致犢牛肺炎A型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及同源性分析

孟 霞，王佳蕓，黃藍(lán)田，朱心儀，郭 佳，張宜輝，尹文兵，劉曉芳，王建輝，李建基，朱國強，王 亨*

（1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009；2.江蘇高校動物重要疫病和重要人獸共患病防控技術(shù)國際合作聯(lián)合實驗室/農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全教育部國際聯(lián)合研究實驗室，江蘇 揚州；3.揚州大學(xué)實驗農(nóng)牧場，江蘇 揚州；4.江蘇省興化市畜牧獸醫(yī)站，江蘇 泰州；5.江蘇省睢寧縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 徐州）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida,Pm）是多種動物的重要病原菌，可感染豬、牛、羊、兔、家禽、野生動物等，也可感染人類，主要侵襲呼吸系統(tǒng)和引發(fā)出血性敗血癥[1]。根據(jù)其莢膜抗原的差異性，多殺性巴氏桿菌可分為A、B、D、E、F 5 種血清型，基于莢膜形成相關(guān)基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD 等的特異性，Townsend 等通過在不同基因位點設(shè)計特異性引物，建立了一種莢膜血清型多重PCR 分型方法[2]。kmt1 基因作為多殺性巴氏桿菌種特異性基因，也被廣泛用于該菌的鑒別[3]。莢膜A型巴氏桿菌是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病綜合征的主要病原之一，主要引發(fā)肺炎癥狀。該病多為散發(fā)，致病菌可經(jīng)消化道和呼吸道感染，存在于病畜的多種組織、體液、分泌物及排泄物中。當(dāng)犢牛處于寒冷、悶熱、潮濕、擁擠、通風(fēng)不良、長途運輸、飼料突變、營養(yǎng)缺乏等情況時，可誘發(fā)該病。此病一旦發(fā)生，傳染快、危害大、死亡率高，常造成犢牛養(yǎng)殖的重大經(jīng)濟損失[4]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)多殺性巴氏桿菌能與造成牛呼吸道綜合征的其他病原，如牛支原體、牛副流感病毒3型等，發(fā)生混合感染，導(dǎo)致疾病的發(fā)病率和死亡率進(jìn)一步升高[5]。目前，疫苗免疫和生物防控是預(yù)防多殺性巴氏桿菌病的主要方法，但Pm 具有多種血清型，且不同血清型交叉保護(hù)力弱，加之抗生素的廣泛使用，耐藥菌株不斷形成，故該病仍在多個地區(qū)流行[6]。研究發(fā)現(xiàn)，中國牛群易感染A、B型巴氏桿菌，常導(dǎo)致肺炎、肺纖維化及出血性敗血癥。其中，犢牛肺炎常由A型巴氏桿菌所致，而成年牛的出血性敗血癥多由B型巴氏桿菌感染[7]。本試驗從江蘇省某養(yǎng)殖場患有呼吸道癥狀的死亡犢牛中，分離鑒定出莢膜A型多殺性巴氏桿菌，并對其遺傳進(jìn)化和部分生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，旨在為臨床防控該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

主要儀器和試劑：PCR 儀和Gel-DocXR 凝膠成像系統(tǒng)購自B?O-RAD 公司；MALD? Biotyper 微生物鑒定系統(tǒng)、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品、甲酸和基質(zhì)溶液購自布魯克公司；Taq 酶和DNA Marker 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物技術(shù)股份有限公司；抗菌藥物藥敏紙片（14 種）購自杭州微生物試劑有限公司；MH 瓊脂購自青島海博生物技術(shù)有限公司；LB 培養(yǎng)基和血瓊脂平板均為實驗室配制。

1.2 方法

1.2.1 多殺性巴氏桿菌的組織分離 （1）病情介紹：江蘇某奶牛養(yǎng)殖場，犢牛自10 月開始陸續(xù)出現(xiàn)呼吸道癥狀，發(fā)病率在10%左右。經(jīng)過治療，治愈率為92.3%。近期氣溫出現(xiàn)驟變，又出現(xiàn)個別犢牛死亡，就診并開展病原診斷。（2）細(xì)菌分離：對死亡犢牛進(jìn)行剖檢，無菌采集肺組織，低溫送至實驗室檢測。無菌采集肺門淋巴結(jié)樣本，接種于含5%綿羊鮮血的瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h。挑取表面光滑、濕潤、邊緣較整齊的半透明、灰白色單菌落，轉(zhuǎn)接于含10%胎牛血清的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)6～8 h 后，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 多殺性巴氏桿菌的質(zhì)譜和 PCR 鑒定（1）質(zhì)譜鑒定：挑取單菌落，涂抹至MALD? 靶板，依次加1 μL 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（BTS），自然干燥，加1 μL 70%的甲酸水溶液，自然干燥，加1 μL 基質(zhì)溶液，自然干燥，然后進(jìn)行質(zhì)譜儀檢測。根據(jù)質(zhì)譜圖，通過與Bio-typer 數(shù)據(jù)庫的特異性指紋圖譜進(jìn)行相關(guān)比對后鑒定微生物。（2）引物的設(shè)計與合成：根據(jù)文獻(xiàn)報道的多殺性巴氏桿菌的種特異性引物序列[2]，由北京擎科生物科技有限公司合成引物（表1）。（3）PCR 擴增體系：PCR 反應(yīng)在25 μL 體系中進(jìn)行，2×Taq 酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物及下游引物各1 μL，模板 DNA 2 μL。擴增程序：95 ℃，5 min；95 ℃，1 min，55 ℃，退火 1 min，72 ℃，延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并掃描照相。

圖1 肺臟和肺門淋巴結(jié)剖檢病變

表1 多殺巴氏桿菌種特異性引物信息

1.2.3 16S rRNA 基因測序和血清型分析 （1）引物合成：用于擴增多殺性巴氏桿菌16S rRNA基因的通用引物，以及文獻(xiàn)報道的多殺性巴氏桿菌血清型鑒定引物[2]，均由北京擎科生物有限公司合成（表2）。（2）PCR 擴增：利用16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為：2×Taq 酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物及下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL。反應(yīng)程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，54 ℃，退火1 min，72 ℃，延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃，延伸10 min。PCR 產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司測序鑒定，確定所分離細(xì)菌為多殺性巴氏桿菌后，再進(jìn)行血清型鑒定。利用5 種莢膜血清分型引物進(jìn)行多重PCR 反應(yīng)，25 μL 反應(yīng)體系為：2×Taq 酶12.5 μL，ddH2O 5.5 μL，5 對上游引物及下游引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL。反應(yīng)程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，55 ℃，退火1 min，72 ℃，延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR擴增產(chǎn)物。（3）系統(tǒng)進(jìn)化樹分析：從GenBank 下載數(shù)據(jù)庫中已有的多殺性巴氏桿菌16S rRNA 全基因序列，利用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 7.0 對上述測序的多殺性巴氏桿菌16S rRNA 全基因序列和下載的序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.2.4 藥物敏感性試驗 利用K-B 法藥敏試驗檢測分離株對常用藥物的敏感性。將細(xì)菌接種于含5%綿羊鮮血的瓊脂平板上，37 ℃ 培養(yǎng) 18～24 h，挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基制備菌懸液，用濁度儀調(diào)整濁度為0.5 麥?zhǔn)蠁挝?，用棉簽在MH 瓊脂表面均勻涂布，使菌液布滿平板，室溫放置5 min 左右。然后將藥敏紙片貼于瓊脂表面，放置15 min 后，于37 ℃ 倒置培養(yǎng)16～18 h，測量抑菌圈直徑。根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLS?）抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（2008 年）進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1 剖檢病變

將肺臟組織進(jìn)行剖檢，可見肺葉腫大，呈暗紅色，發(fā)生肝樣變；肝變部切面粗糙，呈細(xì)小的顆粒狀突起，切面上可見多個膿腫灶（圖1A），鄰近的肺門淋巴結(jié)腫脹、出血（圖1B）。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)特性及形態(tài)觀察

綿羊血瓊脂平板上形成表面光滑、濕潤、邊緣較整齊的半透明灰白色菌落（圖2）。革蘭氏染色后觀察為兩極濃染的革蘭氏陰性短桿菌（圖3）。

圖3 革蘭氏染色鏡檢

2.3 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

將分離菌株的指紋圖譜與Bio-typer 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，該分離菌株被鑒定為多殺性巴氏桿菌（圖4）。

圖4 多殺性巴氏桿菌質(zhì)譜峰圖

2.4 16S rRNA 和莢膜血清型基因多重PCR 擴增結(jié)果

該菌株基于16S rRNA 基因擴增出1 400 bp的特異性目的條帶，并檢測到巴氏桿菌特異性基因kmt1，擴增出460 bp 的特異性目的條帶，確定該菌株為巴氏桿菌菌株。利用多重PCR 方法對所分離的菌株進(jìn)行莢膜血清型鑒定，檢測到莢膜血清型A型（目的條帶為1 044 bp），后經(jīng)測序確定該分離株為A型多殺性巴氏桿菌，命名為YZ01（圖5）。

2.5 16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

分離株16S rRNA 基因序列與GenBank 己發(fā)布的多殺性巴氏桿菌16S rRNA 全基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，YZ01 與A型多殺性巴氏桿菌同源性較近，并與其余4 株巴氏桿菌CQ2、CQ7、Fcf76、Fcf15 形成獨立分支（圖6），表明該菌株與這四株菌株序列同源性較高。

圖6 多殺巴氏桿菌YZ01 株16S rRNA 進(jìn)化樹

2.6 多殺性巴氏桿菌分離株藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果顯示：多殺性巴氏桿菌分離株對林可霉素耐藥，對克林霉素中度敏感，對多西環(huán)素、氟苯尼考、多粘菌素B、慶大霉素、卡那霉素、青霉素、阿莫西林、美羅培南、丁胺卡那、頭孢氨芐、氨芐西林、環(huán)丙沙星12 種抗生素高度敏感（表3）。

表3 藥敏試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

巴氏桿菌是動物呼吸道常見細(xì)菌之一。當(dāng)外界環(huán)境（如季節(jié)更替、溫差等）變化較大時，動物機體免疫力下降，易發(fā)生多殺性巴氏桿菌感染，且多見于犢牛[8]。本研究從江蘇某規(guī)模化奶牛場發(fā)病的犢牛臟器分離到多殺性巴氏桿菌，通過多重PCR 確診為A型多殺性巴氏桿菌。自2008 年國內(nèi)首次報道牛感染A型多殺性巴氏桿菌以來，關(guān)于A型菌株的分離報道逐漸增多[9]。通過16S rRNA 構(gòu)建進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該菌株與之前國內(nèi)報道分離的A型多殺性巴氏桿菌具有較高的同源性，說明A型多殺性巴氏桿菌在江蘇牧場出現(xiàn)流行。藥敏試驗證實，該分離菌對大部分的常用抗生素敏感，可以根據(jù)藥物敏感性試驗，選擇相關(guān)藥物進(jìn)行規(guī)范治療。

研究發(fā)現(xiàn)，牛呼吸道疾病綜合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）在全球范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的發(fā)展[10]。本研究中，從患有呼吸道疾病的犢牛肺門淋巴結(jié)分離鑒定出莢膜A型多殺性巴氏桿菌，其臨床表現(xiàn)為氣喘咳嗽、呼吸困難、肺部有捻發(fā)音；剖檢肺臟可見，病變肺葉腫大，呈暗紅色，發(fā)生肝變，切面粗糙，其伴有多發(fā)性膿腫塊，表明該犢牛發(fā)病已經(jīng)多日，提示牧場需要加強對犢牛的日常管理。對于出現(xiàn)呼吸道癥狀的犢牛，應(yīng)及時進(jìn)行檢查，并根據(jù)發(fā)病的情況進(jìn)行隔離和救治。對環(huán)境加強消毒和生物防控，并注射多殺性巴氏桿菌疫苗，增強免疫力，提高疾病防控水平。

近年來的報道表明，A型多殺性巴氏桿菌正逐漸成為引起B(yǎng)RDC 巴氏桿菌的主要血清型[11]。Dabo 等[12]和Ewers 等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，引起B(yǎng)RDC的巴氏桿菌中，A型多殺性巴氏桿菌發(fā)病率分別為80%和92%。目前，針對巴氏桿菌檢測方法常見有2 種，其中經(jīng)典的分離培養(yǎng)生化鑒定法，條件要求不高，易于操作，但耗時相對長；分子生物學(xué)方法具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，被廣泛用于巴氏桿菌的實驗室快速檢測[13]，其對儀器要求高，人員需要具備一定的專業(yè)知識，但無法拿到病原，無法開展后續(xù)研究如藥敏試驗等。本試驗通過分離、質(zhì)譜鑒定并結(jié)合分子生物學(xué)方法對分離菌株進(jìn)行鑒定，成功分離并鑒定出莢膜A型多殺性巴氏桿菌，為該牧場犢牛呼吸道疾病防控提供依據(jù)。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，本試驗的分離株與其余4 株巴氏桿菌CQ2、CQ7、Fcf76、Fcf15形成獨立分支，說明該菌株與這四株菌株序列同源性較高。高尚等[14]于2021 年分離的兩株A型巴氏桿菌的同源性與海南分離株同源性較高。另研究發(fā)現(xiàn)不同國家的分離株有較高的同源性，故多殺性巴氏桿菌在多國均有流行[15]。此外，在本試驗中分離的犢牛多殺性巴氏桿菌來源于肺門淋巴結(jié)，對于診斷更加可靠，同時采用質(zhì)譜分析，速度提升，可以更好地滿足臨床檢測需要。

據(jù)報道[16]，我國養(yǎng)殖牛的呼吸系統(tǒng)疾病中，引發(fā)出血性敗血癥的巴氏桿菌主要為莢膜B型多殺性巴氏桿菌，A型較少，且目前國內(nèi)用于預(yù)防牛多殺性巴氏桿菌疫苗株均為莢膜血清型B型菌株。本次規(guī)?；翀霭l(fā)生的犢牛肺炎病原來自A型多殺性巴氏桿菌，且與其他的部分報道來自同一主分支，因此有必要開展A型多殺性巴氏桿菌疫苗的研制，對于保障動物養(yǎng)殖健康發(fā)展尤為重要。

綜上，該牧場犢牛肺炎由莢膜血清型A型多殺性巴氏桿菌引起，該研究豐富了國內(nèi)致牛肺炎的多殺性巴氏桿菌的數(shù)據(jù)，也提示目前A型多殺性巴氏桿菌導(dǎo)致的犢牛肺炎需要納入牧場管理。因此，開展牛源多殺性巴氏桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查研究，同時加強生物防控和積極采取預(yù)防措施，對于保護(hù)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義，也為進(jìn)一步推動牛A型多殺性巴氏桿菌疫苗的研發(fā)提供參考。