海鱸魚(yú)酸性磷酸酶分離純化及其抑制劑虛擬篩選

李園園, 魏天雨, 丁悅艷, 李紅燃, 師丹華, 李穎暢, 李學(xué)鵬

(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧 錦州 121013)

海鱸魚(yú) (Lateolabraxmaculatus)是常見(jiàn)的海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一,因味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而深受?chē)?guó)內(nèi)消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。由于海鱸魚(yú)富含多不飽和脂肪酸和各種氨基酸,在貯藏期間極易腐爛變質(zhì),嚴(yán)重影響其風(fēng)味。酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP,E.C.3.1.3.2)存在于細(xì)胞溶酶體中,是參與風(fēng)味物質(zhì)肌苷酸(inosine 5′-monophosphate,IMP)降解的關(guān)鍵酶[2]。它催化IMP降解,產(chǎn)生次黃嘌呤核苷(hypoxanthine riboside,HxR)和次黃嘌呤(hypoxanthine,Hx)[3],使魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生不愉快的氣味和味道,降低魚(yú)肉食用價(jià)值[4]。已有學(xué)者從麥瑞加拉鯪魚(yú)[5]、鯽魚(yú)[6]、珠貝母[7]、海參[8]中分離純化出了不同分子質(zhì)量(幾十至幾百kDa)的ACP,其米氏常數(shù)(Km)、酶最適反應(yīng)條件各不相同。研究表明,不同水產(chǎn)品中分離得到的ACP結(jié)構(gòu)和特性存在差異。因此,本研究以海鱸魚(yú)為原料分離純化ACP并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。

虛擬篩選技術(shù)是在生物原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)新配體的過(guò)程,也是從大量的化合物中篩選潛在活性化合物的過(guò)程[9]。尚隨錦等[10]基于藥效團(tuán)虛擬篩選和數(shù)據(jù)挖掘技術(shù),篩選天然黃嘌呤氧化酶抑制劑,共得到102個(gè)天然化合物。馬青云等[11]運(yùn)用計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù)尋找新型冠狀病毒水解酶的中藥小分子抑制劑,共獲得66個(gè)化合物。唐彪等[12]基于Discovery Studio 2.5平臺(tái)篩選出轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1蛋白抑制劑,成功從黃芪、丹參、三七中篩選出4種與TGF-β1結(jié)合良好的天然化合物。然而,虛擬篩選技術(shù)用于尋找ACP抑制劑的研究鮮有報(bào)道。

本研究以海鱸魚(yú)肝為對(duì)象,通過(guò)飽和硫酸銨分級(jí)沉淀、陰離子交換柱和葡聚糖凝膠柱層析分離純化ACP,并探究純化后ACP酶學(xué)特性,最后利用Discovery Studio 4.5平臺(tái)分子對(duì)接技術(shù)篩選出潛在抑制劑并探究其對(duì)酶活性的影響,旨在為進(jìn)一步研究酶結(jié)構(gòu)與功能,探究抑制劑對(duì)ACP的抑制機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮海鱸魚(yú),遼寧省錦州市林西水產(chǎn)市場(chǎng);聚乙二醇(聚合度20000)、兒茶素(純度≥97%)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC,純度≥97%)、沒(méi)食子酸(GA,純度≥97%)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG,純度≥97%)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG,純度≥97%),上海源葉生物科技有限公司;Tris-HCl、NaAc-HAc(純度≥99%)、對(duì)硝基苯磷酸鈉(p-NPP,純度≥97%)、對(duì)硝基苯酚(p-NP,純度≥97%),上海麥克林生化科技有限公司;總蛋白濃度考馬斯亮藍(lán)試劑盒,南京建成有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S18-A928型絞肉機(jī),山東九陽(yáng)股份有限公司;SORVALL Stratos型冷凍高速離心機(jī),美國(guó)Thermo公司;UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度儀,蘇州島津儀器有限公司;YC-2型層析柜,上海嘉鵬科技有限公司;HL-2S型數(shù)顯恒流泵、BS-160型自動(dòng)部分收集器,上海滬西分析儀器廠(chǎng);DEAE-Sepharose 型陰離子交換柱,美國(guó)Sigma公司;Sephadex G-200型葡聚糖凝膠柱,美國(guó)Bioruler公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1ACP粗酶提取和酶活力測(cè)定

新鮮海鱸魚(yú),體質(zhì)量(1.84±0.26) kg,體長(zhǎng)(39.78±4.67) cm。將魚(yú)敲頭致死,取肝臟(35±0.3)g,-80 ℃保存,4 ℃解凍30 min放入預(yù)冷的絞肉機(jī)中,絞碎30 s,加入20 mmol/L NaAc-HAc緩沖液(5 mmol/L β-巰基乙醇和20 g/L甘油,pH值 5.0),料液比(g/L)1∶3,在4 ℃層析柜中磁力攪拌1 h,5 000 r/min離心30 min,提取的上清液即為粗酶液[6]。ACP酶活力測(cè)定參考Zhu等[8]的方法,將0.5 mL粗酶液與3 mL 20 mmol/L的NaAc-HAc緩沖液(5 mmol/L β-巰基乙醇,pH值 5.0)混合,再加入0.5 mL 12 mmol/Lp-NPP。將混合物在37 ℃預(yù)熱15 min,并通過(guò)添加0.5 mL 0.1 mol/L NaOH終止反應(yīng)。405 nm處測(cè)量吸光度,計(jì)算釋放p-NP的量。酶活力定義為在該分析條件下1 min產(chǎn)生1 nmol/L P-NP所需的酶量?？偟鞍踪|(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定。

1.3.2ACP的分離純化

1.3.2.1 硫酸銨分級(jí)沉淀

純化倍數(shù)和回收率計(jì)算見(jiàn)式(1)、式(2)。

(1)

(2)

1.3.2.2 陰離子柱純化

陰離子層析柱(1.6 cm×20 cm)用20 mmol/L NaAc-HAc緩沖液(5 mmol/L β-巰基乙醇,pH值 5.0)平衡后,取10 mL酶液上樣,用不同濃度的NaCl(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L)進(jìn)行線(xiàn)性梯度洗脫,流速為0.5 mL/min,每管收集5 mL。收集蛋白質(zhì)含量和酶活力均較高的酶液,透析濃縮,-80 ℃保存,用于后續(xù)進(jìn)一步純化。酶活力和總蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法同1.3.1節(jié)。

1.3.2.3 葡聚糖凝膠柱純化

葡聚糖凝膠層析柱(1.6 cm×80 cm)用20 mmol/L NaAc-HAc緩沖液(5 mmol/L β-巰基乙醇,pH 值5.0)進(jìn)行平衡和洗脫,流速為0.3 mL/min,每管收集5 mL酶液,收集蛋白質(zhì)含量和酶活力均高的酶液,將酶液濃縮后置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。酶活力和總蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法同1.3.1節(jié)。

1.3.2.4 ACP分子質(zhì)量測(cè)定

參考Siddiqua等[5]方法并略做修改,分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%,濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,純化后的ACP蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL,按照體積比1∶4加入5×上樣緩沖液,混勻后煮沸5 min,上樣量為10 μL。電泳儀初始電壓為80 V,40 min后調(diào)為120 V,保持40 min后關(guān)閉電源?？捡R斯亮藍(lán)染色液對(duì)凝膠染色30 min,脫色12 h,觀察結(jié)果。

1.3.3ACP最適溫度和pH值測(cè)定

在20～90 ℃以10 ℃的間隔測(cè)定酶活力,確定了ACP的最適溫度和熱穩(wěn)定性。在pH 值3.0～8.0的反應(yīng)液中測(cè)定酶活力,酶活力測(cè)定方法同1.3.1節(jié)。

1.3.4酶解動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

動(dòng)力學(xué)參數(shù)參考Siddiqua等[5]的方法,略作修改。將純化后的ACP與不同濃度的底物P-NPP(0.1～0.5 mmol/L)等體積混合,黑暗條件下30 ℃反應(yīng)15 min,加入1 mL 0.1 mol/L NaOH終止反應(yīng),室溫靜置10 min后測(cè)定405 nm處吸光度。采用Line-weaver-Burk雙倒數(shù)繪圖法計(jì)算Km和vmax,見(jiàn)式(3)、式(4)。

(3)

(4)

式(3)、式(4)中,v、vmax分別為反應(yīng)速率和反應(yīng)最大速率,μmol/(L·min),Km為米氏常數(shù),mmol/L,[S]為p-NPP的濃度,mmol/L。

1.3.5ACP二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

圓二色譜測(cè)定參考Moradi等[13]方法,并略作修改。ACP的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL,在60 nm/min的掃描速度下,測(cè)定190～250 nm ACP的圓二色譜,以20 mmol/L NaAc-HAc緩沖液(5 mmol/L β-巰基乙醇,pH值5.0)為空白對(duì)照,并計(jì)算樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。

1.3.6基于分子對(duì)接的抑制劑虛擬篩選

參考李穎暢等[14]方法。ACP的晶體結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.rcsb.org/pdb)下載并保存為pdb格式,利用 PyMol 軟件對(duì)ACP進(jìn)行去水、加氫和能量最小化,從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取小分子的2D結(jié)構(gòu),用CHem3D軟件對(duì)小分子進(jìn)行能量最小化,最后采用Discovery Studio 4.5的LibDock和CDOCKER程序?qū)ζ溥M(jìn)行篩選。篩選過(guò)程如下:首先采用LibDock篩選方法與ACP進(jìn)行對(duì)接,然后選取對(duì)接得分大于100的小分子,最后使用CDOCKER程序?qū)⑿》肿优cACP進(jìn)行分子對(duì)接并處理對(duì)接結(jié)果。對(duì)接參數(shù):活性位點(diǎn)半徑20 ?,活性位點(diǎn)XYZ位置(34.85,76.23,83.57),運(yùn)行次數(shù)10次。

1.3.7抑制劑抑制效果分析

取一定量的篩選出的小分子物質(zhì)溶液,加入ACP酶液1 mL(酶活力>600 U/mL,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL),用20 mmol/L NaAc-HAc緩沖液(5 mmol/L β-巰基乙醇,pH 值5.0)稀釋。將小分子物質(zhì)與ACP混合物混勻,4 ℃黑暗中反應(yīng)15 min。酶活力和蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法同1.3.1節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Origin 2019軟件繪圖,所有實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,單因素方差分析差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海鱸魚(yú)肝ACP分離純化結(jié)果

分離純化后海鱸魚(yú)肝ACP酶活力和總蛋白質(zhì)變化見(jiàn)表1。由表1可看出,粗酶的比活力為0.18 U/mg,經(jīng)飽和硫酸銨溶液沉淀后該酶純化了5.94倍,回收率為63.38%。ACP分離純化過(guò)程見(jiàn)圖1。將透析濃縮后的粗酶液上樣置于陰離子交換柱,進(jìn)行鈉鹽梯度洗脫后的結(jié)果見(jiàn)圖1(a)。由圖1(a)可知,該酶有2個(gè)不同的峰,故推測(cè)該酶可能存在同工酶,命名為ACP I和ACP Ⅱ,且ACP Ⅰ含量高。該研究結(jié)果與楊立紅等[15]結(jié)果類(lèi)似,其研究表明刺參內(nèi)臟中ACP經(jīng)過(guò)分離純化后有3個(gè)不同的峰,即在刺參ACP中存在3個(gè)同工酶。經(jīng)DEAE-Sepharose層析柱純化后ACP I和ACP Ⅱ的比活力為3.02、4.86 U/mg,分別純化了16.83、14.33倍,回收率分別為43.07%和50.24%。將濃縮后的2種酶液分別加到葡聚糖凝膠柱中,經(jīng)20 mmol/L NaAc-HAc緩沖液洗脫,分別得到2個(gè)單一的峰[圖1(b)、(c)]。酶液經(jīng)Sephadex G-200凝膠柱過(guò)濾后,ACP I和ACP Ⅱ比活力分別增加至6.57、4.62 U/mg,分別純化了36.50、25.67倍,回收率分別達(dá)到9.96%和6.07%。由于分離純化的ACP I回收率和純化倍數(shù)相對(duì)較高,后續(xù)研究均使用ACP I。

圖1 海鱸魚(yú)肝ACP的分離純化過(guò)程

表1 海鱸魚(yú)肝ACP純化倍數(shù)及回收率

SDS-PAGE結(jié)果如圖1(d)。條帶1表示粗酶,經(jīng)分離純化后,條帶2和3均呈單一條帶,表明ACP I達(dá)到一定純度,且分子質(zhì)量約45 kDa。該研究結(jié)果與高舉等[6]研究鯽魚(yú)中ACP類(lèi)似,鯽魚(yú)ACP分子質(zhì)量為33.3 kDa;Siddiqua等[5]研究麥瑞加拉鯪魚(yú)(淡水魚(yú)類(lèi))ACP,其分子質(zhì)量分別為18、100、130 kDa。ACP不同的原因可能是魚(yú)類(lèi)種類(lèi)不同,生活環(huán)境不同,與淡水魚(yú)相比,海鱸魚(yú)生活水溫接近室溫,鹽度稍高。

2.2 海鱸魚(yú)ACP I最適溫度和pH值分析

純化后ACP I 在不同溫度和pH值時(shí)的活力變化見(jiàn)圖2。由圖2(a)可知,海鱸魚(yú)肝ACP I在30 ℃時(shí)顯示出最高的催化活性,20～40 ℃保持超過(guò)80%的活力,超過(guò)40 ℃后ACP I活力顯著降低且酶的熱穩(wěn)定性也急劇下降(P<0.05),并在70 ℃時(shí)幾乎完全失活。這一結(jié)果與刺參ACP活力的研究結(jié)果基本一致[15]。Kuda等[16]研究發(fā)現(xiàn),鯖魚(yú)ACP在55 ℃加熱10 min后,其活力降低至10%。ACP I最適溫度為30 ℃,這個(gè)結(jié)果低于麥瑞加拉鯪魚(yú)肝中ACP的最適溫度(40 ℃)[5]和草魚(yú)肝臟中ACP的最適溫度(45 ℃)[17]。由圖2(b)可知,海鱸魚(yú)肝ACP I最適pH值為5.0,隨著pH值升高,酶活力顯著降低(P<0.05)。王彩霞等[18]研究了草魚(yú)、魚(yú)、鱔魚(yú)3種淡水魚(yú)中ACP最適pH值分別為5.0、5.8和5.6,而陳素麗等[19]結(jié)果表明文昌魚(yú)ACP的最適pH值為4.5。本研究中ACP I最適溫度和最適pH值結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果存在一定差異,原因是魚(yú)的種類(lèi)不同或魚(yú)的生活環(huán)境不同。

圖2 溫度和pH值對(duì)海鱸魚(yú)肝ACP活力的影響

2.3 ACP I的動(dòng)力學(xué)特性分析

ACP I的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如圖3,底物為P-NPP 時(shí),ACP的Km為0.098 mmol/L,vmax為1.07 μmol/(L·min)。Siddiqua等[5]研究表明,麥瑞加拉鯪魚(yú)肝中ACP對(duì)底物P-NPP的Km為0.25 mmol/L,vmax為1.10 μmol/(L·min)。可能因?yàn)锳CP來(lái)自不同類(lèi)型魚(yú)類(lèi)的魚(yú)肝,酶的動(dòng)力學(xué)特性存在一定差異。

圖3 海鱸魚(yú)肝ACP I的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.4 海鱸魚(yú)ACP I二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圓二色譜可以反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[20]。海鱸魚(yú)肝ACP I二級(jí)結(jié)構(gòu)中,α-螺旋的含量為14.10%,β-折疊的含量為35.90%,β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的含量分別為18.20%和32.60%。β-折疊的含量較高,說(shuō)明ACP二級(jí)結(jié)構(gòu)中肽鏈之間交替分布,形成穩(wěn)定構(gòu)象。Moradi等[21]研究表明:在ACP二級(jí)結(jié)構(gòu)中,α-螺旋的含量10.8%,β-折疊的含量30.2%,β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的含量分別為17.6%和41.4%,與本研究結(jié)果基本一致。

2.5 海鱸魚(yú)ACP抑制劑虛擬篩選結(jié)果

采用Discovery Studio 4.5的CDOCKER程序進(jìn)行海鱸魚(yú)ACP抑制劑的虛擬篩選,結(jié)果如表2。篩選出5個(gè)ACP抑制劑(兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯),ACP與它們相互作用的能量分別是-171.473、-198.309、-140.189、-221.409、-256.647 kJ/mol。對(duì)虛擬篩選后的5個(gè)化合物進(jìn)行ACP活性抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表2 ACP抑制劑虛擬篩選結(jié)果

2.6 抑制劑對(duì)ACP活性的影響

不同抑制劑對(duì)ACP活性的影響見(jiàn)圖4。兒茶素濃度小于等于0.4 mmol/L時(shí),ACP的相對(duì)酶活均為65%左右,無(wú)明顯差異;當(dāng)兒茶素濃度在0.6～1.0 mmol/L時(shí),ACP的相對(duì)酶活顯著性下降(P<0.05),說(shuō)明兒茶素抑制ACP具有濃度依賴(lài)性,且兒茶素濃度為 1.0 mmol/L 時(shí),ACP 的相對(duì)酶活是 39.74%,經(jīng)線(xiàn)性擬合兒茶素抑制ACP的IC50為0.76 mmol/L。隨著EGC、GA、ECG和EGCG濃度升高,ACP的相對(duì)酶活均顯著下降(P<0.05),說(shuō)明EGC、GA、ECG和EGCG抑制ACP活性具有濃度依賴(lài)性;當(dāng)EGC、GA、ECG和EGCG濃度均為1.0 mmol/L時(shí),ACP 的相對(duì)酶活分別是 31.49%、34.76%、29.76%、30.76%,EGC、GA、ECG和EGCG抑制ACP的IC50分別是0.47、0.80、0.44、0.45 mmol/L。Siddiqua等[5]選取金屬化合物和有機(jī)物探究對(duì)麥瑞加拉鯪魚(yú)肝ACP活性的抑制作用,結(jié)果表明Ca2+和Mn2+不會(huì)降低ACP活性,其相對(duì)酶活為97%、82%;ACP活性不受甲醇、乙醇和甘油的影響;而酒石酸鹽可以降低ACP活性,相對(duì)酶活是6%;而氟化物使ACP相對(duì)酶活降低至40%。相比于化學(xué)類(lèi)抑制劑,天然多酚類(lèi)化合物具有為安全、低毒、高效等特點(diǎn)。多酚抑制ACP相對(duì)酶活在40%,抑制強(qiáng)度和氟化物類(lèi)似。因此,可以推測(cè)篩選出的5個(gè)多酚抑制劑均能有效抑制ACP活性,且濃度越大,抑制效果越好。

不同字母表示同種抑制劑不同濃度時(shí)數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.7 抑制劑與ACP的分子對(duì)接分析

篩選的抑制劑與ACP的分子對(duì)接結(jié)果如圖5。由圖5(a)可知,兒茶素與ACP相互作用的主要氨基酸是天冬氨酸(Asp)和精氨酸(Arg)等,與這2種氨基酸形成2個(gè)氫鍵,鍵長(zhǎng)分別是1.95、2.61 ?。EGC與ACP相互作用的主要氨基酸有甘氨酸(Gly)、Arg、蛋氨酸(Met)和谷氨酰胺(Gln)等,其中與Gly、Arg、Met和Gln共形成7個(gè)氫鍵,鍵長(zhǎng)分別是2.02、2.03、1.89、3.01、2.95、2.01、2.72 ?[圖5(b)]。由圖5(c)可知,GA與ACP相互作用的主要氨基酸是Gly、Met和Arg等,其中與Gly、Met形成了2個(gè)氫鍵,鍵長(zhǎng)分別是2.16、2.68 ?。由圖5(d)可知,ECG與ACP相互作用的主要氨基酸有Arg、Met、Gln、蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)和丙氨酸(Ala)等,其中與Arg、Met、Gln、Thr、Val和Ala形成了9個(gè)氫鍵,鍵長(zhǎng)分別是2.41、2.01、2.29、2.47、2.63、2.42、2.06、2.03 ?。EGCG與ACP相互作用的主要氨基酸有Yhr、Arg、Gly和Met等,其中與Yhr、Arg、Gly和Met形成了8個(gè)氫鍵,鍵長(zhǎng)分別是2.42、1.87、4.52、2.39、2.22、2.27、1.97、2.17 ?[圖5(e)]。兒茶素、EGC、GA、ECG和EGCG與ACP相互作用除了氫鍵外,還有疏水相互作用。而已有研究表明大分子與小分子之間的相互作用方式是氫鍵和范德華力。Moradi等[21]研究發(fā)現(xiàn)腐胺與ACP相互作用是氫鍵和范德華力。原因是多酚類(lèi)化合物和腐胺二者結(jié)構(gòu)不同,導(dǎo)致與ACP相互作用力不同。步營(yíng)等[22]采用分子對(duì)接技術(shù)從食品原料(蝦夷扇貝)中篩選具有抗2019新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)能力的生物活性肽段,二者之間相互作用方式也是氫鍵和范德華力。

圖5 抑制劑與ACP分子對(duì)接結(jié)果

3 結(jié) 論

粗酶液經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀后,純化了5.94倍,回收率為63.38%,經(jīng)DEAE-Sepharose離子交換柱和Sephadex G-200凝膠層析后,得到2種ACP,即ACP I和ACP Ⅱ。ACP I經(jīng)純化后比活力6.57 U/mg,純化了36.50倍,回收率為9.96%。ACP Ⅱ比活力為4.62 U/mg,純化了25.67倍,回收率為6.07%。由于ACP I回收率和純化倍數(shù)相對(duì)較高,對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。ACP I最適溫度為30 ℃,最適pH 值為5.0; ACP I的Km為0.098 mmol/L,vmax為1.07 μmol/(L·min)。ACP I的 α-螺旋含量14.10%,β-折疊含量35.90%,β-轉(zhuǎn)角含量18.20%,無(wú)規(guī)則卷曲含量32.60%。通過(guò)虛擬篩選技術(shù)篩選出5個(gè)潛在多酚類(lèi)化合物可作為ACP抑制劑;多酚類(lèi)物質(zhì)與ACP的主要作用力為氫鍵和疏水作用。在一定濃度范圍內(nèi)(0～1.0 mmol/L),5個(gè)多酚化合物均能有效降低ACP活性,且濃度越大抑制效果越好,兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯抑制酶活性的IC50分別是0.76、0.47、0.80、0.44、0.45 mmol/L。