基于網絡藥理學和實驗驗證探討附子治療變應性鼻炎的作用機制研究

李 琳，丁 順，徐正揚，嚴旌仁，張啟萌，牟忠林

（海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科頭頸外科，海南 ?？?570102）

變應性鼻炎（allergy rhinitis，AR）是耳鼻咽喉科最常見的疾病之一，是一種鼻黏膜癥狀性、炎癥性與免疫性疾?。?］。變應性鼻炎可降低患者生活質量并導致其他疾病產生，如哮喘、阻塞性睡眠呼吸暫停等［2］，約80%的變應性鼻炎的患者臨床癥狀在20 歲之前出現(xiàn)并在20～40 歲達到高峰，然后逐漸下降［3］。AR 屬于一種多因素的疾病，它的致病機理復雜，牽扯了多種炎性細胞和炎性介質［4］。目前AR的治療選擇包括患者教育、避免接觸過敏原、藥物療法、免疫療法、中醫(yī)針灸、中醫(yī)方劑和手術等［5］。西醫(yī)藥物治療是目前AR 最主要的治療方式，但這些藥物往往容易引起如疲勞、激素抵抗和鎮(zhèn)靜等副作用［6］。因此目前需要一種有效且安全的藥物來防治AR［7］。自古以來，附子是臨床治療AR 的代表中藥，附子具有平喘、提高免疫功能、抗氧化、散寒止痛、抗寒抑菌的作用［8，9］。但是目前附子對AR 治療的具體作用機制仍有待確定。傳統(tǒng)基于單一組分的機制研究無法實現(xiàn)對中藥藥效的全面、系統(tǒng)的理解，網絡藥理學具有整體性、系統(tǒng)性的特征已被廣泛運用于中醫(yī)藥的研究，應用網絡藥理研究附子治療AR 的機制是可行的。

本研究應用網絡藥理學方法獲得附子治療AR的主要活性化合物成分及作用靶點基因，通過富集分析篩選出附子治療AR 潛在的生物學過程和信號通路。在此基礎上，建立AR 小鼠模型，觀察附子對AR 的治療作用。為進一步研究附子治療AR 的藥理機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件分析

通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫以生物活性成分為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥20%和（drug-likeness，DL）≥0.1 作為篩選條件，找到附子相關的活性化合物成分［10］。藥代動力學（absorption，distribution，metabolism，and eexcretion，ADME）是篩選附子生物活性化合物成分重要的限制因素，是指藥物化合物的吸收、分布、代謝和排泄。在藥代動力學中，口服生物利用度OB 和DL 是最重要的藥代動力學特性。OB 是指口服藥物從胃腸道吸收進入循環(huán)系統(tǒng)的速率和程度［11］。DL 是藥物設定的定性概念，可作為中草藥“類藥物”成分選用的依據(jù)。

1.2 附子的作用靶點基因篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出的附子活性化合物，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫［12］，設置篩選物種類別，將靶蛋白名稱轉為“gene symbol”表示，得到附子主要活性化合物對應的靶點基因，然后利用UniProt 數(shù)據(jù)庫對基因名稱進行標準化命名［13］，在去除重復基因后獲得附子活性化合物對應的靶點基因。

1.3 AR 的靶點基因篩選

GeneCards 數(shù)據(jù)庫是一個人類基因信息數(shù)據(jù)庫［14］，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，通過使用“allergic rhinitis”這個詞來搜索找到與AR 相關的靶點基因。

1.4 附子和AR 重疊靶點基因的獲得

通過在線工具Venny2.1 篩選出附子與AR 的重疊基因［15］，韋恩圖是一種常用的統(tǒng)計學圖表，它主要用于顯示元素集合重疊區(qū)域的圖示。附子治療AR 的靶點基因即是這些被篩選出來的重疊基因通過使用韋恩圖顯示。

1.5 “化合物-基因-疾病”網絡圖構建

通過數(shù)據(jù)庫篩選出附子治療AR 的靶點基因，使用Cytoscape 軟件構建化合物-基因-疾?。╟ompound-gene-disease，C-G-D）網絡圖進行可視化，利用網絡分析工具得出每個節(jié)點的連接度，表示于該節(jié)點直接連接的節(jié)點數(shù)目，連接度越大說明改節(jié)點在網絡中的作用越重要［16］。

1.6 蛋白互作網絡圖構建

附子和AR 的重疊基因通過STRING 數(shù)據(jù)庫進行蛋白質互作（protein-protein interaction，PPI）網絡研究，在0.4 的置信水平下構建了PPI 網絡圖［17］。將基于數(shù)據(jù)庫信息生成的PPI 網絡導入Cytoscape 軟件中，再使用 Cytoscape 中CytoHubba 插件依據(jù)MCC 算法篩選出最核心的前十位基因，這些基因是附子治療AR 的前10 個重要樞紐基因［18］。

1.7 富集分析

通過GO 功能數(shù)據(jù)庫可以幫助我們更好地理解基因功能，如細胞成分（cellular components，CC）、生物過程（biological processes，BP）和分子功能（molecular functions，MF）［19］。KEGG 功能數(shù)據(jù)庫是可以從中獲得基因及基因組信息的數(shù)據(jù)庫［20］。DAVID 數(shù)據(jù)庫是一款在線分析軟件，為了探索靶點蛋白的基因功能以及信號通路方面的具體作用，使用DAVID 數(shù)據(jù)庫中的功能注釋工具對附子中的活性化合物成分與AR 交互靶點基因進行GO 功能富集分析和KEGG 信號通路富集分析［21，22］，選取GO 功能富集分析中關于細胞成分、生物過程和分子功能的前十個關鍵詞，通過條形圖將結果可視化。選取KEGG 前20 個關鍵通路，設置P＜0.05，通過分析圖將結果可視化。

1.8 實驗驗證

1.8.1 實驗材料和方法 （1）實驗藥物：100 g 附子購自?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院，加入10 倍量去離子水浸泡10 min，武火煮沸，文火煎煮2 h，過濾得一煎液；二煎加入8 倍量去離子水，武火煮沸，文火煎煮1.5 h，過濾得二煎液，兩次煎煮液合并濃縮至生藥量為1.52 g/mL 的濃縮液，放置在-80 ℃的冰箱中保存。（2）實驗試劑：IL-6 和TNF-α 抗體購置于愛必信（上海）生物科技有限公司。

1.8.2 動物模型構建 選取購自于西安新區(qū)楓東新城實驗動物園的4～6 周齡雌性小鼠，體重約在（20±2）g。小鼠被飼養(yǎng)在SPF 級的動物實驗室中：溫度（22±2）℃、濕度（60±5）%、12 h 光/暗循環(huán)環(huán)境，所有實驗均按照中國國家實驗動物護理和使用指南進行。該研究獲得了海南醫(yī)學院倫理委員會的批準（動物倫理編號：HYLL-2021-382）。

經過適應性喂養(yǎng)1 周后，將30 只雌性小鼠隨機平均分為正常對照組（normal control group，NC group）、變應性鼻炎組（allergic rhinitis group，AR group）和附子組（radix aconiti lateralis preparata group，F(xiàn)uzi group）。根據(jù)參考文獻，經過適當?shù)恼{整創(chuàng)建了以下的AR 的小鼠模型［23］。在前14 d 中，附子組和變應性鼻炎組小鼠給予腹腔注射致敏液致敏，致敏液的成分是卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）40 μg 和Al（OH）31.5 mg 溶于生理鹽水，配成共0.2 mL 的致敏液，每2 天1 次，從第15 天到第21天，按每只40 μL 5%的OVA 滴鼻液滴入小鼠雙側鼻腔激發(fā)，每天1 次。第22 天到30 天，附子組小鼠按給藥劑量為1.56 g/kg 進行灌胃，每天1 次，同時為維持鼻部刺激，變應性小鼠組和附子組每隔1 天用OVA 滴鼻液激發(fā)，正常組小鼠用同體積的生理鹽水替代，第31 天，處死所有小鼠。

1.8.3 HE 染色 取各組小鼠的完整鼻腔黏膜，用4%的多聚甲醛水浸泡24 h，經脫水、浸蠟、包埋、切片等處理后，用蘇木精和伊紅法對石蠟包埋的鼻黏膜組織進行染色，用光學顯微鏡來評估和記錄組織病理學變化。

1.8.4 蛋白免疫印跡法檢測 從各組鼻黏膜組織中分離出蛋白，用于鑒定IL-6 和TNF-α 的表達。將提取的蛋白加入BSA 標準測定溶液中進行蛋白濃度的鑒定，用SDS-PAGE 凝膠電泳對蛋白質進行分離。蛋白質隨后被轉移到轉膜濾紙上，然后用5%的脫脂牛奶孵化2 h 后加入一抗并在4 ℃冰箱下孵育過夜。之后用TBST 洗膜，加入二抗溶液在室溫下孵育2 h。最后通過顯影儀器顯影并測量目標帶/相應的相對表達水平。

1.8.5 免疫組化法檢測 將脫蠟的石蠟切片用二甲苯和酒精中按梯度脫水。通過在90 ℃的緩沖液中浸泡6 min 使抗原愈合，然后用3%的H2O2孵化10 min 以滅活內源性過氧化氫酶。然后滴加BSA以封閉組蛋白，在4 ℃下加入TNF-α 和IL-6 的一級抗體，之后滴加二抗孵育20 min，再加入辣根酶標記鏈霉卵白素工作液孵育15 min，加入顯色液和蘇木素溶液。進行封片后使用倒置顯微鏡進行觀察。

1.9 統(tǒng)計學處理

采用描述性統(tǒng)計分析對實驗結果進行統(tǒng)計描述，兩組間采用t檢驗分析，多組間采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。所有的統(tǒng)計分析使用GraphPad Prism 8 進行分析。

2 結果

2.1 附子作用靶點基因的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中，將OB 和DL 作為靶點基因的篩選條件，找到附子的21 個活性化合物成分。關于附子的21 種生物活性化合物成分的詳細信息見表1。然后通過PubChem 數(shù)據(jù)庫，在剔除64 個重復基因后共得到附子的203 個作用靶點基因。

表1 附子21 種活性化合物的詳細信息Tab 1 Information on 21 Fuzi compounds in detail

表2 各組小鼠鼻黏膜組織IL-6 蛋白的表達灰度值統(tǒng)計表（n=10，±s）Tab 2 Statistical table of grayscale values of IL-6 protein expression in nasal mucosal tissue of mice in each group （n=10，±s）

表2 各組小鼠鼻黏膜組織IL-6 蛋白的表達灰度值統(tǒng)計表（n=10，±s）Tab 2 Statistical table of grayscale values of IL-6 protein expression in nasal mucosal tissue of mice in each group （n=10，±s）

組別正常對照組變應性鼻炎組附子組灰度值0.7502±0.0596 1.3355±0.0914 0.8415±0.0247 FP 71.312＜0.001

表3 各組小鼠鼻黏膜組織TNF-α 蛋白的表達灰度值統(tǒng)計表（n=10，±s）Tab 3 Statistical table of grayscale values of TNF-α protein expression in nasal mucosal tissue of mice in each group （n=10，±s）

表3 各組小鼠鼻黏膜組織TNF-α 蛋白的表達灰度值統(tǒng)計表（n=10，±s）Tab 3 Statistical table of grayscale values of TNF-α protein expression in nasal mucosal tissue of mice in each group （n=10，±s）

組別正常對照組變應性鼻炎組附子組灰度值0.2719±0.0251 0.8658±0.0292 0.5311±0.0369 FP 280.532＜0.001

2.2 AR 靶點基因及重疊靶點基因的篩選

通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫，在去除重復基因后篩選出AR 相關的靶點基因1 832 個，然后使用Venny 2.1 軟件建立附子的203 個靶點基因和AR 的1 832個靶點基因的連接，共篩選出68 個重疊基因，AR 和附子重疊靶點基因的韋恩圖見圖1，這是附子治療AR 的作用靶點基因。

圖1 AR 和附子重疊靶點基因的韋恩圖Fig 1 Allergic Rhinitis and Fuzi targets depicted in a Venny diagram

2.3 “化合物-基因-疾病”網絡圖構建

化合物-基因-疾病”網絡圖是研究中藥治療疾病基本過程的有價值的工具。利用Cytoscape 軟件構建AR 和附子的“化合物-基因-疾病”網絡圖如圖2 所示，中間紅色多邊形節(jié)點表示疾病，淺綠色長方形節(jié)點表示附子主要活性化合物包括去氧穿心蓮內酯（deoxyandrographolide）、谷甾醇（sitosterol）、水黃皮素（karanjin）和次烏頭堿（hypaconitine）等，深綠色長方形節(jié)點表示附子和AR 的重疊基因，如PTGS2、TNF、ALB、CXCL8、IL6、VEGFA、JUN等。每種活性成化合物連接多個靶點，多個靶點也連接多種成分，通過該網絡圖可以表明附子能通過其中的多種化合物成分作用于多個靶點，從而對AR 起治療作用。

圖2 “化合物-基因-疾病”網絡圖Fig 2 "Compound-Gene-Disease" network diagram

2.4 PPI 網絡圖的構建

使用STRING 數(shù)據(jù)庫建立一個附子和AR 重疊基因的PPI 網絡圖，見圖3，該網絡包括68 個節(jié)點和860 個連接，然后利用CytoHubba 插件中MCC 算法方法篩選出附子治療AR 的前10 個重疊樞紐基因主要為PTGS2、TNF、IL6、AKT1、AL8、STAT3、CCL2、CXCL8、VEGFA、JUN，并構建前10 位重疊樞紐基因網絡圖見圖4，這些基因是附子治療AR 的關鍵基因。

圖3 重疊基因的PPI 網絡圖Fig 3 PPI network diagram of overlapping genes

圖4 MCC 算法分析附子治療AR 的前10 位樞紐重疊基因網絡圖Fig 4 The top 10 hub gene network of Fuzi therapy in response to Allergic Rhinitis were analyzed using MCC

2.5 GO 功能富集分析

將68 個重疊靶點基因輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 功能富集分析，從而可以說明附子治療AR 存在多種潛在靶點的生物學功能。GO 功能富集分析圖見圖5 所示，在GO 功能富集分析中，其中GO 功能富集在BP 方面，選取排位前10 位相關條目，主要涉及轉錄正調控、一氧化氮生物合成過程正調控、平滑肌細胞增殖、腫瘤壞死因子產生的正調控等。在CC 中，選取排位前10 位相關條目，主要是細胞表面、質膜、蛋白復合物和頂端質膜參與主要的細胞成分。在MF 中，選取排位前10 位相關條目，主要包括與轉錄調控區(qū)的DNA 結合、轉錄因子的結合、核心啟動子近端區(qū)的序列特異性的DNA 結合、蛋白質細胞外基質的結合等。

圖5 GO 功能富集分析圖Fig 5 Evaluation of targets based on the GO

2.6 KEGG 功能富集分析

為了探索附子的活性化合物成分通過靶點基因治療AR 的作用途徑，將附子治療AR 的共同靶點主要富集在20 條通路上（P＜0.05），進一步構建KEGG 功能富集分析圖，見圖6 所示，包括TNF 信號通路、T 細胞受體信號通路、Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路等信號通路。選取Toll 樣受體信號通路圖進行展示，見圖7，其中綠色代表共同基因，結合PPI 網絡圖中核心靶點基因包含了Toll 樣受體信號通絡中IL-6 和TNF-α 樞紐基因，因此選擇該通路進行后續(xù)研究。

圖6 KEGG 功能富集分析圖Fig 6 KEGG functional enrichment analysis diagram

圖7 Toll 樣受體信號通路圖Fig 7 Toll-like receptor signaling pathway

2.7 附子對AR 小鼠鼻黏膜組織病理變化的影響

采用HE 染色法來觀察各組小鼠鼻黏膜組織組織學變化結果見圖8。正常小鼠組細胞排列整齊，細胞結構完整。與正常組小鼠相比，變應性鼻炎組的鼻黏膜組織表現(xiàn)出不同程度的黏膜完整性的破壞和塌陷，纖維組織增生和炎癥細胞浸潤的特征。對比變應性鼻炎組，附子組小鼠明顯減少了上述的病理改變。

圖8 HE 染色法觀察各組小鼠鼻黏膜組織學變化（×40）Fig 8 Histological changes of tissues in different experimental mice groups as determined by HE staining（×40）

2.8 蛋白免疫印跡法檢測IL-6 和TNF-a 的蛋白表達水平

通過蛋白免疫印跡法檢測各組小鼠鼻黏膜中IL-6 和TNF-α 的表達灰度值統(tǒng)計表分別見表2-3。各組小鼠鼻黏膜IL-6 和TNF-α 表達水平的WB 檢測結果見圖9。結果顯示變應性鼻炎組小鼠鼻黏膜的IL-6 和TNF-α 蛋白的表達和正常對照組小鼠相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1）。變應性鼻炎組小鼠鼻黏膜的IL-6 和TNF-α 蛋白表達量高于附子組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P=0.000 2；P＜0.000 1）。附子組小鼠鼻黏膜中的IL-6 表達與正常對照組相比，不具有統(tǒng)計學差異（P=0.269 7）；附子組小鼠鼻黏膜中TNF-α 的表達與正常對照組相比，具有統(tǒng)計學差異（P=0.000 1）。以上結果表明，IL-6 和TNF-α 在小鼠鼻黏膜組織中存在并表達，附子可以通過調節(jié)IL-6 和TNF-α 的表達來減少炎癥反應，這反過來又證實了網絡藥理學分析的結果。

圖9 各組小鼠鼻黏膜IL-6 和TNF-α 表達水平的WB 檢測結果Fig 9 WB results of IL-6 and TNF-α expression levels in the nasal mucosa of mice in each group

2.9 免疫組化法檢測IL-6 和TNF-a 的蛋白表達水平

為了證實網絡藥理學數(shù)據(jù)的有效性，對各小組小鼠鼻黏膜進行免疫組化檢測，各組小鼠鼻黏膜組織IL-6 的表達水平統(tǒng)計表分別見表4、5。各組小鼠鼻黏膜IL-6 和TNF-α 表達水平的免疫組化檢測結果見圖10。IL-6 和TNF-α 蛋白陽性顆粒大部分存在于細胞膜和細胞漿中，呈棕褐色或棕黃色。正常組小鼠鼻黏膜上皮未受損，未見炎癥細胞浸潤，而變應性鼻炎組小鼠腺體和黏膜上皮染色較深，鼻黏膜上皮受損，附子組小鼠鼻黏膜損傷明顯較輕，腺體增生程度較少，炎癥細胞浸潤量較少。結果顯示變應性鼻炎組小鼠鼻黏膜IL-6 和TNF-α 陽性表達高于正常對照組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001；P＜0.001）。附子組小鼠鼻黏膜IL-6 和TNF-α 陽性表達高于正常對照組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；P＜0.05）。附子組IL-6 和TNF-α 表達低于變應性鼻炎組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001；P＜0.05）。結果表明，附子改善小鼠鼻黏膜的炎癥反應。

圖10 各組小鼠鼻黏膜IL-6 和TNF-α 表達水平的免疫組化檢測結果Fig 10 Immunohistochemical detection of IL-6 and TNF-α expression levels in the nasal mucosa of mice in various groups

表5 各組小鼠鼻黏膜組織TNF-α 的表達水平統(tǒng)計表（n=10，±s）Tab 4 Statistical table of the expression level of TNF-α in the nasal mucosa tissue of mice in each group（n=10，±s）

表5 各組小鼠鼻黏膜組織TNF-α 的表達水平統(tǒng)計表（n=10，±s）Tab 4 Statistical table of the expression level of TNF-α in the nasal mucosa tissue of mice in each group（n=10，±s）

組別正常對照組變應性鼻炎組附子組TNF-α 0.24±0.08 0.59±0.08 0.32±0.10 FP 43.732＜0.001

表4 各組小鼠鼻黏膜組織IL-6的表達水平統(tǒng)計表（n=10，±s）Tab 4 Statistical table of the expression level of IL-6 in the nasal mucosa tissue of mice in each group （n=10，±s）

表4 各組小鼠鼻黏膜組織IL-6的表達水平統(tǒng)計表（n=10，±s）Tab 4 Statistical table of the expression level of IL-6 in the nasal mucosa tissue of mice in each group （n=10，±s）

組別正常對照組變應性鼻炎組附子組IL-6 0.20±0.05 0.53±0.12 0.28±0.17 FP 41.683＜0.001

3 討論

AR 主要是由特應性個體接觸過敏原后由IgE介導的炎癥性鼻?。?4］。在特應性個體中，暴露于室內和室外過敏原（包括花粉、霉菌、塵螨和動物皮屑）可能會促進抗原特異性IgE 的產生。過敏原的重新引入會觸發(fā)早期和晚期反應，導致AR 的臨床表現(xiàn)［25］。中藥具有多成分、多靶點和多作用途徑的特性，并且中醫(yī)治療具有高治愈率和成本低等特點［26］，因此越來越多的人選擇使用中醫(yī)藥療法治療AR［27］。從中醫(yī)角度來看，中醫(yī)認為鼻子可以反映肺的生理和病理表現(xiàn)。由于外邪（中醫(yī)認為是致病因素）經口、鼻侵入人體，侵入鼻腔，損害肺的宣降功能，導致津液失調，導致體液變成痰和黏液。這最終導致AR 的形成［28］。AR 多源于正氣不足，在治療上，一直以益氣溫陽為主要原則，附子自古是臨床治療虛弱冷綜合征AR 的典型中藥［29，30］，附子辛熱溫里，助少陰陽氣［31］，具有提高免疫力和抗炎抗氧化等功能［32］。另一方面，附子治療AR 的作用機制尚不清楚，應用網絡藥理學可以研究草藥或草藥處方的成分、目標、途徑和作用模式的復雜性［33］，更準確地預測附子治療AR 的靶點基因和主要作用信號通路。

本研究利用網絡藥理學來闡明附子在AR 治療中的潛在生理過程。以OB≥20%和DL≥0.1 的篩選條件下，共篩選出附子的21 種生物活性化合物成分和203 個靶點基因，生物活性化合物成分包括去氧穿心蓮內酯、水黃皮素和次烏頭堿等，這是附子治療AR 的主要活性化合物。去氧穿心蓮內酯含有二萜內酯、黃酮和多酚［34］，在許多研究中，它已被證明具有抗炎特性［35］，去氧穿心蓮內酯具有二萜內酯和五元內酯環(huán)的基本結構發(fā)揮抗炎作用［36］。水黃皮素是一種活性呋喃類黃酮，黃酮類化合物是一種抗炎因子。在大鼠模型的研究表明，水黃皮素通過阻斷H+和K+ATP 酶而具有抗炎的特性［37］。次烏頭堿可以保護上皮細胞免受氧化應激［38］。在小鼠中，次烏頭堿已被證明具有有效的抗炎作用，能夠抑制環(huán)氧合酶-2、腫瘤壞死因子、白細胞介素-1 和前列腺素E2 的產生［39］。

根據(jù)各靶點基因的重要程度，我們選擇了前10個重要樞紐基因PTGS2、TNF、IL6、AKT1、ALB、STAT3、CCL2、CXCL8、VEGFA、JUN。PTGS2是產生前列腺素家族的關鍵酶，是非甾體類藥物的作用靶點，目前已知可參與細胞炎癥、細胞凋亡等生理活動，PTGS2 轉錄由多個與炎癥信號通路相關的細胞因子觸發(fā)，包括核因子B、激活蛋白1 和CCAAT 增強子結合蛋白［40］。TNF-α 是TNF 家族的成員，可調節(jié)細胞死亡，促進細胞質膜破裂導致炎癥因子的釋放［41］。IL-6 限制了中性粒細胞的產生，并增加了粒細胞的死亡。在AR 中，從快速的宿主防御到適應性持續(xù)的全身炎癥的變化均與IL-6的促炎作用有關。AKT1 是P13K 信號通路的重要組成部分，促進鼻黏膜細胞存活和增殖［42］。CCL2刺激損傷部位的單核細胞和巨噬細胞的遷移和黏附，當CCL2 與其受體接觸時會觸發(fā)一系列炎癥反應。CXCL8 參與組織愈合和血管過程，并通過與白細胞受體結合［43］，招募白細胞到炎癥和損傷部位。VEGFA 是一種內皮成纖維細胞生長因子，作為血管生成的調節(jié)器，可通過控制內皮細胞的完整性和活性，從而產生最佳的血管形態(tài)和功能，并刺激動脈內皮細胞和巨噬細胞［44］，VEGFA 在AR 中具有抗凋亡和血管完整性的功能。

通過KEGG 富集分析，在HIF-1、Toll 樣受體、T 細胞受體和TNF 信號通路中發(fā)現(xiàn)了附子治療AR 相關的樞紐靶點基因。HIF-1 受體信號通路介導的轉錄調控是對抗缺氧相關細胞應激的重要組成部分，機體在抗感染時，血液循環(huán)減慢，促炎性細胞因子和抗原消耗更多的氧氣，導致局部缺氧和HIF 的激活。HIF 可以無限期地存在，并參與核轉錄因子的激活代謝反應，然后可以激活IL-4 產生的巨噬細胞，增強NLRP3 炎性小體的激活，增強IL-1、IL-6 等炎癥細胞因子的釋放［45］。在AR 小鼠中，由于HIF-1 信號通路的激活，炎癥細胞可從鼻黏膜浸潤到氣道的細胞外環(huán)境中［46］。TNF 信號通路是炎癥反應的重要通路，雖然它可以導致某些被病毒感染細胞的死亡，但它對正常細胞沒有影響，甚至可以刺激它們的發(fā)育。T 細胞受體通路是免疫應答的重要組成部分，它們結合外源性肽導致T 細胞的活化，當遞質被激活時，CD4+向T 細胞發(fā)出信號［47］，而CD4+細胞又在AR 的調控中起著重要作用，因此T 細胞受體信號通路在AR 的調控中發(fā)揮重要作用。Toll 樣受體是Ⅰ型跨膜蛋白天然免疫模式識別受體，可識別自然界中的病原體相關分子模式，啟動細胞內信號通路，激活先天免疫反應［48］，TLR 信號通路基因的遺傳變異會推動炎癥和過敏性疾病的進展［49］。從Toll 樣信號通路圖中顯示：IL-6 和TNF-α 是與Toll 樣受體信號通路相連的兩個樞紐基因，IL-6 和TNF-α 是重要的炎癥細胞因子，經常出現(xiàn)在身體炎癥反應的各個部位，它們會增強炎癥反應，并已被證明與AR 相關［50］。經網絡藥理學相關數(shù)據(jù)庫及MCC 算法分析附子治療AR 的前10 個樞紐重疊基因網絡圖中主要有IL-6 及TNFα?；谏鲜鲅芯拷Y果，在后續(xù)動物實驗研究中，對主要靶點基因IL-6 和TNF-α 進行實驗驗證。實驗結果顯示，附子主要可以通過抑制小鼠鼻黏膜中Toll 樣信號通路的活化，降低IL-6 和TNF-α 的表達活性，從而改善了AR 小鼠的炎癥改變。本研究首次探討了Toll 樣受體信號通路（IL-6 和TNF-α）在AR 中的功能和作用，為后續(xù)附子治療AR 研究提供扎實的基礎。

綜上所述，本研究初步探討了附子治療AR 的主要作用機制。從網絡藥理學基礎上探索附子治療AR 的可能治療靶點和信號通路，為附子精準治療AR 提供科學依據(jù)，為附子的傳承和創(chuàng)新奠定基礎。

作者貢獻度說明：

牟忠林：構思并設計了該研究和實驗；李琳：負責數(shù)據(jù)收集處理及文章撰寫；丁順、徐正楊、嚴旌仁、張啟萌：負責實驗思路及最終文章的修改。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。