西伯利亞Gudzhirganskoe鹽湖土壤放線菌多樣性、新穎性及抗菌活性研究

楊芹?郭普宇?Elena Y. Abidueva?劉少偉?李飛娜?薛春梅?孫承航

摘要：目的 探究西伯利亞Gudzhirganskoe鹽湖土壤放線菌多樣性、新穎性和活性菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物，為放線菌新物種和新抗生素的發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)備菌種資源。方法 采用10種分離培養(yǎng)基，利用稀釋涂布法進(jìn)行放線菌的分離純化；通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序，比對(duì)16S rRNA序列進(jìn)行放線菌多樣性和新穎性分析；采用紙片擴(kuò)散法對(duì)潛在放線菌新物種發(fā)酵液的酯相萃取物、水相和菌體相進(jìn)行抗菌活性篩選；采用反相柱層析、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20和半制備HPLC方法分離純化菌株Hoyosella sp. S15b3-3粗提物的活性成分，通過(guò)ESI-MS、NMR波譜數(shù)據(jù)，并結(jié)合文獻(xiàn)確定化合物的結(jié)構(gòu)；采用微量稀釋法評(píng)價(jià)化合物1和2的抗菌活性。結(jié)果 從15份樣品中分離獲得1343株放線菌，分屬于10目23科42屬，其中涅斯捷連科菌屬、擬諾卡菌屬和鏈霉菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬；15株放線菌與近緣菌株的16S rRNA基因的最高相似度≤98.65%；5株潛在新物種對(duì)至少1株檢定菌表現(xiàn)出抗菌活性；從Hoyosella sp. S15b3-3中分離鑒定2個(gè)已知化合物1（3-吲哚甲醛）和2（2-羥基-1-（3-吲哚）乙酮），化合物1對(duì)2株鮑曼不動(dòng)桿菌（2799和ATCC19606）有一定的抑制作用，MIC值分別為64和32 μg/mL。結(jié)論 西伯利亞Gudzhirganskoe鹽湖土壤含有豐富的放線菌資源，且新穎性較高，具有從中發(fā)現(xiàn)放線菌新物種和新抗生素的潛力，值得深入研究。

關(guān)鍵詞：鹽湖；放線菌；多樣性；新穎性；次級(jí)代謝產(chǎn)物

中圖分類號(hào)： R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Diversity， novelty， and antimicrobial activity of actinobacterial strains

isolated from soils in Gudzhirganskoe Saline Lake in Siberia

Yang Qin1， Guo Pu-yu1， 2， Elena Y. Abidueva3， Liu Shao-wei1， Li Fei-na4， Xue Chun-mei2， and Sun Cheng-hang1，5

（1 Department of Microbial Chemistry， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100000; 2 College of Life Sciences， Jiamusi University， Jiamusi 154000; 3 Institute of General and Experimental Biology， Siberian Branch， Russian Academy of Sciences， Russia 670047; 4 Laboratory of Respiratory Diseases， Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases， Beijing Pediatric Research Institute， Beijing Childrens Hospital， Capital Medical University， Key Laboratory of Major Diseases in Children， Ministry of Education， National Clinical Research Center for Respiratory Diseases， National Center for Childrens Health， Beijing 100045; 5 Beijing Key Laboratory of Antimicrobial Agents， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College， Beijing 100050）

Abstract Objective To explore the diversity， novelty and active secondary metabolites of culturable actinobacteria from soils of Gudzhirganskoe Saline Lake in Siberia，and lay the foundation of finding new actinobacterial taxa and antibiotics. Methods Actinobacteria were isolated by using serial dilution plating method with 10 different media. The diversity and novelty of actinobacteria were analyzed by 16S rRNA gene sequences. The potential new species were selected to evaluate their antimicrobial activities by paper-disk diffusion method. The secondary metabolites produced by Hoyosella sp. S15b3-3 were isolated and purified by reversed-phase silica column chromatography， sephadex LH-20 and semi-preparation HPLC. The chemical structures were elucidated by ESI-MS， NMR spectral analysis and compared with the literature. The antibacterial activity of compound 1 and 2 was evaluated by micro-dilution method. Results Totally， 1，343 actinobacterial strains affiliated with 42 genera in 23 families of 10 orders were obtained from 15 soil samples. The predominant genera were Nesterenkonia， Nocardiopsis and Streptomyces. Fifteen strains showed relatively low 16S rRNA similarities （≤98.65%） with validly described species. Five strains showed inhibitory activity against at least one of the indicator strains. Two known compounds were isolated and identified as 1 （1H-indole-3-carboxaldehyde） and 2 （2-hydroxy-1-（1H-indol-3-yl）ethanone）. Compound 1 exhibited inhibitory activities against Acinetobacter baumannii 2799 and A. baumannii ATCC19606 with MIC value of 64 and 32 μg/mL， respectively. Conclusion The study demonstrates that the soil in Gudzhirganskoe saline lake is rich of cultivable actinobacteria， which deserved to be further explored for the discovery of new actinobacterial species and antibiotics.

Key words Saline lake; Actinobacteria; Diversity; Novelty; Secondary metabolites

細(xì)菌耐藥已成為全球公共衛(wèi)生面臨的重大挑戰(zhàn)，除了規(guī)范抗生素的使用，亟待研發(fā)抗耐藥菌新抗生素。放線菌，尤其是鏈霉菌，是抗生素的重要來(lái)源[1]。

由于獨(dú)特的基因類型和代謝機(jī)制，特殊生態(tài)環(huán)境的放線菌具有產(chǎn)生獨(dú)特代謝產(chǎn)物的潛力，從其次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新抗生素是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

鹽湖，是不同于海洋的一類含鹽水體，作為內(nèi)陸咸水的一部分，其水體隨季節(jié)和雨量等發(fā)生變化，形成大小不等的鹽湖和鹽沼。Gudzhirganskoe鹽湖位于西伯利亞巴爾古津區(qū)，面積約0.3平方公里，湖水的pH值從8.7到9.9不等，湖水一年凍結(jié)長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月[2]。作為特殊生態(tài)環(huán)境，Gudzhirganskoe鹽湖微生物的研究較少，僅Lavrentyeva等[3]應(yīng)用16S rRNA基因擴(kuò)增片段研究其微生物多樣性，結(jié)果顯示該湖中含有放線菌，但沒(méi)有開展放線菌多樣性及純培養(yǎng)研究。另外，Karlyshev等[4]對(duì)Gudzhirganskoe鹽湖來(lái)源的1株細(xì)菌Alg18-2.2的全基因組進(jìn)行了分析。除此之外，沒(méi)有關(guān)于該鹽湖可培養(yǎng)放線菌和次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究。

本實(shí)驗(yàn)室前期與俄羅斯科學(xué)院西伯利亞分院實(shí)驗(yàn)與普通生物研究所合作，從Gudzhirganskoe鹽湖采集同一地點(diǎn)不同深度的8份樣品，對(duì)其中的可培養(yǎng)放線菌進(jìn)行多樣性、新穎性和抗菌活性的研究，從其中的1株鏈霉菌S6b3-1的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離鑒定了1個(gè)吩嗪類化合物L(fēng)G-1，LG-1對(duì)金黃色葡萄球菌 ATCC33591具有較強(qiáng)抑制作用[2]。鑒于前期較好的研究結(jié)果，本文進(jìn)一步對(duì)15份Gudzhirganskoe鹽湖土壤開展了放線菌多樣性、新穎性和抗菌活性研究，并對(duì)1株具有活性的新物種進(jìn)行了次級(jí)代謝產(chǎn)物研究，以期深入了解西伯利亞Gudzhirganskoe鹽湖可培養(yǎng)放線菌，為從中發(fā)現(xiàn)放線菌新物種和新抗生素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

2×EasyTaq SuperMix、引物、萘啶酮酸等均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，Chelex-100樹脂購(gòu)于Bio-Rad公司，放線菌酮購(gòu)買自北京全式金生物技術(shù)有限公司，BHI（腦心浸液肉湯培養(yǎng)基）和TSB（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)基購(gòu)買于北京奧博星生物，其它合成培養(yǎng)基均購(gòu)買于英國(guó)Oxoid公司。甲醇（色譜純）和乙腈（色譜純）購(gòu)買自迪馬科技有限公司，分析純甲醇和乙酸乙酯等均來(lái)自通廣精細(xì)化工公司。分離純化色譜柱為SilGreen HPLC COLUMN-C18柱，250 mm×10 mm，5 ?m。

超凈工作臺(tái)（YT-CJ-1ND，北京亞泰科隆儀器有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（HVA-110型，日本Hirayama公司）；恒溫培養(yǎng)箱（Friocell，德國(guó)MMM Medcenter公司）；PCR擴(kuò)增儀（Veriti 96 well Thermal Cycler，美國(guó)Thermofisher）；高效液相色譜儀（LC-20AT，島津企業(yè)管理有限公司）和液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LCMS-2020，島津企業(yè)管理有限公司）；核磁共振儀（Bruker AV Ⅲ-600 NMR Instrument，布魯克科技有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）分離培養(yǎng)基：M1（PYG瓊脂培養(yǎng)基[5]，g/L）：甘油10.0，酵母粉5.0，蛋白胨3.0，丙酮酸鈉1.25，甜菜堿1.25，瓊脂粉15.0；M2：高斯氏合成培養(yǎng)基；M3（10%營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[6]，g/L）：NaCl 10.0，甜菜堿1.25，丙酮酸鈉1.25，蛋白胨1.0，牛肉膏0.5，瓊脂粉15.0；M4（改良ISP2培養(yǎng)基[7]，g/L）：麥芽浸粉10.0，葡萄糖4.0，酵母粉4.0，添加1%（V/V）微量鹽和1%（V/V）復(fù)合維生素，瓊脂粉15.0，微量鹽（g/L）：MnCl2·4H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.0；復(fù)合維生素（g/L）：硫胺素（VB1）1.0，核黃素（VB2）1.0，煙酸（VB3）1.0，吡哆醇（VB6）1.0，生物素1.0；M5（改良纖維素酪素培養(yǎng)基[8]，g/L）：KNO3 2.0，K2HPO4 0.2，MgSO4·7H2O 0.05，CaCO3 0.02，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，NaCl 10.0，纖維素10.0，干酪素0.3，瓊脂粉15.0；M6（棉籽糖組氨酸培養(yǎng)基[6]，g/L）：組氨酸0.1，棉子糖1.0，Na2HPO4 0.5，KCl 1.7，MgSO4·7H2O 0.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，CaCO3 0.02，瓊脂粉15.0；M7：R2A固體培養(yǎng)基；M8（CMKA培養(yǎng)基[7]，g/L）：NaCl 100.0，KCl 30.0，MgCl2 10.0，KNO3 1.0，（NH4）2SO4 2.0，K2HPO4 0.5，CaCO3 0.5，酸水解酪蛋白0.5，甘露醇1.5，瓊脂粉15.0；M9（甘油-精氨酸瓊脂培養(yǎng)基[7， 9]，g/L）：NaCl 50.0，K2HPO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，CuSO4·5H2O 0.001，ZnSO4·7H2O 0.001，MnSO4·H2O 0.001，精氨酸2.0，甘油12.5，瓊脂粉15.0；M10（GW1瓊脂培養(yǎng)基[9]，

g/L）：NaCl 50.0，KNO3 2.0，NaHCO3 2.0，（NH4）2SO4 2.0，MgSO4·7H2O 2.0，K2HPO4·3H2O 1.0，CaCO3 0.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，甘露醇1.0，干酪素0.3，添加1%微量鹽，瓊脂粉15.0。調(diào)節(jié)pH8.0左右。

（2）純化培養(yǎng)基：TSB固體培養(yǎng)基。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：除特殊標(biāo)注外，均使用TSB液體培養(yǎng)基。

（4）活性測(cè)試培養(yǎng)基：MH或BHI（2株真菌）培養(yǎng)基。

1.1.3 抑制劑

抑制劑的種類和終濃度分別為萘啶酮酸25 mg/L、

放線菌酮40 mg/L和重鉻酸鉀50 mg/L。

1.1.4 檢定菌

12株“ESKAPE”菌（每種菌有2株，前者為敏感菌，后者為耐藥菌）為糞腸球菌（ATCC33186；310682）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213；ATCC33591）、肺炎克雷伯菌（ATCC10031；ATCC700603）、鮑曼不動(dòng)桿菌（ATCC2799；ATCC19606）、銅綠假單胞菌（ATCC27853；ATCC2774）和大腸埃希菌（ATCC25922；ATCC35218）。2株真菌為白念珠菌CCTCC93025和羅倫隱球菌CCTCC91013。以上菌株保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理

采樣時(shí)，Gudzhirganskoe鹽湖幾乎是干涸的，只有少量湖水，湖水的pH為9.4，陰離子中鈉離子的濃度為43856.9 mg/L，硫酸鹽離子的濃度為83820.0 mg/L。

如表1所示，15份（S1～S15）樣品均采集自西伯利亞Gudzhirganskoe鹽湖土壤，分別裝入10 mL無(wú)菌離心管中，于4℃冰箱中保存，備用。15份樣品風(fēng)干后，分別取1 g樣品至9 mL的溶液中（g/L，NaCl 7.5，KCl 0.1，CaCl2 0.1，NaHCO3 0.2，焦磷酸鈉1.0，酵母粉60.0），30℃，180 r/min振蕩2 h，之后用無(wú)菌水10倍梯度稀釋，分別取200 μL的10-1、10-2和10-3（g/mL）的土壤懸液涂布于10種分離培養(yǎng)基（M1～M10）上，28℃培養(yǎng)1～4周。

1.2.2 菌株的分離純化與保藏

觀察每個(gè)平板上的菌落形態(tài)，根據(jù)菌落形態(tài)，排除相近菌落，挑取單菌落，采用三區(qū)劃線法接種到TSA平板上，直至獲得純培養(yǎng)的菌株。挑取適量純化后的菌株于20%（V/V）的甘油中，-80℃保藏。

1.2.3 基于16S rRNA基因序列的分子鑒定

利用Chelex-100法提取菌株基因組DNA[10]，擴(kuò)增引物為27F和1492R[11]。擴(kuò)增體系（50 μL）：25 μL 2×supermix、1.5 μL引物、1.5 μL的DNA和20.5 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性

1 min；60℃退火1 min；72℃延伸1 min；30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物工程有限公司測(cè)序，登錄EzBioCloud網(wǎng)站（https：//www.ezbiocloud.net/）上進(jìn)行序列比對(duì)。采用MEGA X[12]軟件以鄰接法[13]（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株的發(fā)酵及抗菌活性篩選

活化15株16S rRNA序列基因相似性小于98.65%的放線菌，挑取適量于TSB（5×100 mL）液體培養(yǎng)基，28℃，180 r/min，培養(yǎng)7～10 d。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液4500 r/min離心25 min，取上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮后，用5 mL的甲醇溶解獲得酯相，備用。菌絲體用丙酮浸泡，超聲浸提后，離心，上清液濃縮后用3 mL甲醇溶解，獲得菌體相，備用。取水相60 mL揮干后，用3 mL甲醇水溶解備用。

14株檢定菌活化后，制備菌懸液，按照0.8%

（V/V）的量將菌懸液加入溫度50℃左右滅菌的MH或BHI瓊脂培養(yǎng)基中，搖勻后倒入培養(yǎng)皿中，冷卻后獲得檢定板，備用。采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行活性篩選，分別吸取60 μL的上述酯相、水相和菌體相的樣品于濾紙片（7 mm）上，揮干后，將濾紙片貼于檢定板上，37℃培養(yǎng)16～20 h，觀察并記錄抑菌圈直徑。

1.2.5 稀有放線菌Hoyosella sp. S15b3-3次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

Hoyosella sp. S15b3-3在利用TSB培養(yǎng)基進(jìn)行活性篩選時(shí)，沒(méi)有表現(xiàn)出抗菌活性，但是在利用多相分類的方法確定該菌株的分類地位時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌株S15b3-3耐受鹽濃度的范圍是0～10%（V/V）[14]，且在進(jìn)行鹽濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)利用BHI培養(yǎng)基（添加3%海鹽）發(fā)酵的產(chǎn)物對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606有抑制作用（抑菌圈直徑10.0 mm）。目前，該屬僅有5株菌株，且沒(méi)有次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)研究報(bào)道。并且本研究活性篩選結(jié)果顯示，多數(shù)菌株活性較弱。因此，首先對(duì)S15b3-3的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究。

菌株S15b3-3活化后接種于BHI（添加3%海鹽）培養(yǎng)基，30℃，180 r/min培養(yǎng)3 d獲得種子液。將種子液按照5%（V/V）的接種量，接種到40瓶含有1 L的BHI（添加3%海鹽）液體培養(yǎng)基的5 L的三角瓶中，相同條件下培養(yǎng)7～9 d。發(fā)酵結(jié)束后，上清液用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮，得到4.1 g（油狀）粗提物。粗提物經(jīng)過(guò)反相硅膠柱層析，甲醇-水梯度洗脫（10%、30%、50%、70%、90%和100%，V/V），共得到7個(gè)餾分（Fr.G1～Fr.G7）。每個(gè)餾分采用紙片擴(kuò)散法以鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606為指示菌測(cè)活。活性結(jié)果顯示，餾分Fr.G3為活性組分，F(xiàn)r.G3（610 mg）經(jīng)過(guò)LH-20凝膠柱層析，以甲醇為洗脫劑，共得到63個(gè)餾分，經(jīng)過(guò)TLC展開合并相似餾分，共獲得8個(gè)組分（Fr.G3-1～Fr.G3-8）。每個(gè)組分測(cè)活，結(jié)果顯示Fr.G3-5和Fr.G3-8表現(xiàn)出抗菌活性。Fr.G3-5組分通過(guò)HPLC制備（28%乙腈-水）純化得到化合物1（3.1 mg，tR=35.6 min）。Fr.G3-8組分利用HPLC制備（25%乙腈-水），得到化合物2（3.9 mg，tR=38.9 min）。

1.2.6 抗菌活性評(píng)價(jià)

按照CLSI[15]標(biāo)準(zhǔn)，采用微量稀釋法測(cè)定化合物1和2的最小抑菌濃度（MIC），12株“ESKAPE”菌為指示菌，設(shè)置左氧氟沙星為陽(yáng)性對(duì)照，DMSO作為陰性對(duì)照，樣品最大濃度為256 μg/mL，37℃恒溫培養(yǎng)16～20 h，孔內(nèi)微生物完全被抑制的濃度即MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌多樣性分析

如表2所示，通過(guò)菌落排重和16S rRNA基因序列比對(duì)分析，15份樣品經(jīng)過(guò)10種培養(yǎng)基分離，共獲得1343株放線菌，分屬于10目23科42屬，涅斯捷連科菌屬（Nesterenkonia）、擬諾卡菌屬（Nocardiopsis）和鏈霉菌屬（Streptomyces）為優(yōu)勢(shì)菌屬，分別占分離放線菌總數(shù)的21.3%、20.5%和20.2%。除此之外，還包括其他一些稀有放線菌，例如氣微菌屬（Aeromicrobium）、迪茨菌屬（Dietzia）、諾卡菌屬（Nocardia）、小單孢菌屬（Micromonospora）、動(dòng)球菌屬（Kineococcus）、皮革球菌屬（Kytococcus）、無(wú)色桿菌屬（Leucobacter）和短小桿菌屬（Curtobacterium）等，其多樣性分布見(jiàn)圖1。

如圖2a所示，15份樣品中，從S1（輕度鹽漬化土壤）中分離獲得的放線菌數(shù)量最多（187株），樣品S2（輕度鹽漬化土壤）分離的放線菌的多樣性最高（22屬），樣品S4（鹽漬化較重土壤）獲得的放線菌的種屬和數(shù)量最少（24株，4屬）。由圖2b可知，10種分離培養(yǎng)基中，M1和M9分離獲得的放線菌菌屬種類最多（23屬），M3（20屬）次之，M10中分離的放線菌種屬最少（12屬）。另外，還有一些放線菌僅在特定的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，例如擬無(wú)枝菌酸菌屬（Amycolatopsis）、動(dòng)球菌屬（Kineococcus）、絲氨酸桿菌屬（Serinibacter）和圣格奧爾根村菌屬（Georgenia）僅在M1培養(yǎng)基生長(zhǎng)，短小桿菌屬（Curtobacterium）、短狀桿菌屬（Brachybacterium）和兩面神菌屬（Janibacter）僅在M3培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)，棍狀桿菌屬（Clavibacter）只在M7中生長(zhǎng)，嗜鹽放線桿菌屬（Haloactinobacterium）和皮革球菌屬（Kytococcus）僅在M8培養(yǎng)基中出現(xiàn)，壤霉菌屬（Agromyces）、鹽水桿菌屬（Salinibacterium）和冢村氏菌屬（Tsukamurella）僅在M9培養(yǎng)基獲得。

2.2 放線菌新穎性分析

根據(jù)放線菌16S rRNA基因序列相似性小于98.65%的菌株屬于不同物種的歸類原則[16]，對(duì)15份鹽湖土壤來(lái)源放線菌進(jìn)行新穎性研究，結(jié)果顯示，15株（表3）放線菌的16S rRNA（>1319 bp）基因序列相似性低于98.65%，初步判斷隸屬于10個(gè)屬的不同新物種。菌株S13a10-8和S18c9-1的最高同源性菌株均為Streptomyces xinghaiensis S187T，相似度分別為98.02%和97.13%，這兩株菌之間的相似性為97.28%，這說(shuō)明這2株菌分別代表鏈霉菌屬的2個(gè)新物種；并且根據(jù)抗菌活性篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)S13a10-8發(fā)酵液具有抗菌活性，而S18c9-1沒(méi)有表現(xiàn)出抗菌活性，進(jìn)一步說(shuō)明2株菌代表鏈霉菌屬的2個(gè)新物種。另外，1株稀有放線菌S15b3-3的16S rRNA基因序列相似性低于97.0%，該菌株經(jīng)過(guò)多相分類學(xué)研究確定其為Hoyosella屬的新物種，命名為Hoyosella lacisalsi[14]。

2.3 抗菌活性篩選結(jié)果

如圖3所示，15株潛在新物種中有5株菌對(duì)至少一株檢定菌有抑制作用，其中4株為鏈霉菌屬，1株為稀有放線菌纖維單胞菌屬Cellulomonas sp. S9c1-10。

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無(wú)定形粉末，溶于甲醇和二氯甲烷，ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 146.13[M+H]+和144.21[M-H]-，提示分子量為145。1H NMR

（600 MHz，CD3OD）給出6個(gè)質(zhì)子信號(hào)，13C NMR

（150 MHz，CD3OD）提示化合物含有9個(gè)碳。在δH 9.87（1H，s）顯示分子中含有一個(gè)醛基質(zhì)子，δH 7.27（1H，td，J=7.2，1.2 Hz），δH 7.23（1H，td，J=7.2，1.2 Hz），δH 8.15（1H，d，J=7.2 Hz）和δH 7.47（1H，d，J=7.8 Hz）提示分子中含有一個(gè)鄰位取代的苯環(huán)，δH 8.07（1H，s）是一個(gè)烯氫質(zhì)子信號(hào)。通過(guò)文獻(xiàn)查閱，該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致[17-18]，為3-吲哚甲醛，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖4所示。13C NMR：δC 187.4、139.7、138.9、125.7、125.0、123.6、122.4、120.1和113.1。

化合物2：白色無(wú)定形粉末，ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 176.23[M+H]+。1H NMR（600 MHz，CD3OD）和13C NMR（150 MHz，CD3OD）譜與化合物1類似，都含有一個(gè)吲哚結(jié)構(gòu)，與化合物1不同之處在于化合物2不含醛基氫質(zhì)子信號(hào)，1H NMR顯示化合物2在δH 4.73（2H，s）處有一個(gè)亞甲基質(zhì)子信號(hào)，13C NMR中δC 66.3的信號(hào)提示亞甲基可能與羰基和羥基相連，通過(guò)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)[19]，確定化合物2為2-羥基-1-（3-吲哚）乙酮，結(jié)構(gòu)如圖4所示。13C NMR：δC195.9、138.2、134.0、126.9、124.3、123.3、122.6、114.8、112.9和66.3。1H NMR：δH 8.23（1H，m）、8.18（1H，m）、7.45（1H，m）、7.22（2H，m）和4.73（2H，s）。

2.5 化合物1～2的抗菌活性評(píng)價(jià)

利用微量稀釋法對(duì)化合物1和2進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，化合物1對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌2799和ATCC19606有一定的抑制作用，最小抑菌濃度分別為64和32 μg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213和ATCC33591的MIC均為256 μg/mL，其余檢定菌的MIC值均大于256 μg/mL，化合物2對(duì)所有檢定菌均無(wú)明顯的抑制作用，MIC值均>256 μg/mL。

3 討論與結(jié)論

本課題組前期從Gudzhirganskoe鹽湖同一地點(diǎn)不同深度的8份樣品中分離獲得635株放線菌，分屬于7目12科21屬[2]。本文從該鹽湖采集的15份不同土壤樣品中，共分離鑒定1343株放線菌，分屬于10目23科42屬，相比之下，本文分離的放線菌不僅多樣性更加豐富，而且獲得了該鹽湖未曾報(bào)道的21屬，極大地豐富了Gudzhirganskoe鹽湖菌株的多樣性。為了獲得不同菌屬的放線菌，本文選擇10種分離培養(yǎng)基，根據(jù)分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4株菌僅在M1培養(yǎng)基中分離獲得，另外，在M3、M7、M8和M9中也分別獲得3、1、2和3株特有的放線菌，這說(shuō)明選擇不同成分的培養(yǎng)基獲得的放線菌類群也會(huì)不同。因此，為了更加全面地反應(yīng)鹽湖生境的微生物種類，應(yīng)該設(shè)計(jì)不同種類的培養(yǎng)基，進(jìn)而更好地獲得放線菌新類群。

根據(jù)新穎性結(jié)果分析，前期從該鹽湖獲得7株16S rRNA基因最高相似度≤98.65%的放線菌，歸屬于同一個(gè)屬的新物種；而本文獲得15株潛在的新物種，分屬于9屬，新穎性更高。目前，已確定S15b3-3為Hoyosella屬的新物種，其它潛在新物種會(huì)繼續(xù)開展多相分類研究。

對(duì)15株潛在新物種進(jìn)行抗菌活性篩選，其中5株菌對(duì)至少1株檢定菌表現(xiàn)出抗菌活性，活性菌株主要為鏈霉菌，僅1株稀有放線菌對(duì)大腸埃希菌表現(xiàn)出較弱的抑制作用。Hoyosella sp. S15b3-3在利用TSB培養(yǎng)基進(jìn)行活性篩選時(shí)，沒(méi)有表現(xiàn)出抗菌活性，但是在進(jìn)行鹽濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌株在BHI培養(yǎng)基（添加3%海鹽）發(fā)酵的產(chǎn)物對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606有抑制作用（抑菌圈直徑10.0 mm），這也說(shuō)明，改變培養(yǎng)基可以刺激菌株產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物。后續(xù)擬對(duì)這些潛在新物種進(jìn)行基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物生物合成基因簇，通過(guò)OSMAC（單菌多產(chǎn)物）策略優(yōu)化發(fā)酵條件，誘導(dǎo)沉默基因的表達(dá)，進(jìn)而增加發(fā)現(xiàn)新化合物的幾率。另外，在基因?qū)用姘l(fā)現(xiàn)含有特定結(jié)構(gòu)片段的次級(jí)代謝產(chǎn)物，進(jìn)而指導(dǎo)新化合物的發(fā)現(xiàn)。除15株潛在新物種之外，其余1000余株放線菌后續(xù)會(huì)繼續(xù)進(jìn)行抗菌活性篩選，活性菌株采用基于質(zhì)譜可視化的代謝組學(xué)和分子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行排重分析，快速找到有潛在新抗生素的目標(biāo)菌株進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物研究[20]。

本文從Gudzhirganskoe鹽湖來(lái)源的稀有放線菌Hoyosella sp. S15b3-3的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離了2個(gè)吲哚類化合物，抗菌活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，化合物1對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606具有一定抑制作用。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，化合物1和2主要從海綿中分離得到[21]，也有報(bào)道來(lái)自放線菌，例如小單胞菌屬[18，22]和鳥氨酸微菌屬[23]等，另外有文獻(xiàn)報(bào)道從鹽土來(lái)源的擬諾卡菌屬放線菌YIM 90087發(fā)酵液中分離獲得化合物2[24]，本文首次報(bào)道從Hoyosella屬分離獲得吲哚化合物1～2。

綜上所述，本文從西伯利亞Gudzhirganskoe鹽湖土壤中分離獲得的放線菌物種多樣性豐富，新穎性較高，這為Gudzhirganskoe鹽湖放線菌研究奠定了基礎(chǔ)，為新抗生素的發(fā)現(xiàn)提供了候選藥用放線菌資源。同時(shí)豐富了Hoyosella屬放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物的類型和數(shù)量，為后續(xù)研究鹽湖的菌株提供參考。

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