堿韭總黃酮含量測定方法優(yōu)選

高雪峰 高健 楊昱萍 門中華 董貴成 趙鵬

摘 要：目的：篩選適用于測定堿韭總黃酮含量的試驗方法，并對不同采集年份、不同部位堿韭總黃酮進行分析評價。方法：以蘆丁為對照品，堿韭葉為試驗材料，對比NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法、AlCl3比色法、直接測定法對堿韭總黃酮含量測定的影響。然后對AlCl3比色法測定條件（顯色時間、AlCl3加入量、顯色溫度、pH值和乙醇的濃度）進行了優(yōu)化。結(jié)果：選用AlCl3比色法測定的結(jié)果準確可靠，采用優(yōu)化后的AlCl3比色法測定條件測得堿韭總黃酮主要存在于葉和花中，平均含量為（38.60±5.79）mg·g-1。結(jié)論：堿韭具有較高的黃酮應(yīng)用價值，可作為食品黃酮類添加劑和營養(yǎng)保健食品開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞：堿韭；AlCl3比色法；總黃酮

Optimization of Determination Method of Total Flavonoids Content in Allium polyrhizum Turcz. ex Regel

GAO Xuefeng1， GAO Jian1， YANG Yuping1， MEN Zhonghua1， DONG Guicheng2， ZHAO Peng1*

（1.School of Biological Science and Technology， Baotou Teachers College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou 014030， China; 2.College of Life Science， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010011， China）

Abstract： Objective： To screen test methods suitable for determining the total flavonoid content of Allium polyrhizum Turcz. ex Regel， and to analyze and evaluate the total flavonoid content of Allium polyrhizum Turcz. ex Regel in different collection years and parts. Method： Using rutin as the reference material and Allium polyrhizum Turcz. ex Regel leaves as the experimental material， the effects of NaNO2-Al（NO3）3-NaOH colorimetric method， AlCl3 colorimetric method， and direct determination method on the determination of total flavonoid content in Allium polyrhizum Turcz. ex Regel were compared. Then， the determination conditions of the AlCl3 colorimetric method （color development time， AlCl3 addition amount， color development temperature， pH value， and ethanol concentration） were optimized. Result： The results obtained by using AlCl3 colorimetric method were accurate and reliable. The optimized AlCl3 colorimetric method was used to determine the conditions under which the total flavonoids of alkali leeks mainly exist in leaves and flowers， with an average content of （38.60±5.79）mg·g-1. Conclusion： Allium polyrhizum Turcz. ex Regel has high flavonoid application value and can be used as a food flavonoid additive and nutritional health food development and utilization.

Keywords： Allium polyrhizum Turcz. ex Regel; AlCl3 colorimetric method; total flavonoids

堿韭（Allium polyrhizum Turcz. ex Regel）是百合科（Liliaceae）蔥屬（Allium）多年生草本植物，廣泛分布于內(nèi)蒙古呼倫貝爾、錫林浩特、烏蘭察布等地[1]。堿韭花又被稱為扎蒙花，是西北地區(qū)日常生活中的一種烹調(diào)熗油提味的綠色食品，同時也是畜牧業(yè)季節(jié)性飼草和秋季抓膘的常用野生植物，全草及其種子可以入藥，有解毒、化瘀、消炎消腫、健胃、利尿等功效，是一種可食用的多功能天然植物[2]。堿韭中重要活性成分為黃酮類物質(zhì)[3-4]，為加快堿韭黃酮的開發(fā)利用，有必要對堿韭黃酮的含量進行快速有效的監(jiān)測。由于堿韭中黃酮類物質(zhì)種類豐富，含量不一，以分光光度法測定總黃酮含量科學(xué)準確、操作簡便、易于工業(yè)推廣，可大大降低檢測成本[5]。本文分析了直接測定法、NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法、AlCl3比色法對堿韭總黃酮含量測定的適用性，篩選出最適合的測定方法，對方法的精密度、穩(wěn)定性等進行研究，并對不同采集年份不同部位堿韭總黃酮進行分析評價，以期為堿韭資源有效保護提供參考，同時為開發(fā)具有黃酮類食品添加劑的保健食品提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以2019年、2020年、2021年8月分別采自內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市達拉特旗的堿韭為實驗材料，采后將根、葉、花清潔并分離，室內(nèi)自然陰干，經(jīng)粉碎后過60目篩，密封低溫冷藏備用?？紤]堿韭葉便于收集和處理，因此本文優(yōu)選試驗部分以

2019年8月采集的堿韭葉為研究對象。

1.2 儀器和試劑

N4S紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；S22T數(shù)控超聲波清洗器（上海儀天科學(xué)儀器有限公司）；TB-114電子分析天平（河南信陵儀器設(shè)備有限公司）；H/T16MM臺式高速離心機（南北儀器有限公司）；QE-200高速多功能粉碎機（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）。

蘆丁標準品（純度≥98%，西安匯林生物科技有限公司）；無水乙醇（濟南世紀通達化工有限公司）；甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、冰乙酸、氫氧化鈉、三氯化鋁、無水乙酸鈉（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；實驗用水為二次蒸餾水。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液制備

（1）堿韭總黃酮提取液的制備。準確稱取

1.0 g堿韭葉粉末，分別選取水、乙酸乙酯、60%乙醇和60%甲醇作為提取溶劑，控制料液比為

1∶30（g∶mL），超聲功率為400 W，在60 ℃下超聲提取60 min。提取液經(jīng)過濾分離后，收集至棕色瓶中，冷藏備用。

（2）蘆丁標準液的制備。精密稱取40 mg于

120 ℃干燥至恒重的蘆丁標準品，用60%乙醇溶解定容至200 mL，配制成濃度為0.2 mg·mL-1的蘆丁標準溶液。

1.3.2 堿韭總黃酮含量測定方法的選擇

黃酮類化合物一般與水、乙酸乙酯、乙醇、甲醇等溶劑具有較好的親和性，為了客觀反映堿韭總黃酮在各提取溶劑中的存在狀態(tài)，體現(xiàn)與蘆丁標準品的可參比性和測定方法的一致性，本試驗在各提取溶劑下進行顯色反映，優(yōu)選堿韭總黃酮測定方法。同時確定堿韭總黃酮的最佳提取溶劑。所有實驗均重復(fù)3次。

（1）直接測定法。分別移取水、乙酸乙酯、60%乙醇和60%甲醇各1 mL，以及蘆丁標準液1 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，使用各提取溶劑定容至10 mL，搖勻并室溫下靜置15 min，分別以各提取溶劑為空白對照，在200～700 nm波長下進行光譜掃描。

（2）NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法。分別移取各提取溶劑1 mL和蘆丁標準液1 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，逐一加5% NaNO2溶液0.3 mL、10% Al（NO3）3溶液0.3 mL、4% NaOH溶液4 mL，每種試劑加入后均需搖勻并室溫下放置6 min，然后使用各提取溶劑定容至10 mL，搖勻，室溫靜置15 min，分別以各提取溶劑為空白對照，在400～600 nm波長下進行光譜掃描[6]。

（3）AlCl3比色法。分別移取各提取溶劑1 mL和蘆丁標準液1 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，加入1 mL 0.1 mol·L-1的AlCl3，使用各提取溶劑定容至10 mL，搖勻，室溫靜置30 min，分別以各提取溶劑為空白對照，在200～700 nm波長下進行光譜掃描[7]。

1.3.3 AlCl3比色法測定條件的優(yōu)化

（1）緩沖溶液pH及測定波長的選擇。準確吸取1 mL蘆丁標準液和1 mL 60%乙醇的樣品提取液，置于10 mL具塞刻度試管中，加入1 mL 0.1 mol·L-1的AlCl3再分別加入pH值為3.6、4.0、4.4、4.8、5.0、5.2、5.4、5.8和6.2的NaAC-HAC緩沖液2 mL，使用60%乙醇定容至10 mL，搖勻后，室溫靜置30 min，分別以1 mL蒸餾水代替蘆丁標準液（樣品提取液）為空白對照，在200～500 nm波長下進行光譜掃描。

（2）顯色劑AlCl3用量的選擇。準確吸取1 mL蘆丁標準液和1 mL 60%乙醇的樣品提取液，置于

10 mL具塞刻度試管中，分別加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.5 mL和2.0 mL，再加入pH值為

4.4的NaAC-HAC緩沖液2 mL，用60%乙醇定容至10 mL，搖勻后，室溫靜置30 min，分別以1 mL蒸餾水代替蘆丁標準液（樣品提取液）為空白對照，在405 nm下測定吸光度值。

（3）顯色時間和顯色溫度的選擇。準確吸取1 mL蘆丁標準液和1 mL 60%乙醇的樣品提取液，置于

10 mL具塞刻度試管中，分別加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液0.8 mL，再加入pH值為4.4的NaAc-HAc緩沖液2 mL，用60%乙醇定容至10 mL，分別以1 mL蒸餾水代替蘆丁標準液（樣品提取液）為空白對照。在顯色5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、50 min和60 min后于405 nm下測定吸光度值。在確定顯色時間后，控制顯色溫度為10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃，測定吸光度值。

（4）顯色溶劑濃度的選擇。準確吸取1 mL蘆丁標準液和1 mL 60%乙醇的樣品提取液，置于

10 mL具塞刻度試管中，加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液0.8 mL，再加入pH值為4.4的NaAC-HAC緩沖液2 mL，分別用0%（蒸餾水）、10%、30%、50%、60%、70%、95%乙醇定容至10 mL，以1 mL蒸餾水代替蘆丁標準液（樣品提取液）為空白對照。搖勻后，按（3）中確定的顯色時間和顯色溫度（室溫）靜置25 min后，每隔20 min在405 nm波長下測定吸光度值，直至65 min。所有實驗均重復(fù)3次。

1.3.4 AlCl3比色法標準曲線繪制

分別取蘆丁標準液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL，置于10 mL具刻度試管中，加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液0.8 mL，再加入pH值為4.4的NaAC-HAC緩沖液2 mL，分別用30%乙醇定容至10 mL，搖勻后，室溫下靜置25 min，在405 nm下測定吸光度值。用蒸餾水代替蘆丁標準液作為相應(yīng)的空白對照，以吸光度（A）對蘆丁濃度（c）作圖，得到標準曲線。線性方程為A=0.102 8c+0.007 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。

按照上述蘆丁標準曲線繪制的分析方法，測定其吸光度值，然后根據(jù)回歸方程計算提取液中所含總黃酮的含量。計算公式為

（1）

式中：Y為堿韭總黃酮含量，mg·g-1；c為標準曲線計算得出的待測液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg·mL-1；v1為測定樣品液體積，mL；v為樣品提取液總體積，mL；v2為顯色液總體積，mL；m為稱取堿韭粉末質(zhì)量，g。

1.3.5 AlCl3比色法的精密度測定及回收驗證

（1）精密度。分別取堿韭樣品提取液0.5 mL和

1.0 mL，按1.3.4測定方法連續(xù)測定5次并記錄吸光度值，計算堿韭總黃酮的含量，檢測精密度和重復(fù)性。

（2）回收驗證試驗。取堿韭樣品提取液0.5 mL和1.0 mL，分別加入蘆丁標準液0.2 mL、0.3 mL、

0.4 mL、0.5 mL和0.6 mL，測定其吸光度，并計算回收率。

1.3.6 不同采集年份和不同部位堿韭總黃酮含量檢測

準確稱取2019年、2020年、2021年的堿韭葉、花、根粉末各1.0 g，按1.3.1項方法制備堿韭黃酮提取液。分別取各提取液1 mL并按1.3.4測定方法測定吸光度值，計算堿韭總黃酮含量。以蒸餾水代替提取液作為相應(yīng)的空白。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件進行One-way ANOVA方差分析，樣本間的差異顯著性用Duncans檢驗。采用Excel 2019軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿韭總黃酮測定方法的選擇

如圖1所示，蘆丁標準液和各提取液在200～700 nm均有2個吸收峰，且吸收峰各不相同。其中，蘆丁標準液的最大吸收波長為270 nm和

360 nm，乙醇和甲醇提取液的最大吸收波長均為

320 nm和360 nm，水提取液的最大吸收波長為285 nm和320 nm，乙酸乙酯提取液的最大吸收波長為280 nm和410 nm，且峰值較低。各提取液的吸收峰與蘆丁的吸收峰相距較遠，故本文不選用直接測定法進行堿韭總黃酮含量的測定。

如圖2所示，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法發(fā)生顯色反應(yīng)后，出現(xiàn)大量絮狀物，這與柿葉[8]、竹葉[9]、蕎麥殼[10]的研究結(jié)果一致，這可能是由于在堿性條件下，提取液中的原花色素、阿魏酸、綠原酸和咖啡酸等酚酸類物質(zhì)可與鋁離子形成絡(luò)合物沉淀，對顯色造成嚴重影響，且含有鄰二酚羥基的非黃酮類物質(zhì)也會在測定波長下顯色，可能造成黃酮類化合物假陰性和非黃酮類化合物假陽性干擾，導(dǎo)致方法準確度不高[11]。

如圖3所示，在蘆丁標準液和各提取液中加入AlCl3顯色劑后，蘆丁的最大吸收峰紅移至410 nm處，而各提取液均在410 nm附近有吸收峰，能有效避免酚酸類等物質(zhì)干擾，有較好的一致性和專屬性。因此，以蘆丁為對照品，選用AlCl3比色法測定堿韭總黃酮含量。

對4種黃酮提取溶劑進行對比，發(fā)現(xiàn)甲醇和乙醇的提取效果優(yōu)于水和乙酸乙酯，考慮到乙醇比甲醇更穩(wěn)定和安全，本文選擇乙醇作為堿韭黃酮的提取溶劑。

2.2 AlCl3比色法測定條件的優(yōu)化

2.2.1 緩沖溶液pH及測定波長的確定

緩沖溶液pH值在3.6～6.2時，吸收峰值位置隨著pH值升高發(fā)生紅移，且吸光度也呈逐漸增大趨勢。pH值為4.4時，蘆丁標準液和樣品提取液顯色后均在405 nm波長處達到最大吸收峰，且該波長下的吸光度穩(wěn)定。當pH值大于4.4時，蘆丁標準液和樣品提取液顯色后放置一段時間均有白色沉淀析出。因此，本文確定NaAC-HAC緩沖溶液的pH值為4.4，測定波長為405 nm。

2.2.2 顯色劑AlCl3用量的選擇

由圖4可知，當AlCl3（0.1 mol·L-1）顯色劑用量為0.8 mL時，蘆丁標準液達到最佳顯色，而樣品提取液在1.5 mL時達到最佳顯色。結(jié)合光譜分析，發(fā)現(xiàn)顯色劑用量小于0.5 mL時，蘆丁標準液和樣品提取液的最大吸收峰分別出現(xiàn)在350 nm和305 nm處，樣品提取液的吸收峰隨著顯色劑用量的增大由395 nm向415 nm遷移，在顯色劑用量為0.8 mL時與蘆丁標準液的最大吸收峰一致。因此，本文選擇0.8 mL AlCl3（0.1 mol·L-1）作為最佳顯色劑用量。

2.2.3 顯色時間和顯色溫度的選擇

由圖5和圖6可知，蘆丁標準液和樣品提取液顯色時間為20～60 min時，吸光度變化小于3%，綜合考慮，本文選擇25 min作為顯色時間。在確定顯色時間后，控制顯色溫度在10～40 ℃，發(fā)現(xiàn)顯色后的吸光度差異不顯著（P＞0.05），因此本文采用室溫條件進行顯色。

2.2.4 乙醇濃度的選擇

如圖7所示，乙醇濃度為30%時，蘆丁標準液和樣品提取液的吸光度值最大，顯色效果最佳。當乙醇濃度大于30%時，放置后蘆丁標準液和樣品提取液均有沉淀析出，這與樂薇等[12]在箬葉總黃酮測定時的表現(xiàn)一致。綜合分析，本文選擇30%乙醇作為顯色溶劑濃度。

2.3 AlCl3比色法的精密度及回收率

由表1和表2可知，樣品取用量1 mL時的總黃酮含量為0.5 mL時總黃酮含量的1.97倍，RSD分別為1.48%和0.55%，表明該方法的精密度較好。本方法測定堿韭提取液中總黃酮含量的相對標準偏差為1.29%，加標回收率在96.49%～103.64%，準確度較高。因此，可以采用此法測定堿韭總黃酮含量。

2.4 不同采集年份和不同部位的堿韭總黃酮含量

由圖8可知，不同堿韭部位的總黃酮含量大小順序依次為葉＞花＞根，且2019年＞2020年＞2021年。2019年和2021年堿韭不同部位總黃酮含量差異顯著（P＜0.05），2020年葉和花差異不顯著（P＞0.05）；相同部位不同年份差異顯著（P＜0.05）。堿韭黃酮主要存在于葉[（42.70±6.65）mg·g-1]和花[（34.50±5.30）mg·g-1]中，以3年均值衡量葉和花的總黃酮含量為（38.60±5.79）mg·g-1。

酮含量差異顯著（P＜0.05）；不同大寫字母表示在相同部位不同年份的黃酮含量差異顯著（P＜0.05）。

3 結(jié)論

本試驗利用紫外可見分光光度法測定堿韭中的總黃酮含量，并針對3種比色法進行比較分析。最終確定采用AlCl3比色法測定堿韭總黃酮含量。該法以蘆丁為對照品，取堿韭總黃酮樣液1.0 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，加入0.1 mol·L-1的AlCl3溶液0.8 mL，再加入pH值為4.4的NaAC-HAC緩沖液2 mL，用30%乙醇作為顯色溶劑定容至10 mL，搖勻后，室溫下靜置25 min，在405 nm下測定吸光度值?；貧w方程為A=0.1 028c+0.007 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。精密度試驗和加標回收試驗結(jié)果顯示，加標回收率為96.49%～103.64%，RSD為1.29%，該方法操作簡便、準確性好，可作為堿韭總黃酮的定量分析方法。使用該方法測定2019年、2020年、2021年采集的堿韭葉、花、根中總黃酮含量，發(fā)現(xiàn)堿韭總黃酮主要存在于葉和花中，這與光照長短影響植物體內(nèi)次生代謝物的積累有重要關(guān)系，光照越長，該部位代謝積累的總黃酮含量越高。而根深入地下，無法接受照射，故總黃酮含量最低[6]。葉中平均黃酮含量[（42.70±6.65）mg·g-1]高于《中華人民共和國藥典》中記錄植物韭菜籽中的總黃酮含量

（34.26 mg·g-1）[13]，表明堿韭具有較高的黃酮功能價值，可通過刈割方式加以利用，該結(jié)果可為進一步開發(fā)利用和保護堿韭資源提供科學(xué)依據(jù)。

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