枯草芽孢桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效合成D-阿洛酮糖

胡揚(yáng)帆, 王雨露, 費(fèi)康清, 俞姝瑤, 高雅慧, 李子杰,*

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院/糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122)

稀少糖是指在自然界中含量極低且具有重要生理功能的一類(lèi)單糖及其衍生物[1]。D-阿洛酮糖是稀少糖的一種,具有蔗糖甜度的70%,但產(chǎn)生的能量?jī)H有其0.3%[2],因此被視為一種新型甜味劑,并于2014年獲得美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)為一般認(rèn)為安全(generally recognized as safe,GRAS)食品[3]。除此以外,D-阿洛酮糖還具有多種生理功能,能夠有效用于肥胖癥[4]、糖尿病[5]、高血脂[6]等疾病的預(yù)防和治療,同時(shí)還具有抗炎[7]、抗氧化[8]、防治神經(jīng)組織退化[9]和動(dòng)脈粥樣硬化[10]等潛在功能,因此在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

現(xiàn)階段,合成D-阿洛酮糖的方法主要有化學(xué)法[11-12]和酶催化合成法[13-15]?；瘜W(xué)法合成D-阿洛酮糖由于具有步驟煩瑣、效率低、對(duì)環(huán)境不友好的劣勢(shì)在工業(yè)實(shí)際生產(chǎn)上受到制約[16]。相比之下,經(jīng)濟(jì)環(huán)保且易于產(chǎn)物分離純化的生物酶法備受青睞。酶法合成D-阿洛酮糖主要是依靠D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶(D-allulose 3-epimerase,DAEase)催化D-果糖在C3位發(fā)生異構(gòu)化實(shí)現(xiàn)的,目前已報(bào)道的DAEase約有30種,平衡轉(zhuǎn)化率基本處于24%～33%[17]。然而,傳統(tǒng)酶法存在酶純化步驟煩瑣與產(chǎn)物分離困難等弊端,制約了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。近年來(lái),利用全細(xì)胞制劑[18]合成目標(biāo)產(chǎn)物由于具有成本低、操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)物易分離、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)備受人們關(guān)注。枯草芽孢桿菌作為公認(rèn)的GRAS菌株,是用作全細(xì)胞制劑宿主的極佳選擇[19]。Patel等[20]從熱水生境宏基因組中挖掘出具有催化D-果糖異構(gòu)化D-阿洛酮糖活性的新型DAEase基因(DaeM),并利用枯草芽孢桿菌重組全細(xì)胞在20 h內(nèi)催化500 g/L D-果糖轉(zhuǎn)化合成150 g/L D-阿洛酮糖; Hu[21]在枯草芽孢桿菌中異源表達(dá)了ClostridiumscindensATCC 35704來(lái)源的DAEase,通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件,重組全細(xì)胞在450 g/L底物存在下催化反應(yīng)8 h可達(dá)到28.45%的最大平衡轉(zhuǎn)化率。

目前,D-阿洛酮糖的相關(guān)研究主要集中于DAEase新酶挖掘、分子改造以及固定化,對(duì)于全細(xì)胞工藝的研究相對(duì)不多。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期挖掘的Caballeroniainsecticola來(lái)源的dae基因[22]為研究對(duì)象,通過(guò)啟動(dòng)子優(yōu)化策略[23]實(shí)現(xiàn)了在生產(chǎn)安全菌株枯草芽孢桿菌WB800中的高效異源表達(dá),然后利用全細(xì)胞制劑制備D-阿洛酮糖并探究了全細(xì)胞催化的較優(yōu)條件,實(shí)現(xiàn)了D-阿洛酮糖的高效制備,同時(shí)免去了復(fù)雜的酶純化工藝與產(chǎn)物分離工序,進(jìn)一步降低了工業(yè)生產(chǎn)成本。本研究旨在開(kāi)發(fā)一種安全高效的全細(xì)胞制劑,建立簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的生物催化方法,為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)D-阿洛酮糖提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌株和質(zhì)粒

本研究中所使用的發(fā)酵菌株為枯草芽孢桿菌WB800,保藏于本實(shí)驗(yàn)室;大腸桿菌XL10-Gold用于質(zhì)粒構(gòu)建和擴(kuò)增,保藏于本實(shí)驗(yàn)室;質(zhì)粒pP43NMK用于D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶表達(dá)載體的構(gòu)建,質(zhì)粒pMA0911用于啟動(dòng)子PHpaII的擴(kuò)增,均保藏于本實(shí)驗(yàn)室。本研究中所使用的引物見(jiàn)表1。

表1 重組質(zhì)粒構(gòu)建中使用的引物序列

1.1.2酶和試劑

BamHI、KpnI、PstI限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、dNTPs、蛋白Marker(Blue Plus II)、DNA Marker(1 kb plus),寶生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒抽提及純化試劑盒、抗生素,生工生物工程(上海)股份有限公司;One Step Cloning Kit一步法克隆試劑盒,天霖生物科技無(wú)錫有限公司;一抗Anti-His-mouse、二抗Anti-Mouse-HRP,全式金生物技術(shù)有限公司;D-果糖、D-阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)品等其他試劑,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;硫酸鋅、硫酸鎳、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鈷、硫酸錳、硫酸銅、硫酸亞鐵,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基:酵母提取物1 g,胰蛋白胨2 g,氯化鈉2 g,瓊脂粉4 g,加蒸餾水至200 mL,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min(不加瓊脂粉的為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基)。

TB培養(yǎng)基:酵母提取物24 g,胰蛋白胨12 g,KH2PO42.31 g,K2HPO412.54 g,甘油4 mL,無(wú)機(jī)鹽離子與營(yíng)養(yǎng)成分于121 ℃下分開(kāi)滅菌20 min,于超凈臺(tái)內(nèi)混合配制,并用蒸餾水定容至1 000 mL。

培養(yǎng)基中添加的抗生素質(zhì)量濃度分別為氨芐青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL。

1.2 儀器與設(shè)備

T100TM型PCR儀,美國(guó)伯樂(lè)公司;HYL-A型恒溫?fù)u床,江蘇太倉(cāng)強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;PAC300型電泳儀/Bio-Rad Power,美國(guó)伯樂(lè)公司;ACQUITY Arc型高效液相色譜系統(tǒng),美國(guó)Waters科技有限公司,配置Waters 2414示差檢測(cè)器,Sugar-PakTM分析柱(300 mm×6.5 mm) ;TS100型恒溫混勻儀,杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1不同啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的構(gòu)建

來(lái)源于C.insecticola的dae基因(GenBank登錄號(hào):BAN26336.1)為本實(shí)驗(yàn)室此前挖掘[22],根據(jù)枯草芽孢桿菌的偏好性對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化,并交由天霖生物科技無(wú)錫有限公司合成。根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物(表1),對(duì)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,插入至pP43NMK載體的KpnI、PstI酶切位點(diǎn)之間,得到重組質(zhì)粒pP43NMK-P43-dae。測(cè)序結(jié)果由蘇州金唯智生物科技有限公司提供,以驗(yàn)證重組質(zhì)粒是否成功構(gòu)建。

以枯草芽孢桿菌WB168基因組為模板,用表中所列引物F/R擴(kuò)增出含有PylbP與PlytR啟動(dòng)子序列的片段及對(duì)應(yīng)dae基因片段;以pMA0911質(zhì)粒載體為模板,擴(kuò)增出PHpaII啟動(dòng)子及對(duì)應(yīng)dae基因片段,利用一步法克隆試劑盒,替換pP43NMK-P43-dae重組質(zhì)粒上BamHI和PstI酶切位點(diǎn)間的P43-dae片段。

1.3.2重組菌的構(gòu)建、培養(yǎng)和表達(dá)

將成功構(gòu)建的不同啟動(dòng)子介導(dǎo)的重組質(zhì)粒按照Spizizen法[24]分別轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB800中得到重組表達(dá)菌株WB800/pP43NMK-P43-dae、WB800/pP43NMK-PHpaII-dae、WB800/pP43NMK-PylbP-dae和WB800/pP43NMK-PlytR-dae,然后接種至5 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素),經(jīng)37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜后,以2%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的50 mL TB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中,繼續(xù)培養(yǎng)約15 h,5 000 r/min條件下收集菌體,用適量的50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液進(jìn)行重懸,加入5×SDS,加熱煮沸10 min,15 000 r/min離心10 min后獲取樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),并利用考馬斯亮藍(lán)染色法和免疫印跡法(Western blotting)對(duì)蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分析。

1.3.3D-果糖和D-阿洛酮糖的定量檢測(cè)

采用HPLC對(duì)全細(xì)胞反應(yīng)中的底物D-果糖和產(chǎn)物D-阿洛酮糖進(jìn)行定量檢測(cè)分析。色譜柱為Sugar-PakTM分析柱(300 mm×6.5 mm),流動(dòng)相為500 mg/L EDTA鈣鹽,流速為0.5 mL/min,檢測(cè)器為示差檢測(cè)器,柱溫為80 ℃,進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.4全細(xì)胞制劑催化活性的驗(yàn)證

經(jīng)Western blotting驗(yàn)證后的菌液在5 000 r/min條件下離心10 min,收集菌體并洗滌3次,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?00 g/L的D-果糖和終質(zhì)量濃度為50 g/L的重組全細(xì)胞制劑加入至50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)緩沖體系中,于37 ℃、800 r/min條件下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后,15 000 r/min條件下離心收集上清,經(jīng)適當(dāng)稀釋后通過(guò)0.22 μm的濾膜進(jìn)行除雜,用HPLC檢測(cè)產(chǎn)物是否產(chǎn)生。

1.3.5全細(xì)胞搖瓶培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

重組菌株WB800/pP43NMK-PylbP-dae接種至5 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃下過(guò)夜培養(yǎng),次日以2%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的50 mL TB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),于不同時(shí)間點(diǎn)取等量的濕細(xì)胞,測(cè)定并比較37 ℃下全細(xì)胞在2 h內(nèi)催化200 g/L D-果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率。

1.3.6全細(xì)胞催化合成D-阿洛酮糖的條件優(yōu)化

1.3.6.1 溫度和pH值對(duì)全細(xì)胞催化合成D-阿洛酮糖的影響

在不同設(shè)定溫度(30～80 ℃)下探究溫度對(duì)全細(xì)胞催化效率的影響,反應(yīng)在含有200 g/L D-果糖及5 mmol/L Mg2+的50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液體系中進(jìn)行,濕細(xì)胞添加量設(shè)定為50 g/L,反應(yīng)時(shí)間為1 h。

更換不同pH值的50 mmol/L緩沖液(PBS緩沖液pH值為6.0～7.0;Tris-HCl緩沖液pH值為7.0～9.0;Glycine-NaOH緩沖液pH值為9.0～11.0),對(duì)全細(xì)胞反應(yīng)的較適pH值進(jìn)行探究,反應(yīng)在65 ℃條件下進(jìn)行。采用相對(duì)活性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行表征。相對(duì)活性定義:在較適條件下將測(cè)得的全細(xì)胞催化最高酶活力定義為100%,其他條件下所測(cè)得值與之比值即為相對(duì)活性。

1.3.6.2 金屬離子對(duì)全細(xì)胞催化合成D-阿洛酮糖的影響

在酶促反應(yīng)過(guò)程中,金屬離子通常對(duì)于底物與酶的結(jié)合及穩(wěn)定中間體構(gòu)象的生成有著重要作用[25]。目前報(bào)道的DAEase均具有金屬依賴性,因此金屬離子的添加對(duì)于全細(xì)胞催化有著頗為重要的意義。通過(guò)添加不同金屬離子(Zn2+、Ni2+、Ca2+、Mg2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+)并優(yōu)化其較適濃度,探究其對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響,反應(yīng)在65 ℃、pH=9.5的條件下進(jìn)行。采用相對(duì)活性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行表征。

1.3.6.3 細(xì)胞濃度對(duì)全細(xì)胞催化合成D-阿洛酮糖的影響

以不同濕細(xì)胞質(zhì)量濃度(10、20、30、40、50、60、80、100 g/L)進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng),測(cè)定全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-阿洛酮糖的量。反應(yīng)體系為65 ℃,pH=9.5,5 mmol/L Mg2+。采用相對(duì)活性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行表征。

1.3.6.4 全細(xì)胞的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性的測(cè)定

取40 g/L的濕細(xì)胞,在不同溫度(45、55、65、75 ℃)下預(yù)處理0～6 h,以未預(yù)處理樣品作為對(duì)照,不同時(shí)刻下取樣并在所得的較適條件下反應(yīng)1 h,測(cè)定其殘余活性以表征其熱穩(wěn)定性;在不同pH值條件下于4 ℃預(yù)處理2 h,以未作預(yù)處理樣品作為對(duì)照,測(cè)定其殘余活性以表征其pH值穩(wěn)定性。

1.3.6.5 優(yōu)化條件下全細(xì)胞催化D-果糖合成D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

采用pH=9.5的Gly-NaOH緩沖液分別配制100、300、500 g/L D-果糖溶液,分別檢測(cè)較適條件下全細(xì)胞制劑催化不同濃度D-果糖合成D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化,計(jì)算反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同啟動(dòng)子重組菌的構(gòu)建和表達(dá)結(jié)果

按1.3.1節(jié)所述方法擴(kuò)增出C.insecticola來(lái)源的dae基因片段,插入到pP43NMK載體的KpnI、PstI酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建重組質(zhì)粒pP43NMK-P43-dae。然后,分別擴(kuò)增出兩端含有同源臂的組成型啟動(dòng)子PHpaII、PylbP、PlytR片段和相應(yīng)dae片段,利用一步法克隆試劑盒構(gòu)建得到相應(yīng)重組質(zhì)粒pP43NMK-PHpaII-dae、pP43NMK-PylbP-dae和pP43NMK-PlytR-dae,同時(shí)以未異源表達(dá)dae基因的pP43NMK質(zhì)粒載體作為對(duì)照,分別轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB800中進(jìn)行表達(dá),見(jiàn)圖1。通過(guò)SDS-PAGE[圖1(a)]和Western blotting[圖1(b)]檢測(cè)不同啟動(dòng)子介導(dǎo)下DAEase在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。結(jié)果表明,檢測(cè)到的蛋白質(zhì)條帶大小與理論值(33.6 kDa)基本一致,其中PylbP啟動(dòng)子介導(dǎo)下DAEase表達(dá)水平較高。

圖1 不同啟動(dòng)子介導(dǎo)的重組DAEase的表達(dá)水平

2.2 全細(xì)胞制劑催化活性的驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)重組枯草芽孢桿菌的全細(xì)胞催化性能進(jìn)行驗(yàn)證,檢測(cè)其是否具備轉(zhuǎn)化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的能力,見(jiàn)圖2。通過(guò)HPLC分別對(duì)D-果糖、D-阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)品以及全細(xì)胞反應(yīng)的上清液進(jìn)行分析,HPLC結(jié)果見(jiàn)圖2(a)～(c)。這表明枯草芽孢桿菌內(nèi)異源表達(dá)的DAEase表現(xiàn)出了對(duì)D-果糖的催化活性,能夠生成D-阿洛酮糖產(chǎn)物。

圖2 HPLC驗(yàn)證全細(xì)胞催化活性

2.3 全細(xì)胞搖瓶培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

將種子液以2%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮TB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),于不同時(shí)間點(diǎn)收獲等量的菌體,用于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),比較不同時(shí)刻所收集的全細(xì)胞2 h內(nèi)催化D-果糖合成D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率,見(jiàn)圖3。結(jié)果表明,搖瓶培養(yǎng)15 h左右時(shí)所收獲的全細(xì)胞用于催化合成D-阿洛酮糖可以獲得較高的轉(zhuǎn)化率。因此,選擇搖瓶培養(yǎng)15 h所收獲的全細(xì)胞用于后續(xù)全細(xì)胞反應(yīng)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖3 全細(xì)胞搖瓶培養(yǎng)時(shí)間對(duì)D-果糖轉(zhuǎn)化率的影響

2.4 枯草芽孢桿菌WB800/pP43NMK-PylbP-dae重組全細(xì)胞反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.4.1溫度對(duì)全細(xì)胞催化酶活力及穩(wěn)定性的影響

溫度是影響全細(xì)胞催化效率最重要的因素之一,較高的反應(yīng)溫度可以使得生產(chǎn)過(guò)程中在維持高催化效率的同時(shí)降低染菌的可能。目前,已報(bào)道的DAEase在催化反應(yīng)中的較適溫度的范圍為40～70 ℃。因此,探究了溫度對(duì)全細(xì)胞合成D-阿洛酮糖的影響,見(jiàn)圖4。結(jié)果表明,全細(xì)胞反應(yīng)的較適溫度為65 ℃,當(dāng)溫度超過(guò)65 ℃后,酶活力迅速下降,75 ℃條件下全細(xì)胞酶活力僅為較適溫度下酶活力的10%[圖4(a)]。此外,研究了溫度對(duì)全細(xì)胞穩(wěn)定性的影響,由圖4(b)結(jié)果可見(jiàn),65 ℃以下溫度預(yù)處理1 h幾乎不會(huì)對(duì)全細(xì)胞酶活力造成損失,并且6 h后依舊能保持50%以上的相對(duì)酶活;溫度提高至75 ℃時(shí),全細(xì)胞酶活性迅速下降,預(yù)處理僅半小時(shí)的全細(xì)胞活性完全喪失。

圖4 溫度對(duì)全細(xì)胞合成D-阿洛酮糖的影響

2.4.2pH值對(duì)全細(xì)胞催化酶活力及穩(wěn)定性的影響

在D-果糖異構(gòu)化D-阿洛酮糖的反應(yīng)中,較適pH值一般為7.0～9.0,少數(shù)DAEase呈現(xiàn)出偏弱酸性的較適pH值。因此,探究了不同pH值對(duì)全細(xì)胞合成D-阿洛酮糖的影響,見(jiàn)圖5。結(jié)果表明,全細(xì)胞催化反應(yīng)的較適pH值為9.5[圖5(a)],且當(dāng)pH值處于9.0～11.0的堿性條件下時(shí),全細(xì)胞普遍呈現(xiàn)出較高水平的酶活力,這表明該來(lái)源的DAEase對(duì)較高的pH值具有偏好性。此外,探究了pH值在6.0～10.0的DAEase全細(xì)胞的穩(wěn)定性,結(jié)果表明pH值在6.0～10.0條件下預(yù)處理2 h對(duì)DAEase的酶活力基本沒(méi)有影響,殘余酶活力始終能夠保持在90%以上,結(jié)果見(jiàn)圖5(b)。

圖5 pH值對(duì)全細(xì)胞合成D-阿洛酮糖的影響

2.4.3金屬離子對(duì)全細(xì)胞催化合成D-阿洛酮糖的影響

目前已報(bào)道的大多數(shù)D-塔格糖 3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose 3-epimerase,DTE)家族酶均具有較強(qiáng)的金屬依賴性,相似地,金屬離子對(duì)于C.insecticola來(lái)源的DAEase在催化過(guò)程中也有著重要作用,圖6中與對(duì)照相比,Mg2+、Co2+和Mn2+對(duì)DAEase的活性具有一定的促進(jìn)作用,其中Mn2+提升效果較強(qiáng),而Zn2+、Cu2+的存在極大地抑制了酶活性,見(jiàn)圖6(a)。由于Co2+和Mn2+均屬于重金屬鹽,考慮到合成的D-阿洛酮糖普遍用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域,選擇Mg2+作為較適金屬離子。進(jìn)一步地,改變Mg2+的濃度(0～20 mmol/L),以探究較適Mg2+添加量,見(jiàn)圖6(b),最終確定5 mmol/L Mg2+用于全細(xì)胞催化為宜。

圖6 金屬離子對(duì)全細(xì)胞合成D-阿洛酮糖的影響

2.4.4細(xì)胞濃度對(duì)全細(xì)胞催化合成D-阿洛酮糖的影響

全細(xì)胞催化的本質(zhì)是胞內(nèi)酶的催化,不同的細(xì)胞濃度代表了不同的酶添加量。為滿足實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中生產(chǎn)效率的需要,同時(shí)相應(yīng)地降低生產(chǎn)成本,對(duì)全細(xì)胞反應(yīng)體系中的細(xì)胞濃度進(jìn)行優(yōu)化。在較適反應(yīng)條件下,利用不同濃度的濕細(xì)胞(10～100 g/L)生產(chǎn)D-阿洛酮糖,測(cè)定其相對(duì)酶活力,結(jié)果見(jiàn)圖7。著細(xì)胞濃度的提升,全細(xì)胞體系酶活力也不斷增加,細(xì)胞濃度達(dá)到40 g/L后,酶活力基本沒(méi)有明顯的提升。因此,結(jié)合考慮全細(xì)胞催化活性以及成本因素,選擇40 g/L細(xì)胞用量作為全細(xì)胞較適添加量。

圖7 細(xì)胞濃度對(duì)全細(xì)胞合成D-阿洛酮糖的影響

2.4.5全細(xì)胞催化不同濃度D-果糖合成D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率

分別以100、300、500 g/L的D-果糖溶液作為底物,在40 g/L細(xì)胞量、5 mmol/L Mg2+存在的條件下于65 ℃進(jìn)行催化反應(yīng),不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣,測(cè)定其轉(zhuǎn)化率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知,果糖底物濃度為100 g/L時(shí),1 h反應(yīng)達(dá)到平衡,轉(zhuǎn)化率為31.43%;果糖底物質(zhì)量濃度為300 g/L時(shí),2 h反應(yīng)達(dá)到平衡,轉(zhuǎn)化率為30.83%;果糖底物質(zhì)量濃度提高至500 g/L時(shí),4 h反應(yīng)基本達(dá)到平衡,轉(zhuǎn)化率為30.06%,并于 5 h 后不再變化,平衡轉(zhuǎn)化率為30.57%。相比較目前已報(bào)道的全細(xì)胞催化D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化水平[20-21],重組C.insecticola來(lái)源DAEase表現(xiàn)出了良好的轉(zhuǎn)化水平,同時(shí)較短的反應(yīng)平衡時(shí)間表明該重組菌具有在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的潛力。

3 結(jié) 論

本研究以枯草芽孢桿菌WB800作為表達(dá)宿主,實(shí)現(xiàn)了C.insecticola來(lái)源DAEase的異源高效表達(dá)。通過(guò)啟動(dòng)子優(yōu)化策略,篩選出能夠?qū)崿F(xiàn)DAEase高效表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子PylbP。以重組菌株WB800-PylbP-dae為研究對(duì)象,首先通過(guò)HPLC確定搖瓶培養(yǎng)15 h時(shí)收集的全細(xì)胞具有較高的催化活性。進(jìn)而通過(guò)優(yōu)化確定了全細(xì)胞體系反應(yīng)的較適條件如下:溫度65 ℃、50 mmol/L Gly-NaOH(pH=9.5)緩沖液、5 mmol/L Mg2+、40 g/L濕細(xì)胞濃度。最后,以500 g/L D-果糖為底物,較適條件下全細(xì)胞轉(zhuǎn)化4 h基本達(dá)到平衡,轉(zhuǎn)化率為30.06%,表明該重組菌株具有成為生產(chǎn)D-阿洛酮糖理想菌株的潛力。

本研究使用全細(xì)胞法合成D-阿洛酮糖,相較于傳統(tǒng)酶法,省去了費(fèi)時(shí)煩瑣的蛋白純化步驟,簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝,降低了生產(chǎn)成本,可為實(shí)現(xiàn)D-阿洛酮糖食品級(jí)生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。此外,為最大限度地發(fā)揮酶的催化活性,縮短生產(chǎn)時(shí)間,同時(shí)降低生產(chǎn)過(guò)程中染菌的風(fēng)險(xiǎn),D-阿洛酮糖的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)中往往伴隨著高溫反應(yīng)。因此進(jìn)一步的研究可以考慮對(duì)該來(lái)源的DAEase酶進(jìn)行分子改造,以更好地發(fā)揮其工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。