整合影像組學(xué)和基因組學(xué)構(gòu)建腎透明細(xì)胞癌腫瘤分級預(yù)測模型

田占雨，李霞，李永生，陳家齊

海南醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)信息與工程學(xué)院，海南 ?？?571199

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal carcinoma，CCRCC)占腎細(xì)胞癌的75%～80%，是惡性程度高，預(yù)后差，死亡率最高的亞型[1]。世界衛(wèi)生組織/國際泌尿病理學(xué)會(huì)(World Health Organization/International Society of Urological Pathology，WHO/ISUP)根據(jù)核仁突出情況對CCRCC 進(jìn)行了分級(I級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級)，隨后根據(jù)預(yù)后結(jié)局進(jìn)一步將患者分為低級別組(I級、Ⅱ級)和高級別組(Ⅲ級、Ⅳ級)[2-3]?，F(xiàn)階段對腫瘤分級主要依靠經(jīng)皮穿刺活檢，需要面臨出血、氣胸以及針道轉(zhuǎn)移等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要一種非侵入性的方法協(xié)助判斷CCRCC的腫瘤分級。隨著醫(yī)學(xué)影像成像技術(shù)的發(fā)展以及高通量基因組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，影像基因組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。影像基因組學(xué)是一個(gè)多學(xué)科交叉的新興領(lǐng)域，是影像組學(xué)和基因組學(xué)的有機(jī)結(jié)合。在之前的研究中，Celli等[4]結(jié)合了影像組學(xué)與基因組學(xué)，利用多元邏輯回歸算法構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型，該模型在鑒別診斷低風(fēng)險(xiǎn)子宮內(nèi)膜癌方面有著出色的分類能力。馬佳琪等[5]通過結(jié)合影像基因組學(xué)信息，在診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移、預(yù)測患者預(yù)后和治療敏感性等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。將預(yù)測模型用于臨床實(shí)踐為個(gè)性化治療帶來顯著優(yōu)勢，可以減少患者后續(xù)治療的時(shí)間成本，并為制定臨床治療方案和改善患者總體生存率提供了指導(dǎo)和新的見解。然而，針對惡性程度較高的CCRCC的腫瘤分級仍然具有挑戰(zhàn)性。

本研究以影像基因組學(xué)為切入點(diǎn)，通過結(jié)合醫(yī)學(xué)影像和多組學(xué)數(shù)據(jù)識別不同水平的特征，基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建多種預(yù)測模型，并結(jié)合各類算法優(yōu)勢，篩選最優(yōu)特征組合以達(dá)到準(zhǔn)確預(yù)測CCRCC腫瘤分級的目的。相較于之前的研究，本研究構(gòu)建的復(fù)合型模型取得了更優(yōu)的分類效能。此外，進(jìn)一步探討了多組學(xué)水平特征基因的功能，挖掘基因在CCRCC 中的潛在臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 CCRCC患者的醫(yī)學(xué)影像數(shù)據(jù)來源于TCIA 數(shù)據(jù)庫(The Cancer Imaging Archive，version 3:Updated 2020/05/29)，按照入組標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理診斷確診為CCRCC；(2)CT 增強(qiáng)掃描皮質(zhì)期與髓質(zhì)期期相準(zhǔn)確且完整；(3)圖像中未出現(xiàn)各類偽影；(4)具備合適的信噪比。符合入組標(biāo)準(zhǔn)的樣本共197 例。CCRCC 患者的多組學(xué)數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas Program-NCI，2017年)。數(shù)據(jù)集包含了530例患者的基因組和轉(zhuǎn)錄組信息，基因表達(dá)水平為每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)(fragment per kilobase method，F(xiàn)PKM)。通過比對注釋文件，獲得了16 769個(gè)編碼基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和12 903個(gè)基因的遺傳變異數(shù)據(jù)。最后從數(shù)據(jù)集中篩選出同時(shí)具有醫(yī)學(xué)影像數(shù)據(jù)和多組學(xué)數(shù)據(jù)的樣本，包含了197例患者。隨后本研究按照2016年WHO/ISUP簡化分級將I期、II期定義為“低級別組(stage 0)”，III期、IV期定義為“高級別組(stage 1)”。

1.2 影像組學(xué)數(shù)據(jù)提取及預(yù)測模型構(gòu)建 基于醫(yī)學(xué)影像數(shù)據(jù)利用ITK-SNAP軟件半自動(dòng)形式確定原發(fā)灶邊界，其中窗寬窗位預(yù)設(shè)為腹部窗(level：40 HU；window：600 HU)。隨后應(yīng)用Python軟件(version 3.8)中“Pyradiomics”庫提取影像組學(xué)特征[6]，參數(shù)設(shè)定如下：箱寬(bin-width)為25；重采樣像素間距(Pixel Spacing)為3 mm×3 mm×3 mm；內(nèi)插程序選擇最近鄰。提取出的影像特征主要包含7 個(gè)類別維度，形狀特征(shape-based)、一階特征(first-order)、灰度共生矩陣(Gray-Level Co-occurrence Matrix，GLCM)、灰度區(qū)域大小矩陣(Gray Level Size Zone Matrix，GLSZM)、灰度行程矩陣(Gray Level Run-Length Matrix，GLRLM)、鄰域灰度差矩陣特征(Neighbouring Gray Tone Difference Matrix，NGTDM)和灰度依賴矩陣(Gray Level Dependence Matrix，GLDM)。

1.3 識別與CCRCC 相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組和基因組特征 在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中，由于FPKM 值包含不同數(shù)量級，為避免表達(dá)值相差過大而對模型產(chǎn)生不良影響，本研究進(jìn)行了數(shù)據(jù)的歸一化，使基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)局限在相同數(shù)量級范圍內(nèi)。由于轉(zhuǎn)錄組水平和基因組水平的數(shù)據(jù)形式不同，本研究分別進(jìn)行了差異分析，以篩選在不同CCRCC腫瘤分級之間顯著差異表達(dá)或突變的特征基因。

1.4 基因功能富集分析 為發(fā)掘在CCRCC腫瘤分級中顯著差異表達(dá)的特征基因的潛在信息，探索基因的生物學(xué)功能以及腫瘤的生物學(xué)行為，本研究使用R 編程軟件中“clusterProfiler”包中的“enrichGO”功能進(jìn)行功能富集分析。對于富集分析得到的生物學(xué)功能，進(jìn)一步篩選出至少包含3 個(gè)重合基因的顯著富集的功能(count＞3，P-value＜0.05)。隨后使用R“simplify-Enrichment”包中的“GO_similarity”功能進(jìn)行語義相似性計(jì)算，將相似的GO術(shù)語進(jìn)行聚類。最后使用“simplifyGO”功能對功能富集聚類結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.5 構(gòu)建CCRCC腫瘤分級預(yù)測模型 本研究基于單一組學(xué)特征和聯(lián)合多組學(xué)特征，并結(jié)合不同的機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建了針對CCRCC 腫瘤分級的預(yù)測模型。主要基于支持向量機(jī)算法(Support Vector Machine，SVM)、邏輯回歸算法(Logistic Regression，LR)、隨機(jī)森林算法(Random Forest，RF)以及極端梯度提升算法(Extreme Gradient Boosting，XGB)分別構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型，用于預(yù)測CCRCC 腫瘤分級。各個(gè)模型模型參數(shù)均采用網(wǎng)格搜索選取最佳輸入?yún)?shù)，并且超參數(shù)均位于對應(yīng)值閾內(nèi)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究通過Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)篩選在CCRCC高低分級中存在顯著差異的影像組學(xué)特征和顯著差異表達(dá)基因(P＜0.05)。在基因組層面，本研究應(yīng)用Fisher 精確檢驗(yàn)篩選存在顯著差異的突變基因(P＜0.05)。最后，針對全部種類的特征應(yīng)用最小絕對收縮和選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)，篩選出具備較高權(quán)重的關(guān)鍵特征。

2 結(jié)果

2.1 CCRCC 影像組學(xué)的特征 本研究利用Python 軟件中Pyradiomics 庫，提取了197 例入組樣本的107個(gè)影像組學(xué)特征。隨后經(jīng)過Wilcoxon秩和檢驗(yàn)篩選[7]，得到在CCRCC 不同分級之間存在顯著差異的24 個(gè)影像組學(xué)特征(圖1)。這些特征共同描述出腫瘤的形態(tài)和特點(diǎn)(圖2)，如腫瘤表面積體積比(original shape surface volume ratio)，比值越低則說明腫瘤越近似于緊湊的球狀；平均值(original first order mean)是評估ROI 內(nèi)的平均灰度，集群陰影(original GLCM cluster shade)是衡量灰度共生矩陣(Gray-Level Co-occurrence Matrix，GLCM)的偏度和均勻度的指標(biāo)，集群陰影的特征值越高則圖像中平均值的不對稱性就更高，這表示原發(fā)灶的內(nèi)腫瘤組織可能出現(xiàn)出血或壞死。按照CCRCC不同的腫瘤分級繪制了各影像組學(xué)特征的表達(dá)值。網(wǎng)格體積(original shape mesh volume)應(yīng)用三角形網(wǎng)格計(jì)算腫瘤原發(fā)灶體積，在高級別組中網(wǎng)格體積特征值較高，這表明高級別腫瘤相較于低級別腫瘤體積較大；體素體積(original shape voxel volume)是指在ROI 中通過體素?cái)?shù)量與單個(gè)體素體積的相乘來計(jì)算ROI體積，體素體積精確性欠佳但可以用來評價(jià)ROI 大致體積，結(jié)果同樣顯示高級別腫瘤具備較大的體積；表面積(original shape surface area)直觀的評價(jià)ROI 表面積，在高級別組中特征值越大則說明腫瘤原發(fā)灶表面積越大。同樣在三維視角下，相較于低級別腫瘤，處于高級別腫瘤階段的腫瘤表面積和腫瘤體積也更大(圖3)。已有研究表明，腫瘤體積和表面積是影響CCRCC 患者預(yù)后的獨(dú)立因素，并且WHO/ISUP 分級較高的患者預(yù)后更差[8]。

圖1 與CCRCC不同風(fēng)險(xiǎn)分級顯著相關(guān)的影像組學(xué)特征Figure 1 Imaging features significantly associated with different risk grades of CCRCC

圖2 影像組學(xué)特征在不同腫瘤分級中的特征值Figure 2 Feature values of radiomics features in different tumor grades

圖3 三維視角下腫瘤表面積及腫瘤體積Figure 3 Tumor surface area and tumor volume in three-dimensional view

2.2 識別與CCRCC相關(guān)的基因組學(xué)特征 接下來通過Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，識別了在CCRCC不同腫瘤分級中表現(xiàn)出顯著差異表達(dá)的2 125 個(gè)基因[8](圖4)。此外，通過Fisher精確檢驗(yàn)，篩選出了在腫瘤分級中其突變具有顯著差異的37個(gè)基因，其中BAP1和SETD2在高級別CCRCC 患者中具有較高的突變比例(圖5)，并且已有研究證實(shí)了，BAP1和SETD2突變在CCRCC疾病具備病理意義，并可能引起較差的臨床結(jié)局[9-10]。

圖4 在CCRCC不同腫瘤分級中存在顯著差異的表達(dá)基因Figure 4 Expressed genes with significant differences in different tumor grades of renal clear cell carcinoma

圖5 BAP1和SETD2在高級別CCRCC中突變占比較高Figure 5BAP1 and SETD2 have a high mutation ratio in high-grade CCRCC

2.3 機(jī)器學(xué)習(xí)模型的建立與評價(jià) 結(jié)合先前識別的影像組學(xué)特征和多組學(xué)特征，進(jìn)一步通過LASSO降維得到整合的關(guān)鍵特征。隨后基于四種機(jī)器學(xué)習(xí)算法分別構(gòu)建預(yù)測模型，以評估影像基因組學(xué)聯(lián)合特征針對CCRCC分級的預(yù)測效能。所有模型訓(xùn)練過程中訓(xùn)練集均占比80%，測試集占比20%。為避免因數(shù)據(jù)集隨機(jī)劃分時(shí)導(dǎo)致的過擬合，在模型構(gòu)建過程中本研究設(shè)定了五折交叉驗(yàn)證。經(jīng)不同機(jī)器學(xué)習(xí)算法擬合后，繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，并通過曲線下面積(area under curve，AUC)評價(jià)模型的預(yù)測效能。結(jié)果表明，使用聯(lián)合特征基于SVM 算法構(gòu)建的預(yù)測模型與其他模型相比具有最好的預(yù)測效能，其訓(xùn)練集AUC 為0.999 (95%CI：0.994～1.004)，測試集AUC為0.929(95%CI：0.841～1.018)(圖6)。其次是基于LR算法構(gòu)建的預(yù)測模型，其訓(xùn)練集AUC為1.0(95%CI：1.0～1.0)，測試集AUC為0.894(95%CI：0.787～0.100 1)。盡管基于RF 算法和XGB 算法構(gòu)建的預(yù)測模型其預(yù)測效能最差，但是仍然可以較好的區(qū)分CCRCC的腫瘤分級(AUC＞0.8)，見圖6。

圖6 基于四種機(jī)器學(xué)習(xí)模型ROC曲線Figure 6 ROC curve based on four machine learning models

上述結(jié)果表明基于影像基因組學(xué)聯(lián)合特征構(gòu)建的SVM 模型在預(yù)測CCRCC分級中表現(xiàn)最佳，因此隨后使用SVM 算法，基于影像組學(xué)特征、轉(zhuǎn)錄組特征和基因組特征，分別構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型，以評估不同組學(xué)識別的關(guān)鍵特征在CCRCC 腫瘤分級方面的預(yù)測效能(圖7)。其中影像組學(xué)預(yù)測模型其AUC 為0.715(95%CI：55.1%～87.8%)，轉(zhuǎn)錄組預(yù)測模型AUC為0.856(95%CI：73.2%～98%)，基因組預(yù)測模型AUC 為0.652(95%CI：47.8%～82.5%)。結(jié)果表明，與其他水平的特征相比，基于轉(zhuǎn)錄組水平關(guān)鍵特征基因構(gòu)建的SVM模型在腫瘤分級方面具有更優(yōu)的預(yù)測效能(AUC=0.856，95%CI：73.2%～98%)。而結(jié)合多組學(xué)特征的影像基因組學(xué)模型(AUC=0.929，95%CI：84.1%～100%)較單一組學(xué)(AUC=0.652～0.856)模型預(yù)測效能更佳。

圖7 基于支持向量機(jī)的單一組學(xué)模型評價(jià)圖Figure 7 Model evaluation diagram of support vector machine based on single omics

2.4 CCRCC相關(guān)基因組學(xué)的特征功能 為了進(jìn)一步挖掘特征基因在CCRCC 腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮的作用，本研究使用LASSO算法進(jìn)一步篩選在腫瘤分級中顯著差異表達(dá)的關(guān)鍵特征基因進(jìn)行功能富集分析，以探究其參與調(diào)控的通路與功能。關(guān)鍵基因被富集在了多條條通路中，并按照P值排序選取了前8 條通路進(jìn)行可視化展示(圖8)。本研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤分級相關(guān)的特征基因主要富集在了T細(xì)胞分化(T cell differentiation)、淋巴細(xì)胞分化(Lymphocyte differentiation)、細(xì)胞基質(zhì)黏附(regulation of cell-matrix adhesion)和非典型Wnt 信號通路(Non-canonical Wnt signaling pathway)等生物學(xué)過程中。隨后對生物學(xué)過程進(jìn)行GO語義相似性聚類，結(jié)果表明特征基因主要富集在免疫相關(guān)細(xì)胞分化、細(xì)胞基質(zhì)調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控等相關(guān)功能上(圖9)。為進(jìn)一步可視化特征基因與生物學(xué)過程之間的關(guān)系，本研究繪制了基因-功能網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示W(wǎng)NT4 處于網(wǎng)絡(luò)圖的中心，相比于LBX2 和MCM9 等基因，WNT4 顯然參與了更多的生物學(xué)過程(圖10)，并且在高級別腫瘤中WNT4 表達(dá)較高(圖11)，WNT4 可能在CCRCC 進(jìn)展中發(fā)揮更重要的作用。

圖8 基因功能富集分析Figure 8 Gene functional enrichment analysis

圖9 功能相似性聚類Figure 9 Functional similarity clustering

圖10 基因功能網(wǎng)絡(luò)圖Figure 10 Gene function network diagram

圖11 WNT4在不同腫瘤分級中的表達(dá)Figure 11 WNT4 expression in different tumor grades

3 討論

影像基因組學(xué)將患者影像資料和基因組數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，廣泛應(yīng)用在腫瘤診療過程中[11-13]。本研究應(yīng)用影像基因組學(xué)聯(lián)合特征構(gòu)建了預(yù)測CCRCC腫瘤分級模型，對比四種機(jī)器學(xué)習(xí)算法在預(yù)測CCRCC 腫瘤分級效能的不同。SVM在預(yù)測CCRCC腫瘤分級中表現(xiàn)最佳，AUC為0.929(95%CI：0.841～1.018)。RF、LR及XGB 模型同樣能較準(zhǔn)確預(yù)測CCRCC 腫瘤的分級(AUC=0.881～0.894)。國外同樣也有研究發(fā)現(xiàn)SVM較K近鄰模型、RF模型更能反應(yīng)肺癌患者的預(yù)后[14]。其可能原因?yàn)镾VM結(jié)構(gòu)簡單、適應(yīng)性好及泛化能力強(qiáng)等優(yōu)勢和二分類問題更契合有關(guān)[15]。因此本研究利用SVM 分別構(gòu)建預(yù)測CCRCC 腫瘤分級的影像組學(xué)、基因組及轉(zhuǎn)錄組的單組學(xué)模型，并與聯(lián)合模型進(jìn)行對比。結(jié)果顯示影像組學(xué)預(yù)測模型AUC為0.71(95%CI：0.551～0.878)，轉(zhuǎn)錄組預(yù)測模型AUC為0.856(95%CI：0.732～0.98)，基因組預(yù)測模型AUC 為0.65 (95%CI：0.478～0.825)。這表明轉(zhuǎn)錄組模型在單組學(xué)預(yù)測模型中表現(xiàn)更優(yōu)，可能與差異表達(dá)的特征基因數(shù)量較多有關(guān)。同時(shí)，聯(lián)合模型中輸入特征數(shù)量及特征維度較多，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果指出聯(lián)合組學(xué)模型(AUC=0.929)較單一組學(xué)(AUC=0.652～0.856)模型可更準(zhǔn)確預(yù)測腫瘤分級。之前的研究也證實(shí)了聯(lián)合模型的效能更佳[14，16]。本研究為CCRCC腫瘤分級診斷構(gòu)建的影像基因組學(xué)預(yù)測模型具有臨床實(shí)用性，其中基于SVM算法的多組學(xué)預(yù)測模型表現(xiàn)最佳，為個(gè)體化無創(chuàng)性腫瘤分級提供了支持工具，輔助臨床術(shù)前決策。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TCGA 數(shù)據(jù)庫中多組學(xué)數(shù)據(jù)，通過Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)及Fisher 精確檢驗(yàn)篩選出CCRCC腫瘤不同分級間存在顯著差異表達(dá)和差異突變的基因。通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)，WNT4 表達(dá)基因在功能網(wǎng)絡(luò)中處在“樞紐”的位置(圖10)，能夠調(diào)節(jié)非典型WNT信號通路、T細(xì)胞分化及胸腺T細(xì)胞分化[17]、雌配子傳代和細(xì)胞基質(zhì)的黏附。根據(jù)大多數(shù)臨床研究發(fā)現(xiàn)CCRCC 男性發(fā)病率高于女性，結(jié)合本研究結(jié)果表明可能與WNT4 參與調(diào)控雌配子傳代相關(guān)[18-19]。同時(shí)，WNT4 參與調(diào)控細(xì)胞分化會(huì)引起CCRCC 的不良預(yù)后[20]，與本研究結(jié)果中WNT4 在高級組中表達(dá)較高相符[21]。本研究探索了與CCRCC相關(guān)的關(guān)鍵基因，揭示了關(guān)鍵基因參與調(diào)控的通路及功能，為CCRCC 的精準(zhǔn)治療提供了潛在生物學(xué)標(biāo)志以及新的治療可能。

本研究同樣存在局限性。為了拓展特征維度采用多組學(xué)聯(lián)合數(shù)據(jù)，符合納入標(biāo)準(zhǔn)的樣本量僅為197例，在未來的研究中可擴(kuò)增數(shù)據(jù)容量，避免選擇性偏差。本研究聯(lián)合影像組學(xué)數(shù)據(jù)與基因組學(xué)數(shù)據(jù)構(gòu)建預(yù)測模型，增加了特征維度，并且研究結(jié)果較目前國內(nèi)外大多數(shù)研究具有更優(yōu)的預(yù)測效能。同時(shí)，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法及功能富富集分析為CCRCC患者提供了無創(chuàng)的分級診斷方式，并為靶向治療提供了潛在的生物學(xué)標(biāo)志。