2D-UPLC-Q/TOF-MS法對替考拉寧未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定

邵伍軍?和燕玲?袁紅露?周雪飛?陳延安?覃玉梅?金美春?楊荷友

摘要：目的 建立一種在線二維超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（2D-UPLC-Q/TOF-MS）分析方法對替考拉寧未知雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)分析。方法 采用在線二維超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法，一維液相進行分離，二維液相脫鹽后進行質(zhì)譜分析，根據(jù)雜質(zhì)精確分子量及其二級質(zhì)譜碎片離子與已知主成分結(jié)構(gòu)碎片離子對比，推導其結(jié)構(gòu)。結(jié)果 該方法采用2D-UPLC-Q/TOF-MS法對替考拉寧未知雜質(zhì)進行鑒定，鑒定雜質(zhì)1為A3-1脫N-乙?；咸烟墙到馕?，雜質(zhì)2為A2-2脫甘露糖降解物。結(jié)論 該方法可以快速地對替考拉寧未知雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定，很好地解決了雜質(zhì)難以制備進行結(jié)構(gòu)解析的難題。

關(guān)鍵詞：在線二維超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（2D-UPLC-Q/TOF-MS）；替考拉寧；未知雜質(zhì)；結(jié)構(gòu)鑒定

中圖分類號：R978文獻標志碼：A

Identify the unknow impurity structures in teicoplanin by 2D- UPLC-Q/TOF-MS

Shao Wu-jun， He Yan-ling， Yuan Hong-lu， Zhou Xue-fei， Chen Yan-an， Qin Yu-mei， Jin Mei-chun， and Yang He-you

（Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co， Ltd.， Taizhou 318000）

Abstract? ? Objective To establish a two dimension-ultra high performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry（2D-UPLC-Q/TOF-MS） method for the structural analysis of unknown impurities in teicolanin. Methods The impurities were separated by 1D-UPLC， the salt was desalted by 2D-UPLC and the impurities were analyzed by Q/TOF-MS. The impurity structures were identified by accurate molecular weight of the impurities and the fragment ions of the mass spectrometry comparing with the fragment ions of the known principal component structure. Results The unknown impurities of teicolanin were identified by 2D-UPLC-Q/TOF-MS method. The impurity 1 was identified as the degradation product of A3-1 removing N-acetylglucosamine， and the impurity 2 was the degradation product of A2-2 removing mannose. Conclusion This method can be used to identify the structure of the unknown impurities in teicolanin， which solves the problem that it is difficult to prepare the impurities for structural analysis.

Key words? ? Two dimension-ultro performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometer （2D-UPLC-Q/TOF-MS）; Teicoplanin; Unknow impurity; Structure identification

替考拉寧是一種糖肽類抗生素，用于嚴重的革蘭陽性菌感染，主要由5個結(jié)構(gòu)相似的化合物A2-1、A2-2、A2-3、A2-4、A2-5組成，其中A2-2為主要組分，占各組分相對含量的40%以上[1-2]。《中國藥典》2020版或《歐洲藥典》10.0中替考拉寧主組分結(jié)構(gòu)見圖1和表1[3-4]。

替考拉寧結(jié)構(gòu)由七肽組成的苷元母核、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、氨基葡萄糖及其側(cè)鏈組成[5]。目前替考拉寧主組分和雜質(zhì)的分析方法有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相-核磁聯(lián)用等。Baran等[6]通過核磁、質(zhì)譜技術(shù)對替考拉寧的5個主成分結(jié)構(gòu)進行了鑒定。Tengattin等[7]通過液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)確定A3-1組分是A2-2水解脫去氨基葡萄糖及其側(cè)鏈而形成。Cometti等[8]通過液相-核磁聯(lián)用及氣相質(zhì)譜技術(shù)對替考拉寧兩個雜質(zhì)R'端的側(cè)鏈進行了結(jié)構(gòu)鑒定。Borghi等[9]等通過制備技術(shù)與核磁對替考拉寧的4個雜質(zhì)進行了結(jié)構(gòu)鑒定。張含智等[10]通過高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜推導了11個具有替考拉寧母核組分和4個脂肪?；?氨基葡萄糖化合物。由于替考拉寧化學組成復雜，通過雜質(zhì)制備進行結(jié)構(gòu)鑒定費時費力，因此建立快速、簡便、準確的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定方法尤為重要。文獻中的一維液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法，由于質(zhì)譜檢測器的特殊性，流動相只能使用易揮發(fā)性鹽或酸，所以一維液相-質(zhì)譜聯(lián)用需更換原液相方法中的流動相為易揮發(fā)鹽或酸，這樣很難確定液相質(zhì)譜方法色譜峰與原液相方法色譜峰的一致性。本文通過在線二維超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法對替考拉寧未知雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定，一維液相使用原液相方法，二維液相使用適合質(zhì)譜檢測器的流動相，檢測結(jié)果既可以與原流動相方法色譜保留時間一一對應，也可以使用高分辨質(zhì)譜結(jié)果對主組分和雜質(zhì)一級、二級質(zhì)譜對比研究，通過一級質(zhì)譜確定其精確質(zhì)荷比，推測其分子式，通過主組分裂解方式推測雜質(zhì)的裂解方式并確定其結(jié)構(gòu)。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

在線二維超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（美國Waters公司），配有Xevo G2-XS Q/TOF-MS四級桿飛行時間質(zhì)譜儀、ACQUITIY UPLC 2D液相系統(tǒng)及Masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Milli-Q Advantage A10 超純水儀（德國Merck公司）。

1.2 主要材料與試劑

色譜級乙腈購自德國Merck公司；質(zhì)譜級甲酸銨、甲酸購自德國Sigma公司；其余試劑均為分析純；替考拉寧（浙江海正藥業(yè)生產(chǎn)，批號2121-S200401）。

1.3 試驗條件

1.3.1 一維色譜條件

色譜柱：ODS Hypersil（4.6 mm×250 mm， 5 ?m）；波長：254 nm；流速2.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20.0 ?L；稀釋劑：水；流動相A：3.0 g/L磷酸二氫鈉溶液（用氫氧化鈉試液調(diào)pH 6.0）/乙腈=9/1，流動相B：3.0 g/L磷酸二氫鈉溶液（用氫氧化鈉試液調(diào)pH 6.0）/乙腈=3/7；梯度洗脫，流動相B的梯度變化： 0～34.50 min：0%～50%；34.50～35.60 min：50%～90%；35.60～40.25 min：90%～90%；40.25～47.15 min：90%～0；47.15～51.00 min：0～0。

1.3.2 二維色譜條件

色譜柱：WATERS ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm ×2.1 mm， 1.7 ?m）；流速：0.5 mL/min；柱溫：45℃；流動相A：0.01 moL/L甲酸銨pH 6.0），流動相B：乙腈；梯度洗脫，流動相B切縫脫鹽后由2%到80%。

1.3.3 質(zhì)譜條件

ESI源；正離子模式；離子源溫度120℃；霧化氣流速900 L/h；霧化氣溫度500℃；毛細管電壓2500 V；錐孔氣流速50 L/h；錐孔電壓60 V；采集范圍100～2500 u；采集模式MSE/MSMS，MSE碰撞能量20～50 eV。

1.3.4 操作步驟

取替考拉寧適量，用稀釋劑制成2 mg/mL替考拉寧溶液，取20 ?L注入一維液相色譜儀，通過一維液相紫外色譜圖確定各峰的出峰位置，分別對各峰進行中心切割，二維液相色譜方法中設(shè)置閥切換時間，將目標峰收集于定量環(huán)中，再通過閥切換將各目標峰從定量環(huán)中反沖至二維色譜柱上分離并脫鹽，最后進入質(zhì)譜進行分析。四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀采用MSE/MSMS采集模式，同時得到一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜。使用軟件通過精確質(zhì)荷比和同位素分布進行元素組成分析，確定分子式，結(jié)合替考拉寧各組分的二級質(zhì)譜信息和未知雜質(zhì)二級質(zhì)譜碎片推導其結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 一維色譜結(jié)果

本實驗采用在線二維超高效液相高分辨質(zhì)譜方法建立了替考拉寧主成分及主要雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的鑒定方法，一維液相中色譜方法為《中國藥典》2020版或《歐洲藥典》10.0[3-4]中替考拉寧有關(guān)物質(zhì)測定方法，一維液相色譜圖見圖2，結(jié)合藥典中替考拉寧相對保留時間，其中A3-1色譜峰保留時間為8.93 min，A2-1a色譜峰保留時間為17.77 min，A2-1b色譜峰保留時間為18.43 min，A2-1色譜峰保留時間為19.56 min，A2-2色譜峰保留時間為20.95 min，A2-3色譜峰保留時間為21.51 min，A2-4色譜峰保留時間為23.59 min，A2-5色譜峰保留時間為24.06 min，雜質(zhì)1色譜峰保留時間為11.95 min，含量為1.61%，雜質(zhì)2色譜峰保留時間為21.85 min，含量為0.65%。

2.2 二維色譜一級質(zhì)譜結(jié)果

根據(jù)一維液相色譜圖，分別對各目標峰進行中心切割，切換至二維液相中脫鹽處理，再進行質(zhì)譜分析。根據(jù)各峰精確質(zhì)荷比及同位素分布，推測其分子式，替考拉寧主成分及2個雜質(zhì)一級質(zhì)譜結(jié)果分析見表2。

2.3 二維色譜二級質(zhì)譜主成分裂解途徑推導

替考拉寧主化學結(jié)構(gòu)由七肽組成的苷元母核、甘露糖、N-乙酰基葡萄糖、氨基葡萄糖及其側(cè)鏈組成，其主成分結(jié)構(gòu)在質(zhì)譜中容易脫甘露糖、N-乙?；咸烟恰被咸烟羌捌鋫?cè)鏈、脫氨產(chǎn)生相應的m/z，同時脫去的糖基易在質(zhì)譜中脫水產(chǎn)生相應的m/z。如 [MA2-2+H]+ m/z為1878.5643；[MA2-2-C5H6N2O4+H]+ m/z為1720.4591（推測結(jié)構(gòu)如圖5）；[MA2-2-氨基葡萄糖及側(cè)鏈+H]+ m/z為1563.3643；[MA2-2-氨基葡萄糖及側(cè)鏈-甘露糖+H]+ m/z為1401.3124；[MA2-2-氨基葡萄糖及側(cè)鏈-甘露糖- N-乙酰基葡萄糖+H]+ m/z為1198.2306；[MA2-2-氨基葡萄糖及側(cè)鏈-甘露糖- N-乙酰基葡萄糖-氨基]+ m/z為1181.1993；[M氨基葡萄糖氨及側(cè)鏈]+ m/z為316.2131；[M葡萄糖氨及側(cè)鏈-H2O]+ m/z為298.2033；[M葡萄糖氨及側(cè)鏈-2H2O]+ m/z為280.1939；298.2033離子烯醇式結(jié)構(gòu)互變?yōu)橥浇Y(jié)構(gòu)m/z為250.1809；[MN-乙?；咸烟荾+ m/z為204.0863；[MN-乙?；咸烟? H2O]+ m/z為186.0754；[MN-乙?；咸烟? 2H2O]+ m/z為168.0680；[MN-乙?；咸烟?N-乙?；?H2O]+ m/z為144.0658；[MN-乙?；咸烟?N-乙?；?2H2O]+ m/z為126.0570。 [MA3-1+H]+ m/z為1563.3555；[MA3-1-甘露糖+H]+ m/z為1401.3124；[MA3-1-甘露糖- N-乙酰基+H]+ m/z為1360.2847；[MA3-1-甘露糖- N-乙?；咸烟?H]+ m/z為1198.2306；[MA3-1-甘露糖- N-乙?；咸烟?氨基]+ m/z為1181.1993；[MN-乙酰氨基葡萄糖]+ m/z為204.0863；[MN-乙酰基葡萄糖- H2O]+ m/z為186.0754；[MN-乙?；咸烟?2H2O]+ m/z為168.0680；[MN-乙?；咸烟?N-乙酰基-H2O]+ m/z為144.0658；[MN-乙?；咸烟?N-胰腺基-2H2O]+ m/z為126.0570。A2-2二級質(zhì)譜圖見圖3，A3-1二級質(zhì)譜圖見圖4，A2-2裂解方式見圖5。

2.4 雜質(zhì)1結(jié)構(gòu)推導

雜質(zhì)1[M+H]+ m/z為1360.2847，推測分子式為C64H55Cl2N7O23，雜質(zhì)1二級質(zhì)譜圖見圖6，從圖中可知雜質(zhì)1主要碎片離子包括m/z 1360.2847， m/z 1198.2306， m/z 1181.1993， m/z 1153.2052，未發(fā)現(xiàn)N-乙?；咸烟恰被咸烟羌捌鋫?cè)鏈的質(zhì)譜信號，其與主成分A3-1的主要碎片離子基本相同，推測為A3-1結(jié)構(gòu)脫N-乙?；咸烟撬a(chǎn)生。其裂解方式為丟失甘露糖產(chǎn)生m/z 1198.2306 的子離子[M雜質(zhì)1-甘露糖+H]+ ；丟失甘露糖和氨基產(chǎn)生 m/z 1181.1993的子離子[M雜質(zhì)1-甘露糖-氨基]+；丟失甘露糖和乙?；a(chǎn)生m/z 1153.2052的子離子 [M雜質(zhì)1-甘露糖-乙酰基]+。推測雜質(zhì)1結(jié)構(gòu)如圖7。

2.5 雜質(zhì)2結(jié)構(gòu)推導

雜質(zhì)2[M+H]+ m/z為1716.5077，推測分子式為C82H87Cl2N9O28，雜質(zhì)2二級質(zhì)譜圖見圖8，從圖中可知雜質(zhì)2主要碎片離子m/z有1716.5077， 1560.4125， 1401.3087， 1198.2231， 1181.2057， 316.2115， 298.2014， 280.1917， 250.1782， 204.0830， 186.0775， 168.0643， 144.0668， 126.0530，其與主成分A2-2或A2-3碎片離子m/z基本相同，推測可能是A2-2或A2-3脫甘露糖所產(chǎn)生。其裂解方式為丟失葡萄糖氨側(cè)鏈產(chǎn)生m/z 1560.4125的子離子[M雜質(zhì)2-葡萄糖氨側(cè)鏈+H]+；丟失葡萄糖氨及側(cè)鏈產(chǎn)生m/z 1401.3087的子離子 [M雜質(zhì)2-葡萄糖氨及側(cè)鏈+H]+；丟失葡萄糖氨及側(cè)鏈和N-乙?；咸烟钱a(chǎn)生m/z 1198.2231的子離子 [M雜質(zhì)2-葡萄糖氨及側(cè)鏈- N-乙?；咸烟?H]+；丟失葡萄糖氨及側(cè)鏈、N-乙?；咸烟呛桶被a(chǎn)生m/z 1181.2057的子離子 [M雜質(zhì)2-葡萄糖氨及側(cè)鏈- N-乙?；咸烟?氨基]+；子離子[M氨基葡萄糖氨及側(cè)鏈]+ m/z為316.2115；子離子[M葡萄糖氨及側(cè)鏈-H2O]+ m/z為298.2014；子離子[M葡萄糖氨及側(cè)鏈-2H2O]+ m/z為280.1917；298.2014離子烯醇式結(jié)構(gòu)互變?yōu)橥浇Y(jié)構(gòu)m/z為250.1782；子離子[MN-乙酰基葡萄糖]+ m/z為204.0830；子離子[MN-乙?；咸烟? H2O]+ m/z為186.0775；子離子[MN-乙?；咸烟? 2H2O]+ m/z為168.0643；子離子[MN-乙酰基葡萄糖-N-乙?；?H2O]+ m/z為144.0668；子離子[MN-乙酰基葡萄糖-N-乙?；?2H2O]+ m/z為126.0530。推測雜質(zhì)2結(jié)構(gòu)如圖9。

2.6 討論

本研究建立了一種二維在線超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜鑒定替考拉寧中未知雜質(zhì)的方法，一維液相采用藥典方法，根據(jù)相對保留時間對替考拉寧各組分進行了確認；二維液相與四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用，一級質(zhì)譜確認各組分及雜質(zhì)的精確質(zhì)荷比，推測其分子式；二級質(zhì)譜采集各組分及雜質(zhì)的碎片離子，對主成分A2-2及A3-1的二級碎片離子進行了歸屬，根據(jù)主成分裂解規(guī)律，推導了兩個雜質(zhì)的裂解方式，并推測了兩個雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。Tengattin等[7]經(jīng)研究，替考拉寧組分A2-2可以水解脫氨基葡萄糖及其側(cè)鏈產(chǎn)生A3-1，則A3-1可以進一步水解脫N-乙酰氨基葡萄糖而產(chǎn)生雜質(zhì)1；替考拉寧的葡萄糖胺發(fā)生脂肪酰基化，疏水?；湼淖兞颂婵祭瓕幍幕钚?，疏水酰基鏈的長短、支鏈的取代基及不飽和碳鍵造成了替考拉寧各組分之間的差異，疏水?；溄M成相同時，支鏈越多，該化合物在反相色譜的保留時間越弱。雜質(zhì)2的碎片離子與主成分A2-2和A2-3脫去甘露糖后的碎片離子一致，根據(jù)替考拉寧支鏈越多，反相色譜保留時間保留越弱原理，雜質(zhì)2為主成分A2-2脫甘露糖降解物。

3 結(jié)論

替考拉寧是發(fā)酵藥物，主要結(jié)構(gòu)組分有5個，雜質(zhì)較多，雜質(zhì)制備進行結(jié)構(gòu)鑒定費時費力，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對其成分及雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)確認操作簡單，省時省力，但一維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用由于質(zhì)譜檢測器的特殊性，必須采用揮發(fā)性鹽或酸作為流動相，流動相改變后原液相方法的色譜峰很難在質(zhì)譜方法中進行定位，甚至色譜峰的出峰順序會改變，而且由于易揮發(fā)性鹽或酸種類有限，一維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的色譜方法分離度很難達到原液相方法的要求。本研究采用在線二維超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，一維液相采用藥典方法，二維液相采用適合質(zhì)譜的流動相進行脫鹽，脫鹽后直接進行質(zhì)譜分析。一維液相可以根據(jù)藥典中色譜峰的相對保留時間確定主成分及雜質(zhì)出峰時間，二維液相-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用進行一級二級質(zhì)譜同時采集，一級質(zhì)譜的精確質(zhì)荷比可以推測主成分及雜質(zhì)分子式；二級質(zhì)譜碎片離子可以對裂解方式進行推導，推測未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。此方法簡便、靈敏，可以快速地對替考拉寧未知雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定，很好地解決了雜質(zhì)難以制備進行結(jié)構(gòu)解析，為難以制備的雜質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定提供了一種解決思路。

致謝：感謝沃特世科技（上海）有限公司應用工程師楊青老師在實驗和解譜上的應用支持！

參 考 文 獻

Bardine M R， Paternoster M， Coronelli C. Teichomycins， new antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus nov. sp[J]. J Antibiot（Tokyo）， 1978， 31（3）： 170-177.

楊紅， 秦川萍. HPLC法測定替考拉寧組分和有關(guān)物質(zhì)[J]. 中國抗生素雜志， 2006， 31（3）： 184-186.

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（二部）[S]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020： 1496-1498.

EDQM. European Pharmacopoeia[S]. 10.0. teicoplanin： 3967-3970.

Kahne D， Leimkuhler C， Lu W， et al. Glycopepide and lipoglycopepide antibiotics[J]. Chem Rev， 2005， 105（2）： 425-448.

Barna J C J， Willarns D H， Stone D J M， et al. Structure elucidation of the teicoplanin antibiotics[J]. J Am Chem Soc，1984， 106（17）： 4895-4902.

Tengattini S， Corana F， Blanchi D， et al. Application of an HPLC-MS /MS method for teicoplanin drug substance and related impurities， part 2： Identity assignment of related impurities[J]. J Pharm Biomed Anal， 2019，168： 38-43.

Cometti A， Gallo G G， Kettienring J， et al. Isolation and structure determination of the main related substances of teicoplanin， a glycopeptide antibiotic[J]. Farmaco Sci， 1988， 43（12）： 1005-1018.

Borghi A， Antonin P， Zanol M， et al. Isolation and structure determination of two analogs of teicoplanin， a glycopeptide antibiotic[J]. J Antibiot（Tokyo）， 1989， 42（3）： 361-366.

張含智， 楊寶山， 羅文燕， 等. 基于高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜的替考拉寧組分的結(jié)構(gòu)解析研究[J]. 中國藥學雜志， 2021， 56（23）： 1941-1948.