逆轉錄得cDNA。以所得cDNA 為模板進行PCR 擴增。PCR 反應體系（20 μL）包括：2×Ultra-SYBR Mixture 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 模板1.6 μL，ddH2O 6.8 μL。反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40 個循環(huán)。以β-actin 作為內參，采用2—ΔΔCt法計算EPO、EPOR、JAK、STAT3 mRNA的表達水平，結果以假手術組為參照進行歸一化處理。

2.10 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 6.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 貫葉金絲桃對模型大鼠神經(jīng)功能評分的影響

與假手術組比較，模型組大鼠在藥物干預前、末次給藥后的神經(jīng)功能評分均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和貫葉金絲桃高劑量組大鼠末次給藥后的神經(jīng)功能評分均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠的神經(jīng)功能評分和腦梗死比例比較（±s）

表2 各組大鼠的神經(jīng)功能評分和腦梗死比例比較（±s）

a：與假手術組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

組別假手術組模型組陽性對照組貫葉金絲桃高劑量組貫葉金絲桃低劑量組神經(jīng)功能評分（n＝10）/分藥物干預前0 2.50±0.67a 2.60±0.66 2.60±0.66 2.50±0.67末次給藥后0 2.60±0.49a 1.90±0.30b 2.00±0.45c 2.10±0.54腦梗死比例（n＝5）/%0 34.20±3.19a 7.80±1.72b 10.20±1.01b 17.60±2.42b

3.2 貫葉金絲桃對模型大鼠腦梗死比例的影響

與假手術組比較，模型組大鼠的腦梗死區(qū)域明顯增大，腦梗死比例顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和貫葉金絲桃高、低劑量組大鼠的腦梗死區(qū)域有所縮小，腦梗死比例均顯著降低（P＜0.01）。結果見圖1、表2。

圖1 各組大鼠的腦梗死情況

3.3 貫葉金絲桃對模型大鼠腦皮層和海馬組織病理形態(tài)的影響

假手術組大鼠腦皮層組織神經(jīng)細胞形態(tài)正常，結構完整，核仁清晰，細胞質無紅染；海馬組織神經(jīng)細胞結構完整，排列有序。模型組大鼠缺血再灌注側腦皮層組織神經(jīng)細胞大片消失，錐體細胞明顯減少，結構受損，排列紊亂；海馬組織可見神經(jīng)細胞變性，核固縮深染，細胞質紅染，排列較紊亂。陽性對照組和貫葉金絲桃高、低劑量組大鼠缺血再灌注側腦組織上述部位的病理形態(tài)均較模型組有不同程度的改善。結果見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠腦皮層組織病理形態(tài)變化的顯微圖（HE染色）

圖3 各組大鼠海馬組織病理形態(tài)變化的顯微圖（HE染色）

3.4 貫葉金絲桃對模型大鼠腦皮層和海馬組織神經(jīng)細胞凋亡的影響

與假手術組比較，模型組大鼠缺血再灌注側腦皮層和海馬組織中凋亡的神經(jīng)細胞（紅染）明顯增多，凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和貫葉金絲桃高、低劑量組大鼠缺血再灌注側腦皮層和海馬組織中凋亡的神經(jīng)細胞均明顯減少，凋亡率均顯著降低（P＜0.01）。結果見圖4、圖5、表3。

圖4 各組大鼠腦皮層組織中神經(jīng)細胞凋亡的熒光顯微圖（TUNEL染色）

圖5 各組大鼠海馬組織中神經(jīng)細胞凋亡的熒光顯微圖（TUNEL染色）

表3 各組大鼠腦皮層和海馬組織中神經(jīng)細胞的凋亡率比較（±s，n＝5，%）

表3 各組大鼠腦皮層和海馬組織中神經(jīng)細胞的凋亡率比較（±s，n＝5，%）

a：與假手術組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別假手術組模型組陽性對照組貫葉金絲桃高劑量組貫葉金絲桃低劑量組海馬組織0.44±0.53 32.61±1.89a 4.80±1.66b 6.78±1.41b 11.49±2.11b腦皮層組織1.47±1.65 29.84±2.30a 3.00±1.42b 9.37±1.57b 12.03±1.62b

3.5 貫葉金絲桃對大鼠腦組織中EPO、EPOR、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠缺血再灌注側腦組織中EPO、EPOR 蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.01），JAK2、p-STAT3、STAT3 蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組大鼠缺血再灌注側腦組織中EPO、EPOR 蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.01），JAK2、p-STAT3、STAT3（陽性對照組除外）蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.01）。結果見圖6、表4。

圖6 各組大鼠腦組織中EPO、EPOR、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達的電泳圖

表4 各組大鼠腦組織中EPO、EPOR、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達水平比較（±s，n＝5）

表4 各組大鼠腦組織中EPO、EPOR、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達水平比較（±s，n＝5）

a：與假手術組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別假手術組模型組陽性對照組貫葉金絲桃高劑量組貫葉金絲桃低劑量組STAT3/β-actin 1 8.77±0.45a 8.41±0.17 6.65±0.11b 7.21±0.45b EPO/β-actin 1 0.20±0.02a 0.54±0.05b 0.92±0.11b 0.42±0.08b EPOR/β-actin 1 0.30±0.07a 0.92±0.13b 0.75±0.10b 0.73±0.07b JAK2/β-actin 1 11.70±0.78a 3.40±0.21b 3.66±0.06b 4.47±0.09b p-STAT3/β-actin 1 13.93±0.52a 6.63±0.46 b 1.97±0.44b 2.56±0.66b

3.6 貫葉金絲桃對大鼠腦組織EPO、EPOR、JAK2、STAT3 mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠缺血再灌注側腦組織中EPO、EPOR mRNA 的表達水平均顯著降低（P＜0.01），JAK2、STAT3 mRNA的表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組大鼠缺血再灌注側腦組織中EPO、EPOR mRNA 的表達水平均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），JAK2、STAT3 mRNA 的表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表5。

表5 各組大鼠腦組織中EPO、EPOR、JAK2、STAT3 mRNA表達水平比較（±s，n＝5）

表5 各組大鼠腦組織中EPO、EPOR、JAK2、STAT3 mRNA表達水平比較（±s，n＝5）

a：與假手術組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

STAT3 mRNA 1 27.04±6.61a 13.90±3.60c 8.16±1.74b 12.25±2.57c組別假手術組模型組陽性對照組貫葉金絲桃高劑量組貫葉金絲桃低劑量組EPO mRNA 1 0.16±0.03a 0.83±0.21b 0.91±0.11b 0.62±0.16b EPOR mRNA 1 0.19±0.08a 0.64±0.15b 0.62±0.17b 0.53±0.28c JAK2 mRNA 1 15.48±2.72a 6.73±1.02b 9.56±1.30c 9.79±1.97c

4 討論

腦缺血再灌注損傷是由缺血區(qū)血液供應恢復引起的繼發(fā)損傷，也是缺血性卒中治療后的嚴重并發(fā)癥[11]。本研究選擇尼莫地平為陽性對照藥，該藥為二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，可用于缺血性腦血管疾病的臨床治療。本課題組前期研究證實了尼莫地平對缺血性腦損傷有較好的干預效果[12]。本研究所用線栓與大鼠體重相配，有固定長度標記且粗細一致，能夠保證造模大鼠腦缺血程度的一致性。同時，本課題組前期比較了藥物干預3 d和7 d的效果，結果顯示，貫葉金絲桃干預3 d的效果不明顯，可能與干預時間偏短有關，故最終選用了藥物干預7 d 的方案。本研究結果顯示，模型組大鼠的神經(jīng)功能評分和腦梗死比例均較假手術組顯著升高，缺血再灌注側腦皮層和海馬組織明顯受損，凋亡的神經(jīng)細胞明顯增多且凋亡率顯著升高；而高、低劑量的貫葉金絲桃均能不同程度地降低模型大鼠的神經(jīng)功能評分和腦梗死比例，改善其缺血再灌注側腦皮層和海馬組織的受損情況，減少其凋亡神經(jīng)細胞數(shù)量并降低凋亡率，提示貫葉金絲桃對大鼠腦缺血再灌注損傷有明顯的改善作用。

研究表明，JAK2/STAT3 信號通路與腦缺血再灌注損傷關系密切[13—14]。該信號通路由3 個部分組成：接收信號的酪氨酸激酶相關受體、傳遞信號的JAK2 和產(chǎn)生效應的STAT3[15]。EPO是紅細胞生成所需的主要刺激因子，為人體內源性糖蛋白激素，主要通過與其受體結合而發(fā)揮促進紅細胞成熟的作用[16]。Liu 等[17]研究證實，EPO可作為神經(jīng)細胞保護因子，對缺血性腦損傷具有一定的修復作用。當腦缺血發(fā)生后，EPO/EPOR軸可通過與JAK2 的相互作用而被激活；隨后，JAK2 可使STAT3發(fā)生磷酸化，生成的p-STAT3進一步二聚化并異位至細胞核內，與具有特定位點的靶標[如B 細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-XL等]結合，從而抑制神經(jīng)細胞的凋亡[18—19]?？梢姡珽PO 能通過介導JAK2/STAT3信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮保護作用。Western blot 和RT-PCR 實驗結果顯示，高、低劑量的貫葉金絲桃可顯著上調大鼠缺血再灌注側腦組織中EPO、EPOR 蛋白及mRNA 的表達，下調JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白和JAK2、STAT3 mRNA的表達，提示貫葉金絲桃的上述作用可能是通過EPO 介導的JAK2/STAT3信號通路來完成的。

綜上所述，貫葉金絲桃對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用，其機制可能與調節(jié)EPO 介導的JAK2/STAT3信號通路有關。本課題組后續(xù)將應用通路抑制劑，進一步闡釋上述通路在貫葉金絲桃改善腦缺血再灌注損傷中的具體機制。