摩加夫芽孢桿菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化及對煙葉品質(zhì)的影響

李正風(fēng)　張鵬　王蘿萍　胡巍耀　端凱　高麗偉　張忠鋒　夏玉珍

摘要：纖維素、果膠、淀粉和蛋白質(zhì)是煙葉中含量較高的生物大分子，對煙葉品質(zhì)的影響較為顯著。本研究對煙葉醇化過程中的微生物進行篩選，并對其產(chǎn)酶條件和作用效果進行研究，旨在發(fā)掘?qū)熑~品質(zhì)有促進效果的功能微生物資源。研究篩選得到2-4A 菌株，能夠同時分泌淀粉酶、果膠酶、纖維素酶和蛋白酶，經(jīng)鑒定為摩加夫芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）。對2-4A 菌株的發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基 pH 及接種量進行優(yōu)化后，該菌株的淀粉酶、果膠酶、纖維素酶和蛋白酶的活力分別增加至41.36、3.64、5.14和72.13 U/mL。用發(fā)酵液處理煙葉，能夠?qū)熑~中的4種大分子物質(zhì)進行降解，其中蛋白質(zhì)的降解率達到37.8%，淀粉的降解率超過30%，果膠和纖維素的降解率均超過10%。經(jīng)過2-4A 菌株發(fā)酵液處理，煙葉中酮類、酸類、酯類、雜環(huán)類、醇類和醛類等香氣物質(zhì)的含量在整體上均得到提升，酸類和醇類物質(zhì)提升最多。就單種致香物質(zhì)而言，對煙葉香氣有較大影響的茄尼酮含量比發(fā)酵前提高了0.51百分點，葉綠醇含量提高了15.83百分點，3-甲基丁酸含量提高了6.85百分點。摩加夫芽孢桿菌在協(xié)調(diào)煙葉化學(xué)組分和增加致香物質(zhì)含量方面具有較好的效果，在提升煙葉品質(zhì)方面具有應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；降解酶；煙葉；品質(zhì)改善；煙葉醇化

中圖分類號： TS41+1? ????????文獻標(biāo)識碼： A???????? 文章編號：1007-5119（2023）03-0069-08

Condition Optimization of Enzyme Production from Bacillus mojavensis in Tobacco Leaf and Its Effect for Improving Tobacco Quality

LI Zhengfeng1， ZHANG Peng2， WANG Luoping1， HU Weiyao1， DUAN Kai1， GAO Liwei2， ZHANG Zhongfeng2， XIA Yuzhen1*

（1. China Tobacco Yunnan Industrial Co.， Ltd.， Kunming 650201， China;2. Tobacco Research Institute of Chinese Academy ofAgricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Abstract： Cellulose， pectin， starch and protein are some macromolecules with high content in tobacco leaf， which greatly affect the quality of tobacco leaf. In this study， bacteria were isolated from mellow tobacco leaves， and their enzyme production conditions and effects were studied， providing a new theoretical basis for microbial enzyme production in tobacco leaves and improving tobacco quality. In this study， strain 2-4A was screened， which was capable of producing amylase， pectinase， cellulase and protease at the same time. The strain was identified as Bacillus mojavensis. The activities of amylase， pectinase， cellulase and protease were increased to 41.36L， 3.64， 5.14 and 72.13 U/mL by optimizing the fermentation time， fermentation temperature， pH of medium and inoculum volume of strain 2-4A， respectively. After 72 h treatment with fermentation solution， the four macromolecular substances in tobacco leaves were degraded. The degradation rate of protein reached 37.8% and that of starch was over 30%. The degradation effects of pectin and cellulose were slightly weaker， but both were more than 10%. The contents of ketones， acids， esters， heterocycles， alcohols，aldehydes and other aroma substances in tobacco leaves were improved by the fermentation solution of strain 2-4A. Among them， acid and alcohol substances increased the most. In terms of single substance， the content of solanidone， phytol and 3-methylbutyric acid increased by 0.51%， 15.83% and 6.85% compared with that before fermentation. Bacillus mojavensis obtained in this study has the potential to be applied in improving the quality of tobacco leaves， and can be applied in the large-scale alcoholization process of tobacco leaves in the future.

Keywords： Bacillus; degrading enzymes; tobacco leaf; tobacco quality; tobacco mellowing

煙葉的品質(zhì)是由煙葉內(nèi)部化學(xué)成分所決定的。大量研究證實，煙葉香型風(fēng)格與內(nèi)在化學(xué)成分間存在著必然的聯(lián)系[1-2]。低次煙葉由于內(nèi)在成分比例不協(xié)調(diào)，煙葉雜氣重，風(fēng)格特征弱化。煙葉醇化能使煙葉內(nèi)化學(xué)成分及其比例發(fā)生變化，進而改善煙葉品質(zhì)[3-4]。然而，自然醇化周期過長且反應(yīng)不可控，具有占用倉儲面積大、積壓資金多等諸多缺點。此外，醇化后的低檔次煙葉刺激性、雜氣仍然較高，不足以從根本上提升低次煙葉的品質(zhì)[4-6]。

在煙葉醇化過程中，微生物在煙葉上繁殖富集，品質(zhì)越高的煙葉其微生物的數(shù)量和種類越豐富[2]。微生物分泌生物酶對煙葉化學(xué)組分進行轉(zhuǎn)化，在煙葉的自然醇化階段發(fā)揮了重要作用[5]。生物酶可以對煙葉中的淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、果膠等大分子物質(zhì)進行降解，同時加速煙葉中色素、多酚類物質(zhì)、萜烯類物質(zhì)向小分子香氣物質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而提高煙草中酮、醛、酸、酯、萜烯類和低級脂肪酸類的含量[7-9]。微生物的作用可以在整體上加快醇化過程，促進煙葉化學(xué)成分的改變和產(chǎn)香物質(zhì)的積累，最終改變煙草的品質(zhì)[10-11]。

近年來，煙葉醇化過程中的微生物得到分離和研究。在醇化過程之外培養(yǎng)微生物，將微生物加到煙葉中，已經(jīng)成為加速醇化過程、提升煙葉品質(zhì)的新手段[11-12]。研究者發(fā)現(xiàn)，利用從煙草中分離的微生物混合添加處理，醇化過程從3年縮短到7個月。從煙葉中分離產(chǎn)酶微生物也得到重視，培養(yǎng)來源于晾曬煙葉表面的產(chǎn)酶微生物，將其通過一定方式添加至煙葉進行發(fā)酵，可以顯著提高煙葉的吸食性[11]。

纖維素、果膠、淀粉和蛋白質(zhì)是煙葉中含量較高的幾種大分子，其含量極大影響煙葉的品質(zhì)[13-15]。為了獲得可同時降解淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、果膠的菌株，本研究從不同產(chǎn)地、不同品種的煙葉中分離細菌，并對其產(chǎn)酶條件及作用效果進行研究，為煙葉醇化微生物的應(yīng)用和煙葉品質(zhì)的提升提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙葉為山東省莒縣庫山鄉(xiāng)種植的 B3F 等級煙葉。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

1.2.1 主要試劑纖維素、果膠、酪蛋白、木質(zhì)素購自索萊寶科技有限公司，其他試劑均購買自國藥集團。木質(zhì)素和果膠含量測試試劑盒購買自索萊寶科技有限公司。細菌基因組提取試劑盒購買自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.2 培養(yǎng)基淀粉酶篩選培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂20.0 g ，1 L 蒸餾水， pH 7.0，121℃滅菌20 min。

纖維素酶篩選培養(yǎng)基：硫酸銨4.0 g，蛋白胨1.0 g，七水硫酸鎂0.5 g，羧甲基纖維素鈉10.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，瓊脂20.0 g，1 L 蒸餾水，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

蛋白酶篩選培養(yǎng)基：酪蛋白5 g，酵母粉3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂20 g，1 L 蒸餾水， pH 7.0，121℃滅菌20 min。

果膠酶篩選培養(yǎng)基：果膠4.0 g，七水硫酸鎂2.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，氯化銨0.4 g，硫酸亞鐵0.01 g ，1 L 蒸餾水， pH 7.0，121℃滅菌20 min。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20.0 g，1 L 蒸餾水，121℃滅菌20 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 煙葉中細菌的分離取50 g 醇化過程中的煙葉樣品，剪碎放于50 mL 1%氯化鈉溶液中，30℃、180 r/min 培養(yǎng)1 h。取培養(yǎng)懸液用1%氯化鈉溶液進行梯度稀釋，取100μL 稀釋液涂布于LB 平板，37℃培養(yǎng)48 h，挑選形態(tài)不同的單菌落進行劃線純化。1.3.2 菌株降解大分子物質(zhì)能力初篩純化后的細菌，挑取單菌落分別在淀粉酶篩選平板、果膠酶篩選平板、纖維素酶篩選平板和蛋白酶篩選平板上點種，于37℃培養(yǎng)36 h。在蛋白酶篩選平板上，直接觀察細菌菌落周圍的透明圈。果膠酶[13]、淀粉酶[14]和纖維素酶[15]篩選平板，先用盧戈氏碘液染色，然后觀察菌落周圍是否有透明圈的產(chǎn)生，以判斷細菌是否降解相應(yīng)大分子，根據(jù)透明圈的直徑可以初步比較產(chǎn)酶能力。綜合4種培養(yǎng)基上透明圈的情況，挑選出可同時生產(chǎn)多種酶和降解相應(yīng)大分子的菌株。

1.3.3 菌株發(fā)酵培養(yǎng)和降解酶活力測定初篩得到的2-4A 菌株在37℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)12 h，得種子液。種子液接種于 LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h，6000 r/min 離心10 min 棄掉菌體，即為發(fā)酵液。纖維素酶、果膠酶和淀粉酶活力的測定分別以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液、0.5%果膠溶液、0.5%可溶性淀粉溶液為底物，在37℃和 pH 7.0條件下，反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束用 DNS 法測定還原糖的增加量，酶活力單位 U 定義為每分鐘生成1μmol 還原糖需要的酶量[16]。蛋白酶活力的測定以0.2%酪蛋白溶液為底物，在上述同樣的條件下進行反應(yīng)，進而用福林酚試劑染色，通過吸光度的增加量計量蛋白酶活力。酶活力單位 U 定義為每分鐘生成1μg 酪氨酸需要的酶量。

1.3.4 菌株的鑒定將2-4A 菌株接種于LB 平板上于37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察菌株的細胞形態(tài)[9， 17-18]。對培養(yǎng)好的菌液進行硝酸鹽肉湯、淀粉水解、西蒙氏檸檬酸鹽、V-P 、葡萄糖、溶菌酶、甘露醇、動力培養(yǎng)基、明膠液化和3%過氧化氫酶等生理生化鑒定。適量刮取平板上的菌落，利用細菌基因組提取試劑盒提取基因組 DNA，以此為模板 PCR 擴增16S rDNA 序列[19]。引物分別為27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1429R（GGTTACCTTGTTACGACTT）。PCR 擴增條件為：96℃預(yù)變性10.0 min；96℃變性1.0 min，50℃退火1.0 min ，72℃延伸2.0 min 變性，72℃充分延伸8.0 min ，30個循環(huán)；4.0℃保溫。送青島擎科生物科技公司測序。將16S rDNA 序列在 NCBI 基因庫中進行比對。然后依據(jù)相似細菌物種的16SrDNA 序列，使用 MEGA 7.0進行同源比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3.5 菌株產(chǎn)酶條件的單因素優(yōu)化菌株在 LB 液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12 h 作為種子液，以4%的接種量轉(zhuǎn)接到 LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)60 h。每隔12 h 取樣1 mL，測定4種降解酶的活力，獲得最佳的發(fā)酵時間。培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為31、34、37、40和43℃ ， 發(fā)酵培養(yǎng)60 h，得到最佳的產(chǎn)酶溫度條件。將培養(yǎng)基調(diào)整 pH 至5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，以4%的接種量將菌株種子液接種于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，測定酶活力，獲得菌株產(chǎn)酶的最佳 pH 條件。設(shè)置5個不同的接種量梯度，在37℃和180 r/min 下振蕩培養(yǎng)，測定酶活力，獲得菌株產(chǎn)酶的最佳的接種量。每個試驗重復(fù)3次。

1.3.6 菌株產(chǎn)酶條件的正交優(yōu)化基于單因素產(chǎn)酶條件優(yōu)化的結(jié)果，進行4因素3水平的正交試驗。正交試驗方案如表1所示，1、2、3代表各因素的3個水平，分別設(shè)置為：培養(yǎng)時間24、36、48 h ，溫度34、37、40℃;培養(yǎng)基 pH 6.0、7.0、8.0；接種量4%、6%、8%。

1.3.7 菌株酶液對煙葉中大分子物質(zhì)含量的影響將2-4A 菌株于最佳的培養(yǎng)條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，6000 r/min 離心10 min ，獲得發(fā)酵液。將30 mL 發(fā)酵液均勻噴灑在100 g 煙葉表面，在37℃、65%濕度的恒溫恒濕箱中處理72 h，對照噴灑等量的無菌水。每個樣品做3次重復(fù)。處理完畢后，測定處理對煙葉成分的影響。利用碘顯色法測定淀粉含量， BCA 法測定蛋白質(zhì)含量，蒽酮比色法測定纖維素含量，木質(zhì)素和果膠含量使用試劑盒進行測定（索萊寶科技）。

1.3.8 煙葉中香氣成分的測定將煙葉粉碎，用二氯甲烷進行萃取，然后根據(jù)參考文獻[20-21]利用氣質(zhì)聯(lián)用色譜（島津， GCMS-QP2010 SE ）檢測，每個樣品做3次重復(fù)。色譜檢測色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）；程序升溫：60℃保持5 min，以4℃/min 的速度升至135℃;以1℃/min，升至175℃;再以10℃/min，升至310℃，并保持10 min。進樣溫度250℃;載氣純 He，載氣流速1 mL/min；分流比10∶1；進樣量1μL。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，在數(shù)據(jù)庫中搜索確定小分子化合物的種類和結(jié)構(gòu)，依據(jù)峰面積計算出每種分子的含量和比例。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)酶菌株初步篩選

經(jīng) LB 平板培養(yǎng)和劃線分離，共篩選得到59株細菌。從 LB 平板上挑取單個細菌，分別點種到4種產(chǎn)酶篩選平板上培養(yǎng)36 h，經(jīng)觀察透明圈及其直徑，共篩選出5株可以同時降解4種大分子的細菌，如圖1所示。菌株2-4A 在果膠酶、纖維素酶和淀粉酶篩選平板上均出現(xiàn)透明圈，直徑分別是22、23、24和30 mm，同時測定到4種酶活力都處于較高水平。說明具有較強的降解能力，具有提高煙葉品質(zhì)的潛力，選出該菌株進行后續(xù)試驗。

2.2 菌株的鑒定

如圖2所示，2-4A 菌株可以在 LB 培養(yǎng)基上生長36 h 即出現(xiàn)較大菌落。菌落為純白色，不透明，邊緣光滑無凸起，細胞呈桿狀。提取菌株的基因組 DNA ，使用通用引物1492R 和27F 擴增得到16S rDNA 片段，產(chǎn)物測序后得到16S rDNA 的序列，與 NCBI 數(shù)據(jù)庫中多個已知細菌物種的16S rDNA 序列進行 Blast 比對分析，并利用 Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。如圖2所示，2-4A 菌株與摩加夫芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）距離最近，位于進化樹的同一支，且它們的16S rDNA 序列的相似度超過了99%。綜合菌落形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，2-4A 菌株是摩加夫芽孢桿菌。

2.3 培養(yǎng)條件對菌株產(chǎn)酶的影響

2.3.1 最佳產(chǎn)酶時間如圖3所示，2-4A 菌株的淀粉酶、纖維素酶、果膠酶和蛋白酶活力均隨發(fā)酵時間延長升高。當(dāng)發(fā)酵至36 h ，4種酶活力均達到最高值，分別為36.12、4.30、2.30和67.34 U/mL。隨著發(fā)酵時間繼續(xù)增加，各種降解酶的活力開始下降。通常細菌發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳時間在穩(wěn)定中期，而到穩(wěn)定后期菌株受限于營養(yǎng)物質(zhì)含量的降低，自身的生長和代謝受到抑制，產(chǎn)酶量降低。因此最佳的發(fā)酵產(chǎn)酶時間是36 h。

2.3.2 最佳產(chǎn)酶溫度如圖4所示，2-4A 菌株的淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶活力在發(fā)酵溫度為37℃時達到最大值，分別為37.92、4.47和68.53 U/mL ，而果膠酶活力在40℃達到最大值2.63 U/mL。當(dāng)溫度升至43℃， 酶活力都顯著下降。在較低的溫度條件下，菌株細胞內(nèi)的代謝處于較低水平，對物質(zhì)的利用速度也較慢，生物量降低，產(chǎn)酶量也較少。而超過菌株的適宜生長溫度時，細胞內(nèi)的代謝會隨之發(fā)生改變，過快的生長速度會加速營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，使衰亡期提前，反而使得酶活力降低。因此，2-4A 菌株的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)溫度是37℃。

2.3.3 最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基 pH pH是保證菌株正常生長和代謝的重要條件，芽孢桿菌屬一般在 pH 6.0～9.0的范圍內(nèi)能夠正常生長。pH 超出耐受范圍的，則會影響胞內(nèi)的代謝酶，從而抑制菌株的生長，不利于各種代謝產(chǎn)物的積累。如圖5所示，pH 對4種降解酶活力的影響趨勢基本相同。隨著 pH 升高，4種降解酶的活力均是先升高后降低。當(dāng) pH 為6.0時，淀粉酶和纖維素酶的活力達到最大，分別為43.16和5.88 U/mL；而當(dāng) pH 為7.0時，蛋白酶和果膠酶的活力達到最大值，分別為17.13和25.91 U/mL。說明芽孢桿菌來源的蛋白酶和果膠酶更適合在中性條件下發(fā)揮作用，而淀粉酶和纖維素酶更適合在弱酸條件下合成和分泌。因此，2-4A 菌株的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基的 pH 為7.0。

2.3.4 最佳產(chǎn)酶接種量在細菌培養(yǎng)過程中，接種量也能影響到菌株的生長和代謝。接種量越大，菌株適應(yīng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件越快，生物量增加得越快。如圖6所示，隨著接種量從2%升高到6%，淀粉酶、果膠酶和纖維素酶的活力分別增加到41.36、3.64和5.14 U/mL，蛋白酶的活力比在4%接種量略有下降，為72.13 U/mL。整體而言，6%的接種量為最佳條件。

2.4 菌株產(chǎn)酶條件的正交優(yōu)化

正交條件優(yōu)化用于優(yōu)化多個因素對一個目標(biāo)的影響。在進行產(chǎn)酶的正交條件優(yōu)化時，通過對以上因素進行正交條件優(yōu)化試驗，可以找到最佳的產(chǎn)醞條件組合，從而提高細菌產(chǎn)醞效果。如圖7所示，按照5號正交方案培養(yǎng)，菌株產(chǎn)醞量達到最佳。淀粉醞、果膠醞、蛋白醞和纖維素醞的活力分別增加到44.26、3.76、75.26和5.43 U/mL，高于通過單因素試驗得到的活力。因此菌株最佳的產(chǎn)醞培養(yǎng)條件為37校下培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)基初始 pH 為8.0，接種量為4%。

2.5 菌株發(fā)酵液對煙葉中大分子的降解效果

2-4A 菌株發(fā)酵液對處理72 h 后，煙葉中4種大分子物質(zhì)均得到降解（表2）。其中蛋白質(zhì)的降解率達到37.8%，淀粉的降解率也超過30%；果膠和纖維素的降解效果稍弱，但也均超過10%。煙葉中木質(zhì)素含量幾乎不變，這與菌株未檢測到木質(zhì)素降解醞活性對應(yīng)。

2.6 煙葉香氣成分的測定

經(jīng)過2-4A 菌株發(fā)酵液的處理，煙葉中麗類、酸類、酷類、雜環(huán)類、醇類和睦類等香氣物質(zhì)的含量在整體上均得到提升（表3）。其中含量提升最多的是酸類和醇類物質(zhì)。就單種物質(zhì)而言，對煙葉香氣有較大影響的茄尼麗、葉綠醇和3-甲基丁酸的含量相比發(fā)酵前分別提高了0.51、15.83和6.85百分點。

3 討論

煙葉中大分子在醇化過程中可以降解成小分子，是香氣物質(zhì)的前體成分，促進大分子降解是提升煙葉品質(zhì)的重要手段[22-25]。煙草行業(yè)醇化過程中的自然發(fā)酵周期過長且反應(yīng)不可控，醇化后的低檔次煙葉仍帶有刺激性、雜氣，所以自然醇化不足以從根本上提升低次煙葉的品質(zhì)[26]。添加外源微生物進行發(fā)酵，能夠顯著提升轉(zhuǎn)化效率，大大縮短發(fā)酵時間。近年來，人工添加微生物發(fā)酵成為重要的輔助手段，可以增加煙葉中香氣成分的含量[27]。

研究者最早使用小球菌和芽孢桿菌來改善煙葉香氣，此后有越來越多關(guān)于利用微生物提高煙葉香氣的研究。黃文靜等[28]發(fā)現(xiàn)短時間的芽孢桿菌處理煙葉香氣顯著提高、刺激性降低、卷煙吸味改善。于少藤等[1]將菌株 yc10接種于煙葉表面，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵煙葉中蛋白質(zhì)、淀粉、木質(zhì)素、果膠等含量降低，且致香成分的含量以及總糖含量增加，其中煙葉中的糖分在熱分解時使煙氣呈酸性，促進煙堿中和，降低了刺激性，使煙氣更加平衡。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)按一定比例使用多種微生物共同處理煙葉也可提高煙葉香氣[29]。采用解淀粉芽孢桿菌單一處理煙葉后，煙葉甜度、香氣品質(zhì)均顯著提高，但是煙氣的柔和度和刺激性變化不明顯，用地赤芽孢桿菌單一處理煙葉也有類似的趨勢。當(dāng)把解淀粉芽孢桿菌和地赤芽孢桿菌按3∶1比例混合處理煙葉2 d 后，煙葉的香氣、甜度、刺激性等不同指標(biāo)均表現(xiàn)出更全面的改善，表明兩個菌株對煙葉的香氣品質(zhì)具有協(xié)同作用。以上研究表明，醇化發(fā)酵過程中選擇合適的微生物和適宜的發(fā)酵條件均可顯著改善煙葉的香氣品質(zhì)，提高煙葉的質(zhì)量。

本研究篩選出1株能同時產(chǎn)生纖維素酶、果膠酶、淀粉酶和蛋白酶的菌株，優(yōu)化產(chǎn)酶條件之后，添加發(fā)酵液到煙葉可以同時降解煙葉中的4種大分子，僅僅處理72 h 就能顯著降低上述4種大分子的含量。煙葉經(jīng)2-4A 菌株酶液處理后，從整體上看，酮類、醇類、醛類、酸類和酯類等香氣物質(zhì)的含量均有所增加。含量提升最為顯著的是茄尼酮、葉綠醇和3-甲基丁酸。茄尼酮具有烤煙精油的香氣，能夠提高煙草的吸味品質(zhì)，豐富香氣特征。葉綠醇自身具有類似于花香的香氣，隨著煙葉的調(diào)制轉(zhuǎn)化為新植二烯，形成濃郁的烤香[30-31]。3-甲基丁酸能夠中和煙草的酸堿度，使吸味平和，減弱煙氣的刺激性。其他酯類、雜環(huán)類化合物、醇類及醛類成分均為重要的致香物質(zhì)，具有明顯的香味特征。同時，2-4A 菌株產(chǎn)生的淀粉酶和纖維素酶催化降解產(chǎn)生單糖分子，增加還原糖的量，還原糖分解可以使煙氣 pH 降低，并緩和煙氣刺激性。

4 結(jié)論

本研究通過對煙葉醇化過程中的微生物進行分離篩選，得到一株2-4A 菌株具有同時分泌淀粉酶、果膠酶、纖維素酶和蛋白酶的能力，經(jīng)鑒定為摩加夫芽孢桿菌。對菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化，顯著提高了該菌株分泌上述4種生物酶的能力。將該菌株的發(fā)酵液施用于煙葉發(fā)酵72 h 后，能夠有效減少煙葉中淀粉、果膠、纖維素和蛋白質(zhì)等生物大分子的含量，同時增加酮類、酸類、酯類、雜環(huán)類、醇類和醛類等致香物質(zhì)含量。本研究獲得的摩加夫芽孢桿菌在提升煙葉品質(zhì)方面具有較大潛力。

參考文獻

[1] 于少藤，毛淑蕊，胡安妥，等.改善煙葉品質(zhì)微生物的篩選及其作用效果研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2021，44（4）：766-777.

YU S T， MAO S R， HU A T， et al. Study on screening of microorganisms for improving tobacco leaf quality and their effects [J]. Journal of Nanjing Agricultural University， 2021， 44（4）：766-777.

[2] 郝捷，季嬙，李力群，等.生物酶和微生物技術(shù)改善煙葉香氣的研究進展[J].生物技術(shù)進展，2022，12（6）：817-824.

HAO J， JI Q， LI L Q， et al. Research progress of enzyme and microbial technology to improve tobacco aroma[J]. Progress of Biotechnology， 2022， 12（6）：817-824.

[3]? POLOSA R ，F(xiàn)ARSALINOS K ，PRISCO D. Health impact of electronic cigarettes and heated tobacco systems[J]. Internal and Emergency Medicine， 2019， 14（6）：817-820.

[4] 李秀妮，李猛，萬德建，等.煙葉微生物及其在煙葉發(fā)酵和醇化中的作用研究進展[J].微生物學(xué)通報，2019，46（6）：1520-1529.

LI X N， LI M， WAN D J， et al. Role of microorganisms in tobacco fermentation and alcoholization： a review[J]. Microbiology China， 2019， 46（6）：1520-1529.

[5]? LI J J， ZHAO Y Y， QIN Y Q， et al. Influence of microbiota and metabolites on the quality of tobacco during fermentation[J]. BMC Microbiology， 2020， 20（1）：356.

[6] 沙云菲，董惠忠，張耀，等. 降解上部煙葉大分子物質(zhì)的復(fù)合酶配制與條件優(yōu)化[J].中國煙草科學(xué)，2018，39（3）：80-88，97.

SHA Y F， DONG H Z， ZHANG Y， et al. Preparation of multienzyme complex? and? condition? optimization? for? degradation? of macromolecules in upper tobacco leaves[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（3）：80-88， 97.

[7]? FABRE C E， DUVIAU V J， BLANC P J， et al. Identification of volatile flavour compounds obtained in culture of Kluyveromycesmarxianus[J]. Biotechnology Letters， 1995， 17（11）：1207-1212.

[8] 鞏效偉，刀婭，趙偉，等.產(chǎn)香酵母菌篩選、條件優(yōu)化及發(fā)酵產(chǎn)物在電子煙煙液中的應(yīng)用[J].煙草科技，2020，53（2）：62-71.

GONG X W， KOU Y， ZHAO W， et al. Aroma-producing yeasts： screening， optimization and application in e-liquids[J]. Tobacco Science & Technology， 2020， 53（2）：62-71.

[9] 楊霄，崔志峰.酵母生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2-苯乙醇的研究進展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2006，12（1）：140-144.

YANG X， CUI Z F. Progress in 2-phenylethanol production by biotransformation with yeast [J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology， 2006， 12（1）：140-144.

[10] YANG Y， PENG Q R， OU M Y， et al. Research progress in tobaccofermentation[J]. Journal of Biosciences and Medicines， 2018， 6（6）：105-114.

[11] 崔鈺杰，鄒克興，陳義昌，等.微生物和酶技術(shù)促進煙葉醇化的研究進展[J].農(nóng)技服務(wù)，2022，39（7）：66-71.

CUI Y J， ZOU K X， CHEN Y C， et al. Research progress of promoting tobacco leaf maturation by microorganism and enzyme technology[J]. Agricultural Technology Services， 2022， 39（7）：66-71.

[12] 馬科，蔣登科，龔霜，等.不同酶處理濃縮液對貴州煙草薄片品質(zhì)的影響研究[J].輕工學(xué)報，2022，37（1）：62-67.

MA K， JIANG D K， GONG S， et al. Effects of different enzyme treatment concentrate on the quality of Guizhou tobacco flake[J]. Journal of Light Industry， 2022， 37（1）：62-67.

[13] 范曉靜，楊瑞先，邱思鑫，等.果膠酶基因在內(nèi)生芽孢桿菌中的過表達及其對定殖的影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2013，19（5）：805-810.

FAN X J， YANG R X， QIU S X， et al. Overexpression of pectinase gene in Endogenic Bacillus and its effect on colonization[J]. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology， 2013， 19（5）：805-810.

[14] 王娟，王帆，張鴿，等.烤煙煙葉淀粉含量5種測定方法的比較[J].分子植物育種，2019，17（5）：1673-1678.

WANG J， WANG F， ZHANG G， et al. Comparison of five methods for starch measurement in tobaccos[J]. Molecular Plant Breeding， 2019， 17（5）：1673-1678.

[15] 安玉民，王菊葵，黃燁，等.馬鈴薯秸稈中纖維素與半纖維素含量的測定[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016（17）：159-160.

AN Y M， WANG J K， HUANG Y， et al. Determination of cellulose and hemicellulose content in potato stalk[J]. Modern Agricultural Science and Technology， 2016（17）：159-160.

[16] 曾春函，王傳華.我國主要蜜環(huán)菌生物種胞外酶活性對溫度的種特異性響應(yīng)[J].菌物學(xué)報，2019，38（2）：195-209.

ZENG C H， WANG C H. Specificity response of extracellular enzyme activities to temperature of eight Armillaria species in China [J]. Mycosys Tema， 2019， 38（2）：195-209.

[17] 胡申才，李良，李俊薇，等.清香型白酒釀造核心功能微生物的研究與應(yīng)用[J].中國釀造，2021，40（2）：16-19.

HU S C， LI L， LI J W， et al. Research and application of core functional microorganisms in light-flavor Baijiu brewing[J]. China Brewing， 2021， 40（2）：16-19.

[18] WANG Z M， LU Z M， SHI J S， et al. Exploring flavour-producingcore microbiota in multispecies solidstate fermentation of traditional Chinese vinegar [J]. Scientific Reports， 2016， 6（1）：1-10.

[19] SUKRAMA I D M， FRANCISKA J， SUARDANA I W. Evaluationof the bacteriocin produced by strain 9 lactic acid bacteria isolate for biopreservation [J]. Veterinary World， 2020， 13（9）：2012-2019.

[20] 杜飛，喻闌清，周家喜，等.兩種產(chǎn)香微生物分離鑒定及其發(fā)酵液增香煙草研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報，2021，40（1）：14-21.

DU F， YU L Q， ZHOU J X， et al. Isolation and identification of two aroma-producing microorganisms and their fermented liquid to increase the aroma of tobacco[J]. Journal of Mountain Agriculture and Biology， 2021， 40（1）：14-21.

[21] 郭林青，樸永革，朱春陽，等.煙草產(chǎn)香酵母 YG-4的篩選鑒定及香氣成分分析[J].輕工學(xué)報，2019（5）：27-31.

GUO L Q， PU Y G， ZHU C Y， et al. Marin screening and identification of aroma-producing yeast YG-4 and analysis of its aroma components[J]. Journal of Light Industry， 2019（5）：27-31.

[22] 薛云，寧振興，蘇贊，等.基于芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵技術(shù)提高廣西河池 C4F 煙葉品質(zhì)的研究[J].輕工學(xué)報，2022，37（5）：76-84.

XUE Y， NING Z X， SU Z， et al. Study on improving the quality of C4F tobacco leaf in Hechi， Guangxi Province based on Bacillus solid fermentation technology[J]. Journal of light Industry， 2022， 37（5）：76-84.

[23] 張倩穎，羅誠，李東亮，等.雪茄煙葉調(diào)制及發(fā)酵技術(shù)研究進展[J].中國煙草學(xué)報，2020，26（4）：1-6.

ZHANG QY， LUO C， LI D L， et al. Research progress in curing and fermentation technology for cigar tobacco leaf production[J]. Acta TabacariaSinica， 2020， 26（4）：1-6.

[24] 葉建斌，王璐，楊峰，等.原煙發(fā)酵過程化學(xué)成分的變化規(guī)律[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（20）：212-217.

YE J B， WANG L， YANG F， et al. Chemical composition changes in process of raw tobacco fermentation[J]. Jiangsu Agricultural Sciences， 2019， 47（20）：212-217.

[25] 楊娟，米其利，熊文，等.食源性乳酸菌在改善煙葉品質(zhì)中的應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，30（5）：854-862.

YANG J， MI Q L， XIONG W， et al. Application of foodborne lactic acid bacteria in improving tobacco quality[J]. Acta AgriculturaeZhejiangensis， 2018， 30（5）：854-862.

[26] 胡逸超，蘇贊，雷薇，等.一株具有煙草甲毒殺作用的蘇云金芽孢桿菌對煙葉的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2022，53（6）：1568-1576.

HU Y C， SU Z， LEI W， et al. Effects of a strain of Bacillus thuringiensis on tobacco leaves[J]. Journal of Southern Agriculture， 2022， 53（6）：1568-1576.

[27] 王金棒，邱紀(jì)青，汪志波，等.生物技術(shù)在煙草發(fā)酵領(lǐng)域的專利布局現(xiàn)狀及熱點分析[J].煙草科技，2021，54（10）：96-112.

WANG J B， QIU J Q， WANG Z B， et al. Analysis of patent distribution status and hot spots of biotechnology in tobacco fermentation field[J]. Tobacco Science and Technology， 2021， 54（10）：96-112.

[28] 黃靜文，段焰青，者為，等.短小芽孢桿菌改善煙葉品質(zhì)的研究[J].煙草科技，2010，8（277）：61-64.

HUANG J W， DUAN Y Q， ZHE W， et al. Improvement of flue-cured tobacco quality with Bacillus pumilus[J]. Tobacco Science and Technology， 2010， 8（277）：61-64.

[29] WU X， ZHU P， LI D， et al. Bioaugmentation of Bacillusamyloliquefaciens-Bacillus kochii co-cultivation to improve sensory quality of flue-cured tobacco[J]. Arch. Microbiol.， 2021， 203（9）：5723-5733.

[30] 劉紹華，曲利利，白家峰，等．反應(yīng)溫度對以香莢蘭為原料的美拉德產(chǎn)物分布及卷煙加香的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，51（1）：183-193.

LIU S H， QU L L， BAI J F， et al ． Effects of reaction temperature on distribution of Maillard reaction products and tobacco flavoring with Vanilla as raw material[J]. Journal of Southern Agriculture ，2020，51（1）：183-193.

[31] 龍章德，陳皓睿，劉鴻，等.來自六堡茶的3株散囊菌屬真菌對煙草的發(fā)酵效果分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，49（10）：2055-2061.

LONG Z D， CHEN H R， LIU H， et al. Fermentation effects of three Aspergillus spp. fungi derived from Liupao tea on the application in tobacco[J]. Journal of Southern Agriculture， 2018， 49（10）：2055-2061.