?？谑泻．a品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的污染情況監(jiān)測分析

陳 晨，龐 燕，邵仁杰，李雪霞，夏乾峰

（1.海南醫(yī)學院公共衛(wèi)生與全健康國際衛(wèi)生學院，海南 海口 571199；2.海南醫(yī)學院熱帶轉化醫(yī)學教育部重點實驗，海南 ?？?71199；3.?？谑屑膊☆A防控制中心，海南 ?？?571199；4.海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學院，海南 ?？?571199）

海南作為熱帶島嶼地區(qū)，是國內海產品最豐富的省份之一。其中海口作為省會城市，日常生活中承擔了290 萬人口的海產品飲食所需。海口市海產品豐富多樣，也不乏一些細菌會存在于海產品中，常見的包括副溶血性弧菌和溶藻弧菌。副溶血性弧菌是一種革蘭陰性嗜鹽桿狀細菌，廣泛分布于多種海產品中，包括魚類、貝類、頭足類、蝦蟹類等［1］。根據現有的研究報道，絕大部分副溶血性弧菌的感染與食用海產品有關［2］。若食用了被副溶血性弧菌污染的、且未完全煮熟的海鮮可導致急性胃腸炎，同時伴有惡心、頭痛和低燒等癥狀［3］。溶藻弧菌是一種專性寄生于嗜鹽對蝦等海洋生物中的細菌［4］，可直接感染人類。人們可能通過接觸疫水或食用被污染的海產品感染，可引起嚴重的軟組織感染、敗血癥和其他腸道外感染［5］。近年來的研究也證實了副溶血性弧菌和溶藻弧菌是沿海地區(qū)腹瀉病的常見病原菌［6］。此外，中國疾病預防控制中心對2009 年～2018 年的急性腹瀉患者的監(jiān)測顯示，食源性弧菌是導致腹瀉的重要病原體之一，在所有致腹瀉相關病菌中，其所占比例約為10.83%［7］。

目前對于海南地區(qū)海產品中副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染情況的研究較少，本研究探究海南地區(qū)海產品中副溶血性弧菌和溶藻弧菌的整體污染情況，為控制海產品的污染控制提供依據，同時為促進公共衛(wèi)生的防控提供依據。

本研究監(jiān)測了2020～2022 年期間?？谑胁糠趾．a品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的流行情況，旨在為?？谑泻．a品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的污染情況提供可靠的數據支撐，有利于提高海產品質量，保護公眾健康。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 按照國家食品污染和有害因素風險監(jiān)測的要求，在海口市所轄個區(qū)：龍華區(qū)、美蘭區(qū)、瓊山區(qū)和秀英區(qū)的餐飲、超市、零售店采集119 份海產品；其中蝦類10 份，魚類59 份，貝類50份。每份樣本采集500～1 000 g，采集后在4 h 內送實驗室檢測。以上所有樣本資源均由?？谑屑部刂行娜藛T在2020～2022 年1～12 月所采集。

副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）（DS1400）和溶藻弧菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）（DS1430）購自于廣州達安生物科技有限公司。3%堿性蛋白胨水、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（TCBS）均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備 Incucell ICV 55 ECO 電熱恒溫培養(yǎng)箱（德國MMM 公司），7500FAST 熒光定量RCR 儀（美國Applied Biosystems 公司），T1000 電子天平（福州華志科學儀器有限公司），SterilGARDⅢ Advance SG403 生物安全柜（美國Baker 公司）。

1.2 方法

副溶血弧菌和溶澡弧菌的分離及鑒定：采用《食品安全國家標準食品微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗》（GB 4789.7-2013）為標準，進行樣本的前處理、增菌分離及鑒定。利用副溶血性弧菌和溶藻弧菌的核酸檢測試劑盒，采用實時熒光PCR 技術可疑菌落進行驗證鑒定。反應程序：50 ℃ 2 min，95 ℃預變性 15min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 45 s，40 個循環(huán)采集熒光。以副溶血弧菌和溶澡弧菌核酸檢測試劑盒提供的陽性質控品為陽性對照，陰性質控品為陰性對照。

1.3 統計學處理

采用SPSS 26.0 軟件對數據進行分析，陽性率的比較采用χ2檢驗，當理論頻數≥1 且＜5，則采用Fisher 精確檢驗，P＜0.05 差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 副溶血性弧菌和溶藻弧菌的初步分離

對采集的3 大類海產品進行TCBS 初步分離鑒定，結果如圖1 所示，TCBS 平板呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，疑似副溶血弧菌；如圖2 所示，TCBS 平板呈圓形，大而光滑的黃色菌落，疑似溶藻弧菌。

圖1 副溶血弧菌在TCBS 瓊脂上的菌落形態(tài)Fig 1 Colony morphology of Vibrio parahaemolyticus on TCBS agar

圖2 溶藻弧菌在TCBS 瓊脂上的菌落形態(tài)Fig 2 Colony morphology of Vibrio alginolyticus on TCBS agar

2.2 副溶血性弧菌和溶藻弧菌的確定鑒定

對3 大類海產品中分離疑似副溶血弧菌和溶藻弧菌的菌落進行實時熒光PCR 驗證確定，根據副溶血弧菌核酸檢測試劑盒的說明，副溶血弧菌的結果判定標準如下，陰性：無擴增曲線或Ct＞38；陽性：Ct≤38 且曲線有明顯的擴增曲線。如圖3 所示，樣品的Ct=12.57，陽性對照為Ct=24.53，陰性對照Ct=40，可以確定該樣品為副溶血弧菌。

圖3 部分副溶血弧菌Q-PCR 擴增曲線圖Fig 3 Q-PCR amplification plot of Vibrio parahaemolyticus

根據溶藻弧菌核酸檢測試劑盒的說明，溶藻弧菌的結果判定標準如下，陰性：無擴增曲線或Ct＞38；陽性：Ct≤38 且曲線有明顯的擴增曲線。如圖4所示，樣品的Ct=15.12，陽性對照為Ct=22.73，陰性對照Ct=40，可以確定該樣品為溶藻弧菌。

圖4 部分溶藻弧菌Q-PCR 擴增曲線圖Fig 4 Q-PCR amplification plot of Vibrio alginolyticus

2.3 不同種類海產品中副溶血性弧菌的檢出情況

2020～2022 年所采集的海口市市售魚類、蝦類、貝類3 大類的119 份樣品中，24 份樣品檢出副溶血性弧菌，總陽性率為20.1%（表1）。3 大類海產品中均檢出副溶血性弧菌，其中蝦類中陽性率最高，為50%；50 份貝類樣本中，副溶血性弧菌的陽性率為34%；魚類的陽性率較低。經Fisher 精確檢驗分析，各類樣品中副溶血性弧菌陽性率差異有統計學意義（χ2=23.529，P＜0.05）。

表1 ?？谑惺惺酆．a品副溶血性弧菌的檢出情況Tab 1 Detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood sold in Haikou market

2.4 不同種類海產品中溶藻弧菌的檢出情況

2020～2022 年所采集的海口市市售魚類、蝦類、貝類3 大類的119 份樣品中，46 份樣品檢出溶藻弧菌，總陽性率為38.7%（表2）。其中貝類的陽性率最高，為48%。經Fisher 精確檢驗分析，各類海產品中溶藻弧菌陽性率差異無統計學意義（χ2=3.688，P＞0.05）。

表2 ?？谑惺惺酆．a品溶藻弧菌的檢出情況Tab 2 Detection of Vibrio alginolyticus in seafood sold in Haikou market

2.5 不同年份海產品中副溶血性弧菌的檢出情況

按不同年份統計3 種海產品中副溶血性弧菌的檢出情況，2022 年副溶血性弧菌的陽性率最高，為25%（表3）。經卡方檢驗分析，不同年份海產品中副溶血性弧菌陽性率差異無統計學意義（χ2=1.10，P＞0.05）。

表3 不同年份海口市市售海產品副溶血弧菌的檢出情況Tab 3 Detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood sold in Haikou market in different years

2.6 不同年份海產品中溶藻弧菌的檢出情況

按不同年份統計3 種海產品中溶藻弧菌的檢出情況，其中2021 年溶藻弧菌的陽性率最高，為76.7%（表4）。經卡方檢驗分析，不同年份海產品中溶藻弧菌陽性率差異有統計學意義（χ2=42.573，P＜0.05）。

表4 不同年份海口市市售海產品溶藻弧菌的檢出情況Tab 4 Detection of Vibrio alginolyticus in seafood sold in Haikou market in different years

2.7 不同季度海產品中副溶血弧菌檢出情況

按不同季度統計3 種海產品中副溶血弧菌的檢出情況，第4 季度副溶血弧菌的陽性率高，為32.8%，第3 季度未檢出副溶血弧菌（表5）。經Fisher 精確檢驗分析，不同季度海產品中溶藻弧菌陽性率差異有統計學意義（χ2=61.645，P＜0.05）。

表5 不同季度海口市市售海產品副溶血弧菌的檢出情況Tab 5 Detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood sold in Haikou city by quarters

2.8 不同季度海產品中溶藻弧菌的檢出情況

按不同季度統計3 種海產品中溶藻弧菌的檢出情況，其中第2 季度溶藻弧菌的陽性率最高，為80%，第1 季度和第3 季度均未檢出溶藻弧菌（表6）。經Fisher 精確檢驗分析，不同季度海產品中溶藻弧菌陽性率差異有統計學意義（χ2=48.677，P＜0.05）。

表6 不同季度?？谑惺惺酆．a品溶藻弧菌的檢出情況Tab 6 Detection of Vibrio alginolyticus in seafood sold in Haikou city by quarters

3 討論

海口作為沿海旅游城市，不僅為常住居民供應海產品，還為旅行者提供大量海產品，銷量巨大，同時大量的常住居民有喜食生腌海鮮的習慣。因此，海產品的安全性值得重點關注。一項最新研究報道，?？谑杏筛比苎曰【鸬氖吃葱约膊≡谥饾u增長［8］。本研究中2020～2022 年海產品中副溶血性弧菌陽性率為21.0%，是低于李平等［8］關于?？谑?014 年～2016 年副溶血性弧菌陽性率（41.4%）。陽性率的下降與相關部門的監(jiān)督息息相關，說明增加海產品的監(jiān)管力度，提倡低溫存儲是十分重要的。4 個季度中，雖然第一季度陽性率最高，但是由于樣本量太小不具有代表性。除第1 季度外，第4季度的陽性率很高，這與倪云龍等［9］研究一致。溫度是影響海產品副溶血性弧菌污染的主要因素之一［10］。海口氣溫較高，為細菌生長提供了適宜的環(huán)境，尤其是在第2 和第3 季度［11］。海產品低溫存儲有效減少了副溶血性弧菌的感染風險。第2 和3 季度的海產品低溫存儲到位，但到第4 季度氣溫下降，常溫存儲的海產品的會成為滋生副溶血性弧菌的溫床，導致陽性率增加。在3 類海產品中，雖然蝦類的陽性率最高，但是由于樣本量太小不具有代表性。除蝦類之外，貝類的陽性率很高，與宮春波［12］和Yu 等［13］報道一致。不同產品的陽性率不同可能是由于生活區(qū)域及生活習性不同，導致對污染物的富集程度不同［14］。?？谑惺鄣暮．a品來源于人工規(guī)模養(yǎng)殖及海底捕撈，各年度樣品中副溶血性弧菌陽性率的差異無統計學意義，這與李平的研究報道一致［8］。

本研究中2020～2022 年在海產品中溶藻弧菌陽性率為37%，高于廣州（20.31%）和昆明（17.4%），低于廈門（81.4%）［15-17］。說明?？谑泻．a品溶藻弧菌的攜帶率比較高，應該引起監(jiān)管部門的重視。其中貝類的陽性率最高，與翁琴云等［17］報道一致，與貝類的生活習性及密切相關。各年份樣品中溶藻弧菌陽性率的差異有統計學意義，且在2021年存在高峰感染，說明2021 年海水的水質污染情況較為嚴重。各季度的溶藻弧菌陽性率的差異有統計學意義，第2 季度的溶澡弧菌陽性率最高，在該季度需要特別關注海產品的安全問題，加強監(jiān)管。

總體而言，?？谑懈比苎曰【腿茉寤【年栃月时绕渌》萆愿?，與樣品類別相關。有研究表明，溫度對于弧菌的生長十分重要［18］。高溫利于弧菌生長繁殖，?？诘靥師釒У貐^(qū)，常年高溫，會增加弧菌的陽性率。海產品的存儲管理需要根據不同的季節(jié)與氣溫變化靈活調整，以確保其質量與安全。監(jiān)管機構應該更加意識到弧菌感染的風險，并提出適當的控制措施。為了預防消費者收到海產品相關弧菌的感染，消費者在購買海產品時應該選擇優(yōu)質、新鮮的海產品，若購買的是包裝類的海產品，應購買符合食品安全標準并在保質期內的產品。在食用貝類海產品前，應徹底煮熟，以確?？赡艽嬖诘母比苎曰【腿茉寤【戎虏∥⑸锉挥行纾?9］。

作者貢獻度說明：

陳晨：數據整理、寫作原稿；龐燕：收集數據和實驗；邵仁杰：數據整理及實驗；李雪霞：提供研究思路，修改原稿；夏乾峰：提供資金、資源及監(jiān)管。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。