朱砂根、山豆根及其藥對的HPLC指紋圖譜建立及5種化學(xué)成分的含量測定Δ

陳 贇 ，石 慧 ，俸婷婷 ，張麗艷 董 秀 ，張金鶴 黃 蓓 ，周 英 （.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 55005；.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥食兩用資源應(yīng)用與開發(fā)研究中心，貴陽 55005；.貴州三力制藥股份有限公司，貴州 安順 5600；.貴州省藥品監(jiān)督管理局檢查中心，貴陽 55005）

朱砂根為紫金牛科植物朱砂根Ardisia crenataSims的干燥根，味微苦、辛，性平，長于解毒消腫、活血止痛、祛風除濕，用于治療咽喉腫痛、風濕痹痛、跌打損傷；朱砂根含有香豆素類等成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用[1]。山豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根莖，味苦，性寒，長于清熱解毒、消腫利咽，用于治療火毒蘊結(jié)、乳蛾喉痹、咽喉腫痛、齒齦腫痛、口舌生瘡[2]；山豆根含有生物堿、黃酮類等成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等作用[3—6]。兩藥合用，有增強利咽之效，如朱砂根-山豆根藥對是苗藥開喉劍噴霧劑的主要組成，兩藥用量超所用藥材總量的70%。

2020年《中國藥典》（一部）規(guī)定，以巖白菜素作為朱砂根的質(zhì)控成分，以苦參堿、氧化苦參堿的總含量作為山豆根的質(zhì)控評價指標[2]。沒食子酸是一種天然多酚類化合物，具有抗氧化、抗菌、抗炎等多種生物活性；黃酮類成分被認為是山豆根發(fā)揮藥效和產(chǎn)生毒性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[7]。同時，筆者通過文獻查詢發(fā)現(xiàn)，目前尚無朱砂根-山豆根藥對的質(zhì)量標準?？紤]到中藥成分復(fù)雜，單一成分難以全面反映藥材質(zhì)量，因此有必要對該藥對進行質(zhì)量控制?；诖?，本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）法建立朱砂根、山豆根及朱砂根-山豆根藥對的指紋圖譜，并同法測定沒食子酸、苦參堿、氧化苦參堿、巖白菜素和三葉豆紫檀苷的含量，旨在為朱砂根-山豆根藥對及其制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Agilent 1260 型HPLC 儀（美國Agilent 公司）、AG135 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

沒食子酸對照品（批號PS000688，純度≥98%）、苦參堿對照品（批號PS011495，純度≥98%）、氧化苦參堿對照品（批號PS011495，純度≥98%）、巖白菜素對照品（批號PS000991，純度≥98%）、三葉豆紫檀苷對照品（批號PS012410，純度≥98%）均購自成都普思生物科技股份有限公司；乙腈為色譜純，磷酸為優(yōu)級純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

10 批朱砂根飲片（編號Z1～Z10）、山豆根飲片（編號S1～S10）中，Z1～Z5、S1～S5樣品由貴州三力制藥有限公司提供，Z6～Z10、S6～S10樣品為本課題組野外采集后加工所得。所有飲片經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏升華教授鑒定，分別為紫金?？浦参镏焐案鵄. crenataSims 的干燥根、豆科植物越南槐S. tonkinensisGagnep.的干燥根和根莖。取10批朱砂根、山豆根飲片，粉碎，取粗粉（過二號篩）各10 g，兩者依次配對，得到10 批朱砂根-山豆根藥對（編號YZS1～YZS10）。朱砂根、山豆根飲片來源信息見表1。

表1 朱砂根、山豆根飲片來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Agilent InfinityLab Poroshell HPH C18（250 mm×4.6 mm，4 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～14 min，5%A；14～35 min，5%A→30%A；35～40 min，30%A→50%A；40～50 min，50%A→60%A）；流速為0.7 mL/min；檢測波長為210 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.2 單煎、合煎凍干粉樣品的制備

2.2.1 朱砂根、山豆根的單煎凍干粉樣品

分別取10批朱砂根、山豆根飲片，粉碎，精密稱取粗粉（過二號篩）各10 g，分別置于圓底燒瓶內(nèi)，加入8倍量水，浸泡4 h，煎煮2次（第1次煎煮2 h，第2次煎煮1 h）；合并2次煎煮液，用紗布（8層）濾過，置于70 ℃水浴中濃縮至近干，冷凍干燥，分別得朱砂根單煎凍干粉（編號為DZ1～DZ10）、山豆根單煎凍干粉（編號為DS1～DS10），每克凍干粉約相當于生藥量5～7 g。

2.2.2 朱砂根-山豆根藥對的合煎凍干粉樣品

分別精密稱取“1.2”項下10批朱砂根-山豆根藥對，按“2.2.1”項下方法操作，即得朱砂根-山豆根藥對的合煎凍干粉（編號為ZS1～ZS10），每克凍干粉約相當于生藥量6～8 g。

先從保時捷911 GT2 RS說起。顯而易見的是，它和“日?！币辉~根本不搭邊，制約它成為日常座駕最重要的一點在于其所配備的桶形座椅。坐進這輛保時捷之前，我告誡自己—休想從桶形座椅中獲得舒適的乘坐感受。在這輛保時捷911 GT2 RS的陪伴下，我從克羅地亞的里耶卡（Rijeka）啟程，途徑卡爾洛瓦茨（Karlovac），返回到奧地利的維也納。長時間置身于這輛超級跑車中，其傾斜的座椅靠背和多點式安全帶無疑在考驗著我的耐受力。或許，這就是傳說中的“增益其所不能”吧。

2.3 溶液的制備

2.3.1 單一對照品溶液

稱取沒食子酸、苦參堿、氧化苦參堿、巖白菜素、三葉豆紫檀苷對照品適量，精密稱定，加入10%甲醇，制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為2.358、2.056、1.020、1.083、1.010 mg/mL的單一對照品溶液。

2.3.2 混合對照品溶液

分別吸取“2.3.1”項下各單一對照品溶液適量，加入10%甲醇，制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為0.047、0.123、0.122、0.303、0.024 mg/mL 的混合對照品溶液，于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.3.3 供試品溶液

稱取上述單煎凍干粉0.05 g、合煎凍干粉0.1 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入10%甲醇20 mL，密塞，稱重，超聲（功率500 W、頻率40 kHz）處理30 min；放冷，再次稱重，用10%甲醇補足減失的重量，搖勻；取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得各供試品溶液。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 方法學(xué)考察

（1）取“2.3.3”項下合煎凍干粉供試品溶液（編號ZS8），按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，以巖白菜素峰為參照，計算得各共有峰相對保留時間的RSD 為0.23%～1.02%（n＝6），相對峰面積的RSD 為0.19%～1.75%（n＝6），表明方法精密度良好。（2）取“2.2.2”項下合煎凍干粉樣品（編號ZS8），共6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以巖白菜素峰為參照，計算得各共有峰相對保留時間的RSD 為0.04%～0.33%（n＝6），相對峰面積的RSD 為0.99%～2.90%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。（3）取“2.3.3”項下合煎凍干粉供試品溶液（編號ZS8），分別于室溫下放置0、3、6、12、24、48 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以巖白菜素峰為參照，計算得各共有峰相對保留時間的RSD 為0.12%～0.63%（n＝6），相對峰面積的RSD 為0.24%～2.77%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.2 指紋圖譜建立

（1）分別取10 批朱砂根、山豆根單煎凍干粉供試品溶液和合煎凍干粉供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，分別以DZ1、DS1、ZS1為參照圖譜，采用中位數(shù)法，以多點校正進行色譜峰自動匹配，生成對應(yīng)的疊加指紋圖譜和對照圖譜（ZR、SR、ZSR）。結(jié)果顯示，10 批朱砂根單煎凍干粉樣品圖譜中有5個共有峰，10批山豆根單煎凍干粉樣品圖譜中有10個共有峰，10批合煎凍干粉樣品圖譜中有14個共有峰。結(jié)果見圖1。

圖1 單煎凍干粉、合煎凍干粉樣品的HPLC 疊加指紋圖譜及對照圖譜

（2）采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》對朱砂根、山豆根單煎凍干粉和合煎凍干粉樣品的指紋圖譜進行相似度評價。結(jié)果顯示，朱砂根單煎凍干粉、山豆根單煎凍干粉、合煎凍干粉樣品色譜圖與對照圖譜的相似度均大于0.90，表明各樣品質(zhì)量穩(wěn)定。

（3）將朱砂根、山豆根單煎凍干粉供試品溶液和合煎凍干粉供試品溶液（編號DZ1、DS1、ZS1）的圖譜與混合對照品溶液（按“2.1”項下色譜條件進樣測定所得）進行對比，結(jié)果顯示，1～3、8、12號峰來源于朱砂根，4～7、9～14 號峰來源于山豆根；通過保留時間結(jié)合紫外光譜特征，指認3號峰為沒食子酸、4號峰為苦參堿、6號峰為氧化苦參堿、8 號峰為巖白菜素、14 號峰為三葉豆紫檀苷。結(jié)果見圖2。

圖2 單煎凍干粉、合煎凍干粉供試品溶液和混合對照品溶液的HPLC圖

2.4.3 單煎及合煎凍干粉樣品中各化學(xué)成分峰面積的變化

采用SPSS 26軟件，將朱砂根、山豆根單煎凍干粉和合煎凍干粉樣品指紋圖譜共有峰的峰面積進行對比。數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，檢驗水準α＝0.05。結(jié)果顯示，相較于朱砂根單煎凍干粉樣品，合煎凍干粉樣品中1～2號峰顯著升高（P＜0.05）；3、8號峰的峰面積雖有所升高，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。相較于山豆根單煎凍干粉樣本，合煎凍干粉樣品中4～7、9、11 號峰的峰面積均有所降低，其中6 號峰顯著降低（P＜0.05），10、13～14 號峰的峰面積雖有所升高，但組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；朱砂根、山豆根共有的12號峰的峰面積均較單煎凍干粉樣品顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 單煎及合煎凍干粉樣品中各化學(xué)成分峰面積的變化（±s，n＝10）

表2 單煎及合煎凍干粉樣品中各化學(xué)成分峰面積的變化（±s，n＝10）

a：與單煎凍干粉比較，P＜0.05。

峰號成分山豆根單煎凍干粉樣品1234567891 0沒食子酸苦參堿朱砂根單煎凍干粉樣品128.45±61.22 100.65±11.34 1 740.46±65.45氧化苦參堿2 715.23±28.95 891.48±28.91 1 937.68±71.37 5 659.06±19.31巖白菜素10 497.14±44.37 11 12 13 14 58.78±41.93三葉豆紫檀苷峰歸屬朱砂根朱砂根朱砂根山豆根山豆根山豆根山豆根朱砂根山豆根山豆根山豆根朱砂根、山豆根山豆根山豆根433.88±61.47 499.29±36.71 144.26±51.13 88.59±25.27 58.01±30.96 973.21±40.87合煎凍干粉樣品339.11±23.57a 467.70±38.66a 1 960.16±48.47 2 262.67±34.17 844.04±31.11 1 117.72±102.64a 5 609.31±21.63 12 668.95±36.52 411.34±43.02 587.55±30.26 133.93±45.57 107.50±20.36a 71.43±41.15 974.77±60.01

2.5 目標化學(xué)成分的含量測定

2.5.1 專屬性試驗

精密吸取“2.3.2”項下混合對照品溶液、“2.3.3”項下供試品溶液（編號ZS1）和10%甲醇（空白溶液），按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在供試品溶液色譜圖中，在與混合對照品色譜圖相對應(yīng)的位置上均有相同保留時間的色譜峰，空白溶液無干擾。結(jié)果見圖3。

圖3 混合對照品溶液、合煎凍干粉供試品溶液和空白溶液的專屬性HPLC圖

2.5.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.3.1”項下各單一對照品溶液適量，置于同一容量瓶中，加10%甲醇稀釋，得不同質(zhì)量濃度的系列線性溶液。取上述溶液按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，結(jié)果見表3。

表3 沒食子酸等5種成分的回歸方程與線性范圍

2.5.3 精密度試驗

取“2.3.3”項下合煎凍干粉供試品溶液（編號ZS8），按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，沒食子酸、苦參堿、氧化苦參堿、巖白菜素、三葉豆紫檀苷峰面積的RSD 分別為0.19%、0.37%、1.08%、0.18%、0.75%（n＝6），表明方法精密度較好。

2.5.4 重復(fù)性試驗

取合煎凍干粉樣品（編號ZS8）適量，共6 份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并代入標準曲線計算含量。結(jié)果顯示，沒食子酸、苦參堿、氧化苦參堿、巖白菜素、三葉豆紫檀苷含量的RSD 分別為2.10%、2.36%、1.93%、2.90%、2.24%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗

取“2.3.3”項下合煎凍干粉供試品溶液（編號ZS8），分別于室溫下放置0、3、6、12、24、48 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，沒食子酸、苦參堿、氧化苦參堿、巖白菜素、三葉豆紫檀苷峰面積的RSD分別為0.13%、1.18%、2.10%、0.18%、2.33%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗

取合煎凍干粉樣品（編號ZS8），共6 份，每份1.0 g，精密稱定，分別精密加入等量的對照品，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，沒食子酸、苦參堿、氧化苦參堿、巖白菜素、三葉豆紫檀苷的平均加樣回收率分別為102.46%、101.75%、99.56%、99.66%、100.68%，RSD 分別為2.21%、2.42%、1.97%、2.46%、2.78%（n＝6），表明方法準確度良好。

2.5.7 樣品含量測定及轉(zhuǎn)移率計算

取朱砂根、山豆根單煎凍干粉和合煎凍干粉樣品，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并代入標準曲線計算各成分含量，每樣品平行測定2 次。按下式計算轉(zhuǎn)移率：轉(zhuǎn)移率＝每批合煎凍干粉含量/每批單煎凍干粉含量×100%。結(jié)果顯示，10批合煎凍干粉樣品中沒食子酸、苦參堿、氧化苦參堿、巖白菜素和三葉豆紫檀苷的含量分別為0.217 6～0.941 7、0.661 3～3.618 9、0.251 8～3.968 7、3.017 0～8.730 3、0.103 4～0.740 7 mg/g，平均含量分別為0.560 6、2.547 8、1.382 2、5.960 7、0.279 1 mg/g；朱砂根單煎凍干粉樣品中沒食子酸、巖白菜素的含量分別為0.183 5～1.136 1、1.710 4～9.195 3 mg/g，平均含量分別為0.499 3、4.962 6 mg/g；山豆根單煎凍干粉樣品中苦參堿、氧化苦參堿、三葉豆紫檀苷的含量分別為2.401 2～5.334 6、0.201 5～4.890 3、0.098 8～0.480 6 mg/g，平均含量分別為3.046 0、2.336 6、0.278 6 mg/g；沒食子酸、苦參堿、氧化苦參堿、巖白菜素和三葉豆紫檀苷的轉(zhuǎn)移率分別為39.52%～513.19%、25.82%～117.26%、8.87%～198.26%、53.38%～233.83%、47.18%～225.33%。除三葉豆紫檀苷外，合煎后其余成分的平均含量都有不同程度的變化，苦參堿、氧化苦參堿的平均含量均有所降低，其中氧化苦參堿降幅最大。結(jié)果見表4。

表4 沒食子酸等5種成分的含量測定結(jié)果（n＝2，mg/g）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本課題組前期考察了乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-甲酸-水、甲醇-甲酸-水等流動相體系對各待測成分色譜峰的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相時，所得色譜峰信息較為豐富且數(shù)量較多，峰形良好，故選擇乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動相進行梯度洗脫；同時，本課題組進行了200～800 nm 全波長掃描，結(jié)果顯示，以210 nm 為檢測波長時，所得色譜信息豐富且基線相對平穩(wěn)，故選擇檢測波長為210 nm。

3.2 樣品的選擇

本研究以主要產(chǎn)區(qū)和企業(yè)所用原料主要產(chǎn)地的朱砂根-山豆根飲片所配伍的藥對為對象，建立了指紋圖譜并進行了定量分析。從含量測定結(jié)果來看，不同批次樣品中各待測成分的含量波動較大，可能與樣品產(chǎn)地批次及飲片的產(chǎn)地來源、加工方式、干燥方式、貯藏方式等不同有關(guān)，建議可對后續(xù)生產(chǎn)過程中的以上因素進行控制。

3.3 指標成分的選擇

經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，生物堿是山豆根的主要活性成分，以苦參堿和氧化苦參堿為主，具有抗病毒、抗炎、抗菌及抗腫瘤等作用；此外，黃酮類成分也是山豆根的活性成分之一，其主要成分三葉豆紫檀苷具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗心腦血管疾病等作用[7—8]；朱砂根中巖白菜素、沒食子酸具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用[9]。因此，本研究以沒食子酸、苦參堿、氧化苦參堿、巖白菜素、三葉豆紫檀苷為指標成分進行定量分析。

3.4 指紋圖譜與含量測定結(jié)果分析

本研究結(jié)果顯示，10 批朱砂根、山豆根單煎凍干粉和合煎凍干粉樣品圖譜中分別有5、10、14 個共有峰，從合煎凍干粉樣品指紋圖譜中指認了沒食子酸、苦參堿、氧化苦參堿、巖白菜素、三葉豆紫檀苷5個共有峰；從朱砂根單煎凍干粉樣品指紋圖譜中指認了沒食子酸、巖白菜素2個共有峰；從山豆根單煎凍干粉樣品指紋圖譜中指認了苦參堿、氧化苦參堿、三葉豆紫檀苷3個共有峰；三者的相似度均大于0.90，表明不同產(chǎn)地藥材的整體質(zhì)量相對穩(wěn)定。含量測定結(jié)果顯示，10批合煎凍干粉樣品中沒食子酸、苦參堿、氧化苦參堿、巖白菜素和三葉豆紫檀苷的含量分別為0.217 6～0.941 7、0.661 3～3.618 9、0.251 8～3.968 7、3.017 0～8.730 3、0.103 4～0.740 7 mg/g；朱砂根單煎凍干粉樣品中沒食子酸、巖白菜素的含量分別為0.183 5～1.136 1、1.710 4～9.195 3 mg/g；山豆根單煎凍干粉樣品中苦參堿、氧化苦參堿、三葉豆紫檀苷的含量分別為2.401 2～5.334 6、0.201 5～4.890 3、0.098 8～0.480 6 mg/g，提示不同批次樣品中各成分含量存在一定差異；合煎凍干粉中苦參堿、氧化苦參堿的總含量較單煎樣品明顯降低，可能受原藥材產(chǎn)地不同和藥材相互作用的影響。苦參堿、氧化苦參堿的轉(zhuǎn)移率分別為25.82%～117.26%、8.87%～198.26%，轉(zhuǎn)移率相對較低，其原因可能為煎煮時間較長，導(dǎo)致成分發(fā)生了氧化還原反應(yīng)；沒食子酸、巖白菜素、三葉豆紫檀苷的轉(zhuǎn)移率分別為39.52%～513.19%、53.38%～233.83%、47.18%～225.33%，轉(zhuǎn)移率相對較高，其原因可能與合煎過程中各成分的溶解性發(fā)生了變化有關(guān)[10]。有研究表明，生物堿類成分的功效、毒性之間存在一定的量效、量毒關(guān)系[11]，結(jié)合本文結(jié)果提示以生物堿類成分作為質(zhì)控標準，可為朱砂根-山豆根藥對及其制劑的質(zhì)量控制及相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，為質(zhì)量標準建立提供參考依據(jù)。

3.5 配伍前后目標化學(xué)成分的變化及其意義

本研究發(fā)現(xiàn)，藥對配伍后指紋圖譜發(fā)生明顯變化，多數(shù)化學(xué)成分含量增加，個別成分含量降低，可能是因為含生物堿類成分的藥材與含有機酸的藥材共煎時，提高了合煎樣品的轉(zhuǎn)移率，從而影響了沒食子酸的含量；與此同時，合煎凍干粉樣品中苦參堿、氧化苦參堿的平均含量下降，可能與配伍合煎時主要有效成分的溶出相互影響有關(guān)[12]。

綜上所述，所建指紋圖譜及含量測定方法穩(wěn)定、可行，可用于朱砂根、山豆根及朱砂根-山豆根藥對的質(zhì)量控制；朱砂根-山豆根藥對合煎凍干粉樣品中苦參堿、氧化苦參堿的平均含量降低。