SREBP1 在乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌中表達(dá)意義的探討

鄧慧孜，鄭 晶，翁 陽，魏 尚

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，海南 ?？?570100）

原發(fā)性肝癌是全球惡性腫瘤最常見的類型之一，在所有癌癥中發(fā)病率居第6 位、死亡率居第3位［1］。在原發(fā)性肝癌的所有病理組織學(xué)類型中，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最主要的類型，占其中75%～85%［2］，更是原發(fā)性肝癌中的研究重點(diǎn)。在我國，肝細(xì)胞癌主要的致病危險(xiǎn)因素包括慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus ，HBV）感染與黃曲霉毒素暴露［3］。慢性乙型肝炎病毒長期感染人體后，使肝細(xì)胞處于慢性炎癥刺激狀態(tài)，損害肝臟的脂質(zhì)合成、代謝及儲(chǔ)藏功能。當(dāng)肝臟調(diào)節(jié)脂質(zhì)的功能受損后，肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝異常，促進(jìn)正常肝細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦卫w維化及肝癌［4］。

近年來，許多研究證明當(dāng)細(xì)胞腫瘤變時(shí)，體內(nèi)三大營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生代謝重編程［5，6］，特別是以脂質(zhì)從頭合成（de novo lipogenesis，DNL）為主要特征［7-9］。脂質(zhì)從頭合成在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中占據(jù)非常重要地位［10］。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding proteins 1，SREBP1）是人體內(nèi)調(diào)控脂質(zhì)合成代謝的重要核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控整個(gè)脂質(zhì)從頭合成途徑中限速酶基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［5，11-13］，導(dǎo)致脂質(zhì)合成異常增多，從而為腫瘤細(xì)胞無限快速生長提供重要的原料與能量。近年來多項(xiàng)研究指出，SREBP1 在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，例如腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肝癌等，并且很大程度影響著腫瘤各種惡性生物學(xué)行為的轉(zhuǎn)化［14］。

在我國乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌非常常見，且慢性乙型肝炎病毒感染及SREBP1 表達(dá)上調(diào)均能影響肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，但目前關(guān)于SREBP1 表達(dá)與乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌的病毒DNA 水平等臨床病理特征的相關(guān)性研究報(bào)道卻較少。本研究擬通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)SREBP1 蛋白質(zhì)水平在乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，探討SREBP1表達(dá)與乙肝病毒DNA 水平等臨床病理特征的相關(guān)性，為乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌發(fā)生與發(fā)展相關(guān)機(jī)制提供新的研究方向。

1 資料和方法

1.1 樣本收集

收集2019 年8 月1 日～2022 年6 月3 日在海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院住院，行外科手術(shù)切除治療后，經(jīng)過我院臨床及病理證實(shí)的乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌組織及配對(duì)癌旁肝組織樣本共91 例。收集每例樣本的癌旁肝組織與肝細(xì)胞癌組織距離均≥2 cm。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料較完整；（2）無術(shù)前放療、化療病史；（3）無其它惡性腫瘤者；（4）無其它類型肝炎病毒感染者。本研究標(biāo)本使用經(jīng)過海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過，參加本研究的所有肝細(xì)胞癌患者或家屬均簽署了書面知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織芯片制作 所有收集的樣本均經(jīng)臨床醫(yī)生指導(dǎo)后完成取材，再浸泡于足量的10%中性福爾馬林固定劑（4% 甲醛溶液）、室溫下充分固定10～12 h，最后制成石蠟標(biāo)本，再按照傳統(tǒng)病理組織石蠟切片制備技術(shù)制成HE 切片。光學(xué)顯微鏡下選取代表性區(qū)域：腫瘤組織選取出血壞死少且腫瘤細(xì)胞集中區(qū)域，配對(duì)癌旁組織避開肝細(xì)胞脂肪變區(qū)域。然后應(yīng)用空芯針制備組織芯片。從每個(gè)組織蠟塊的代表性區(qū)域鉆出直徑約1.4 mm 的圓柱體，按順序和數(shù)量依次以規(guī)則的陣列方式嵌入制備好的石蠟毛坯模孔中，并在合適位置選取唾液腺組織作為標(biāo)志。石蠟?zāi)K平置于包埋模具上，表面淋熱蠟封邊，在60 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烤60 min，使石蠟稍融化以封閉組織塊，然后取出石蠟?zāi)K在室溫下靜置約10～15 min 冷卻，再放入4 ℃冰箱充分冷凍后取出脫模。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色方法（Envision System 二步法）上述已制備好的組織芯片石蠟包埋塊切白片，厚度3.5～4 μm。經(jīng)常規(guī)60 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烤片過夜或65 ℃烤片約2～3 h，使組織中及周邊的石蠟充分融化；二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、Tris-EDTA 修復(fù)抗原，冰浴冷卻后在37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育SREBP1 第一抗工作液（美國 Santa Cruz 公司，sc-365513，稀釋比例1∶50）40 min，再經(jīng)第二抗體（山羊抗鼠兔，福州邁新公司）封閉、DAB（福州邁新公司）顯色、蘇木素復(fù)染，分化，返藍(lán)及封片后，最后由3 名病理資深醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立完成判讀，每塊組織均隨機(jī)選取十個(gè)視野進(jìn)行判讀計(jì)數(shù)，最后以總平均數(shù)作為最終結(jié)果。SREBP1 蛋白免疫組織化學(xué)染色方法結(jié)果判讀：陽性為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中顯示顆粒狀或點(diǎn)狀的黃色、棕色或褐色著色。染色表達(dá)強(qiáng)度無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；陽性表達(dá)范圍＜1%為0 分，1%～24%為1 分，25%～49%為2 分，50%～75%為3 分，＞75%為4 分。染色最終分?jǐn)?shù)=染色表達(dá)強(qiáng)度×陽性表達(dá)范圍。本研究將染色最終分?jǐn)?shù)≤3 分，定義為SREBP1 蛋白低表達(dá)組；染色最終分?jǐn)?shù)＞3 分，定義為SREBP1 蛋白高表達(dá)組［15］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS Statistics 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)處理分析，以P＜0.05 定義為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)數(shù)資料均采用χ2檢驗(yàn)，結(jié)果以率或百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 SREBP1 蛋白在肝細(xì)胞癌組織及癌旁肝組織中的表達(dá)情況

在肝細(xì)胞癌中，SREBP1 蛋白主要于細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色和（或）棕褐色顆粒染色（圖1D）；而在癌旁肝組織內(nèi)，SREBP1 蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)淡黃色或幾乎無著色（圖1B）。免疫組化檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果：91 例乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌組織中80 例SREBP1 蛋白高表達(dá)，11 例低表達(dá)，高表達(dá)率為87.91%（80/91）；91 例癌旁肝組織中4 例SREBP1 蛋白高表達(dá)，87 例低表達(dá)，高表達(dá)率為4.40%（4/91）。與癌旁肝組織相比，SREBP1 蛋白在乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌中表達(dá)明顯上調(diào)（χ2=127.701，P＜0.001），見表1。

表1 SREBP1 蛋白在91 例肝細(xì)胞癌與癌旁肝組織的表達(dá)比較Tab 1 Comparison of SREBP1 protein expression in 91 cases of hepatocellular carcinoma and adjacent liver tissues

圖1 免疫組化檢測(cè)SREBP1 蛋白在肝細(xì)胞癌、癌旁肝組織中的表達(dá)（×400）Fig 1 The expression of SREBP1 protein in hepatocellular carcinoma and adjacent liver tissues was detected by immunohistochemistry（×400）

2.2 SREBP1 蛋白表達(dá)與在肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系

對(duì)91 例乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者SREBP1 蛋白的表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SREBP1 蛋白的表達(dá)水平與腫瘤分化程度（χ2=6.262，P=0.012）及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)相關(guān)（χ2=4.243，P=0.039）：在中低分化肝細(xì)胞癌組中SREBP1 蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，高表達(dá)率為92.21%（71/77）；在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)肝細(xì)胞癌組中SREBP1 蛋白高表達(dá)率為95.35%（41/43）。而與患者年齡、性別、腫瘤最大徑、微血管轉(zhuǎn)移、門靜脈侵犯、衛(wèi)星灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性，見表2。在91 例乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者中，與乙肝病毒DNA 低載量組（0～103 IU/mL）相比，SREBP1 蛋白的表達(dá)水平在乙肝病毒DNA 高載量組（＞103 IU/mL）中明顯上調(diào)（χ2=4.287，P=0.038），見表3。

表2 91 例肝細(xì)胞癌中SREBP1 蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 The relationship between the expression of SREBP1 protein and clinicopathological features in 91 cases of hepatocellular carcinoma

表3 91 例乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌SREBP1 蛋白表達(dá)與乙肝病毒DNA 載量的關(guān)系Tab 3 The relationship between SREBP1 protein expression and HBV DNA load in 91 cases of HBV infection-associated hepatocellular carcinoma

3 討論

肝細(xì)胞癌是全球患病率、死亡率極高的惡性腫瘤。近年來，眾多學(xué)者從篩選肝細(xì)胞癌的致病危險(xiǎn)因素到早期診斷，接著探索可評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后和監(jiān)測(cè)治療效果的分子標(biāo)記物，再到研發(fā)新型靶向治療藥物及探討各種耐藥機(jī)制等方面均取得了一定的進(jìn)展［16-18］。肝細(xì)胞癌發(fā)病隱匿、腫瘤生長迅速，時(shí)常合并肝內(nèi)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，處于腫瘤晚期階段的患者治療方式非常有限，治療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)沉重且療效不理想，以上現(xiàn)象表明肝細(xì)胞癌預(yù)后不容樂觀。因此，尋找促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的分子標(biāo)記物對(duì)提高肝細(xì)胞癌早期診斷率、判斷疾病預(yù)后至關(guān)重要。

許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌其中一個(gè)重要致病原因是代謝相關(guān)脂肪性肝病（metabolic associatedfatty liver disease，MAFLD）［19-21］，脂質(zhì)代謝異常在肝良性病變，甚至是肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。SREBP1 是一種調(diào)控脂質(zhì)合成的核轉(zhuǎn)錄因子，其在脂質(zhì)從頭合成途徑中扮演著關(guān)鍵角色。DNL 是將循環(huán)中的碳水化合物（如葡萄糖）和氨基酸（包括谷氨酰胺）中的碳轉(zhuǎn)化為脂肪酸的過程，脂肪酸可以進(jìn)一步與甘油縮合成甘油三酯或其他脂質(zhì)。從頭合成的脂質(zhì)既可以為腫瘤細(xì)胞提供生物膜基質(zhì)，又作為第二信使傳遞關(guān)鍵信息，還是能量的重要來源，故脂質(zhì)從頭合成在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中占據(jù)非常重要地位［10］。Jun 等［22］研究表明膽固醇的累積通過P53 被抑制及活化β-catenin 的促癌途徑加速腸癌進(jìn)一步發(fā)展；Wu 等［23］研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移與以3P-羥基類固醇-A24 還原酶為媒介轉(zhuǎn)導(dǎo)的膽固醇代謝在人體肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)息息相關(guān)；Blucher 等［24］指出脂肪酸能夠加速乳腺癌細(xì)胞的生長和遷移，Takumi 等［25］認(rèn)為淋巴瘤可因腫瘤周圍微環(huán)境被脂肪酸改變進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及發(fā)展。以上研究均證實(shí)脂質(zhì)代謝能增進(jìn)腫瘤的活性。生理情況下，SREBP1 先以無活性狀態(tài)停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，當(dāng)被激活后遷移至細(xì)胞核中，促進(jìn)脂質(zhì)合成相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)研究在組織芯片基礎(chǔ)上，通過免疫組織化學(xué)染色方法，檢測(cè)SREBP1 蛋白在91 例乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌與癌旁肝組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明SREBP1 蛋白在癌旁肝組織中主要于細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，而在肝細(xì)胞癌中則更多集中于細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，這說明在肝細(xì)胞癌中原本無活性的SREBP1被激活后，從細(xì)胞質(zhì)遷移至細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)一步發(fā)揮其功能作用。并且SREBP1 蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)均顯著高于癌旁肝組織，以上與佟易凡等［15］部分研究結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還顯示，SREBP1 蛋白的表達(dá)水平與腫瘤分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)相關(guān)：在中低分化肝細(xì)胞癌組及有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)肝細(xì)胞癌組中SREBP1 蛋白均呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)。以上提示SREBP1 蛋白可能參與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的過程，并提示SREBP1 作為促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展分子標(biāo)記物的可能性。

肝細(xì)胞癌的發(fā)病目前被認(rèn)為是由多種危險(xiǎn)因素、多個(gè)步驟相互共同作用。在我國，約92%肝細(xì)胞癌患者與慢性乙型肝炎病毒感染相關(guān)［26］。有報(bào)道指出，慢性病毒性肝炎可引起肝內(nèi)脂質(zhì)合成及代謝紊亂，病毒的長期作用可促進(jìn)肝臟炎癥-纖維硬化-肝癌的疾病進(jìn)展。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)從頭合成與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［6，27］，肝臟又是人體脂質(zhì)從頭合成的中心部位，因此進(jìn)一步探討肝細(xì)胞癌中脂質(zhì)從頭合成的意義重大。在脂質(zhì)從頭合成過程中扮有重要角色的SREBP1 與乙肝病毒DNA 載量在乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌中的相關(guān)性研究還未見報(bào)道。本研究對(duì)SREBP1 與肝細(xì)胞癌乙肝病毒DNA 載量的關(guān)系分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示：在乙肝病毒感染相關(guān)性肝細(xì)胞癌中，SREBP1蛋白在乙肝病毒DNA 高載量組（＞103 IU/mL）中表達(dá)明顯上調(diào)，提示SREBP1 蛋白表達(dá)與乙肝病毒復(fù)制活性存在相關(guān)性，為乙肝病毒感染相關(guān)性肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)機(jī)制探究提供新的研究方向。

綜上，本研究顯示，SREBP1 蛋白的表達(dá)與肝細(xì)胞癌存在相關(guān)性，且呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，為后續(xù)肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)機(jī)制研究提供方向及理論依據(jù)。本研究結(jié)果還顯示，SREBP1 蛋白表達(dá)與乙肝病毒復(fù)制活性存在相關(guān)性，為乙肝病毒感染相關(guān)性肝癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)機(jī)制探究提供新的研究方向。

作者貢獻(xiàn)度說明：

鄧慧孜：負(fù)責(zé)組織收集、病例資料收集和整理、免疫組化實(shí)驗(yàn)、切片染色結(jié)果判讀及論文撰寫；鄭晶：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、切片染色結(jié)果判讀及文章審核校準(zhǔn)；翁陽：負(fù)責(zé)切片染色結(jié)果判讀及文章審核校準(zhǔn)；魏尚：負(fù)責(zé)病例資料收集和整理。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。