貝萊斯芽孢桿菌 F85對煙草炭疽病的生防作用研究

劉涵斐　徐婷婷　李錫宏　邱夢娟　張藝千　鄭露　黃俊斌　黎妍妍

摘要：為明確貝萊斯芽孢桿菌對煙草炭疽病的生防作用，通過貝萊斯芽孢桿菌 Bacillus velezensis F85和煙草炭疽病菌 Colletotrichum fructicola共培養(yǎng)試驗(yàn)，測定了不同濃度的 F85無菌發(fā)酵濾液（0.5%～20%）對C.fructicola的菌絲生長、分生孢子萌發(fā)及附著胞形成的影響，評價了 F85對活體葉片的煙草炭疽病的防治效果。結(jié)果表明：（1）貝萊斯芽孢桿菌 F85對 C. fructicola、C. kahawae、C. karstii、C. siamense均表現(xiàn)出較好的拮抗作用，具有廣譜抑菌效果。（2）貝萊斯芽孢桿菌 F85可有效抑制煙草炭疽菌C.fructicola菌絲的生長，同時抑制炭疽菌分生孢子的萌發(fā)和附著孢形成。隨 F85無菌發(fā)酵濾液濃度升高，對C.fructicola的抑制作用更明顯。20% F85無菌發(fā)酵濾液處理C.fructicola菌絲干質(zhì)量抑制率和分生孢子芽管畸形率均達(dá)100%。（3）5%濃度以上的貝萊斯芽孢桿菌 F85無菌發(fā)酵濾液對活體煙草炭疽病的防效高于70%。本研究豐富了煙草炭疽病生防菌資源，為開展煙草炭疽病的生物防治提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：煙草炭疽??；生物防治；貝萊斯芽孢桿菌

中圖分類號： S435.72???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A???????? 文章編號：1007-5119（2023）03-0047-06

Study on the Biocontrol Effect of Bacillus velezensis F85 against Tobacco Anthracnose

LIU Hanfei1， XU Tingting1， LI Xihong2， QIU Mengjuan1， ZHANG Yiqian1， ZHENG Lu1， HUANG Junbin1， LI Yanyan2*

（1. College of Plant Science and Technology， Huazhong Agriculture University， Wuhan 430207， China;2. Tobacco Research Instituteof Hubei Province， Wuhan 430030， China）

Abstract： To determine the biocontrol effect of Bacillus velezensis F85 against tobacco anthracnose， co-culture experiments of B. velezensis F85 and C. fructicola were conducted. The effects of different concentrations of B. velezensis F85 aseptic fermentation filtrate （0.5%-20%） on mycelium growth， conidial germination and appressorium formation of C.fructicola were determined， and the effect of F85 on live leaf control of C. fructicola was evaluated. The results indicated that：（1） B. velezensis F85 showed good antagonism to C.fructicola， C. kahawae， C. karstiiand C. siamense， suggesting that B. velezensis F85 had broad spectrum antifungal property for Colletotrichum spp..（2） B. velezensis F85 could effectively inhibit the mycelium growth of C. fructicola， and inhibit the germination of conidia and appressorium formation of anthrax. With the increase of the concentration of sterile fermentation filtrate of F85， its inhibitory effect on C. fructicola was more obvious. The dry weight inhibition rate of C. fructicola mycelium and the malformation rate of conidial bud tube were both 100% when the filtrate ofF85 was 20%.（3） The control effect of B. velezensis F85（above 5%） on live leaf tobacco anthracnose was higher than 70%. This study enriched the biocontrol bacteria resources for tobacco anthracnose and provided theoretical basis for biological control of tobacco anthracnose.

Keywords： tobacco anthracnose; biological control; Bacillus velezensis

炭疽病是一種常見的葉部病害，炭疽菌（Colletotrichum spp.）寄主植物廣泛，如葡萄、蘋果、煙草、玉米、高粱、梨、茶樹等[1]。煙草炭疽病是煙草上發(fā)生最為普遍的真菌病害之一，該病于1922年首次在巴西報道，之后在中國等多個亞洲國家相繼報道[2]。該病害在煙葉上最初為水浸狀黃綠色斑點(diǎn)，然后顏色變成深褐色，合并成較大的壞死斑，最后葉片萎蔫[3]。近年來，在我國四川省[3]、貴州省[5-6]、河南省[7]、湖南省[3]、海南省[8]等省份陸續(xù)報道了煙草炭疽病的為害。因此，炭疽病的有效防治在煙葉生產(chǎn)中顯得尤為重要。

生物防治是目前植物病害防治的發(fā)展方向之一，因具有可利用資源豐富，選擇范圍廣，對環(huán)境不會造成污染等眾多優(yōu)點(diǎn)而為植病學(xué)家所青睞[9-10]。近年來，前人已零星開展了煙草炭疽病的生防菌劑篩選。王靜等[11]對一株短小芽孢桿菌 Bacillus pumilus AR03進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌株對煙草炭疽病菌的抑制效果明顯，AR03發(fā)酵液可以導(dǎo)致炭疽菌菌絲生長異常，使孢子萌發(fā)出現(xiàn)畸形，同時在室內(nèi)盆栽煙草試驗(yàn)中也表現(xiàn)出較好的防治效果。原晨虹等[12] 研究表明，地衣芽孢桿菌 Bacillus licheniformis BL-24的發(fā)酵液和無菌發(fā)酵濾液對煙草炭疽病菌菌絲生長的抑制率分別達(dá)到66.67%和68.89%?？偟膩碚f，目前涉及煙草炭疽病的生物防治研究較少，需要進(jìn)一步開展生防菌株的篩選及生防菌劑的研發(fā)。

本課題組前期篩選獲得了一株貝萊斯芽孢桿菌 Bacillus velezensis F85，對煙草炭疽病具有較好的防治作用。本研究測定了 F85無菌發(fā)酵濾液對煙草炭疽病菌菌絲生長、分生孢子萌發(fā)及附著胞形成的影響，并評價其對煙草活體葉片的防效，探究貝萊斯芽孢桿菌 F85對煙草炭疽病的生防潛能，以期為開展煙草炭疽病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株和煙草供試生防菌株為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）F85；供試煙草炭疽病菌為C.fructicola、C. karstii、C. kahawae、C. siamense，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物真菌病害研究室保藏。供試煙草品種為云煙87，由湖北省煙草科學(xué)研究院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g ，純水定容至1 L。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g，純水定容至1 L。Luria-Bertani 培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g ，純水定容至1 L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 F85對不同煙草炭疽病菌的抑菌譜測定采用平板對峙法測定 F85對不同煙草炭疽病菌（ C. fructicola、C. karstii、C. kahawae、C. siamense）的抑菌譜。取5μL F85菌液在 PDA 平板中央劃線，同時在線兩側(cè)30 mm 處呈十字交叉接種供試炭疽菌的菌餅，以不接種 F85只接種病原菌絲塊的培養(yǎng)基為對照，每個處理重復(fù)3次。7 d 后測定抑菌帶大小，并計(jì)算抑制率。抑制率=[（對照組菌落半徑-處理組菌落半徑）/（對照組菌落半徑－菌餅半徑）]×100%。

1.2.2 煙草炭疽病菌的分生孢子液制備實(shí)驗(yàn)室前期將活化的 C. fructicola菌株的菌絲塊接種到 PDA 平板上，28℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，用棉簽刮破表面菌絲，加入無菌水刮洗孢子并過濾，重復(fù)離心2次，棄上清液，制成孢子懸浮液備用。

1.2.3 F85無菌發(fā)酵濾液的制備挑取活化后的 F85單菌落接種于2 mL 液體培養(yǎng)基中，在37℃、180 r/min（下同）條件下振蕩24 h。將搖培后的 F85菌株的菌液按0.5%（ V/V，下同）的比例接種于200 mL 液體 LB 培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液于8000 r/min 離心15 min，用細(xì)菌過濾器過濾后獲得上清液，即得 F85無菌發(fā)酵濾液。

1.2.4 F85對 C. fructicola菌絲生長的影響將貝萊斯芽孢桿菌 F85無菌發(fā)酵濾液加至 PDA 中混合至不同濃度（0.5%、1%、2.5%、5%、10%、20%）；取直徑為5 mm 的C.fructicola菌餅，分別接種于含不同濃度 F85無菌發(fā)酵濾液的 PDA 平板及 PDB 液體培養(yǎng)基中，以不添加無菌發(fā)酵濾液的 PDA（PDB）為對照，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱（PDB 培養(yǎng)基置于28℃、180 r/min 搖床）中培養(yǎng)，每個處理設(shè)置3 次重復(fù)。培養(yǎng)7 d 后用十字交叉法測量菌落直徑；搖培菌絲在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察后，過濾、烘干稱量菌絲干質(zhì)量，并計(jì)算 F85對 C. fructicola的菌落、菌絲抑制率。菌落抑制率=[（對照組菌落直徑–處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑–菌餅直徑）]?100%；菌絲抑制率=（對照組菌絲干質(zhì)量–處理組菌絲干質(zhì)量）/對照組菌絲干質(zhì)量?100%。

1.2.5 煙草炭疽病菌分生孢子萌發(fā)及附著胞形成測定以0.025%的吐溫20為溶劑，制備含有不同濃度（0.5%、1%、2.5%、5%、10%、20%）F85無菌發(fā)酵濾液和1×105 cfu/mL 的 C. fructicola分生孢子的混合液，將上述各處理的混合液分別接種到疏水玻片上。以不添加 F85無菌發(fā)酵濾液的 C. fructicola分生孢子液接種作為對照，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)統(tǒng)計(jì)100個孢子。28℃恒溫黑暗條件下保濕培養(yǎng)18 h ，在顯微鏡下觀察 C. fructicola分生孢子、芽管及附著胞形成的情況，并計(jì)算孢子萌發(fā)率、芽管畸形率和附著孢形成率。

1.2.6 F85無菌發(fā)酵濾液對活體葉片炭疽病的防治效果評價按照1.2.5的方法制備各處理混合液，將各處理的混合液分別接種到活體云煙87煙草葉片上，每個處理設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)3個葉片。置于28℃恒溫下黑暗培養(yǎng)48 h 后持續(xù)光照培養(yǎng)，保濕培養(yǎng)5 d 后觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和發(fā)病面積，并計(jì)算防治效果。防治效果=（對照組病斑面積–處理組病斑面積）/對照組病斑面積×100%。

2 結(jié)果

2.1 F85對煙草炭疽菌的拮抗作用測定

以煙草炭疽病4種病原菌 C. fructicola、C. karstii、C. kahawae、C. siamense作為指示菌，分別與貝萊斯芽孢桿菌 F85進(jìn)行平板對峙培養(yǎng)（圖1）。結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌 F85對4種煙草炭疽病菌的拮抗效果較好，抑菌帶在16.33～22.66 mm 之間（表1）。

2.2 F85無菌發(fā)酵濾液對煙草炭疽菌菌絲生長的影響

F85無菌發(fā)酵濾液對 C. fructicola菌落生長影響的測定結(jié)果表明，隨著貝萊斯芽孢桿菌 F85發(fā)酵濾液濃度的增加，炭疽菌菌落直徑顯著減?。▓D2），當(dāng)發(fā)酵液濃度為10%時，對菌落生長抑制效果可達(dá)50%以上（表2）。

F85無菌發(fā)酵濾液對 C. fructicola菌絲干質(zhì)量影響的測定結(jié)果表明，0.5%發(fā)酵濾液對菌絲生長的抑制率達(dá)到69.67%；當(dāng)使用10%及以上濃度的發(fā)酵濾液處理C.fructicola時，抑制率可達(dá)100%，顯著高于其他濃度的處理（表2）。在搖培條件下，加入2.5%發(fā)酵濾液時，可以觀察到菌絲出現(xiàn)膨大畸形現(xiàn)象，并且隨著發(fā)酵濾液濃度的增加，C.fructicola菌絲出現(xiàn)膨大畸形的比例上升。

2.3 F85無菌發(fā)酵濾液對C.fructicola分生孢子萌發(fā)以及附著胞形成的影響

貝萊斯芽孢桿菌 F85無菌發(fā)酵濾液處理后，C. fructicola分生孢子萌發(fā)后生成的芽管形態(tài)異常，芽管出現(xiàn)畸形膨大現(xiàn)象，附著胞的生成也受到抑制（圖3）。隨著加入的F85無菌發(fā)酵濾液濃度的升高，芽管畸形的比例變大，附著胞形成的比例逐漸減小。當(dāng) F85無菌發(fā)酵濾液濃度為20%時， C. fructicola 生成的芽管全部畸形，附著胞形成的比例降至0.2%（表3）。

2.4 F85無菌發(fā)酵濾液對活體葉片上煙草炭疽病的防治效果

不同濃度貝萊斯芽孢桿菌F85無菌發(fā)酵濾液對活體葉片上煙草炭疽病的防治效果存在差異（圖4）。0.5%無菌發(fā)酵濾液和1%無菌發(fā)酵濾液處理后，病斑面積均顯著小于對照組，但發(fā)病率仍然達(dá)到100%（表4）。隨著貝萊斯芽孢桿菌 F85無菌發(fā)酵濾液濃度從2.5%提高到20%，發(fā)病率從82.2%顯著降為2%，無菌發(fā)酵濾液濃度為20%時，幾乎不產(chǎn)生病斑。試驗(yàn)表明使用濃度高于5%的 F85無菌發(fā)酵濾液可有效防治活體煙草炭疽病。

3 討論

貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）在自然界分布廣泛，為一種好氧桿狀革蘭氏陽性細(xì)菌。西班牙學(xué)者 Ruiz-García 等[13]于2005年在西班牙南部馬赫拉加首次發(fā)現(xiàn)并對其命名。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，貝萊斯芽孢桿菌具有廣譜抗病性，具有廣泛的應(yīng)用前景[14]。在作物炭疽病防治中，貝萊斯芽孢桿菌也表現(xiàn)出明顯抑菌活性。代亞鋒等[15]、竺利紅等[16]、王雨等[17]、馮江鵬等[18]、Choub等[19]分別探究了貝萊斯芽孢桿菌 X10-03、SM905、HN-2、JK3、CE100菌株對草莓、芒果、鐵皮石斛等作物炭疽病菌的抑菌活性。本研究表明，貝萊斯芽胞桿菌 F85對4種煙草炭疽菌均表現(xiàn)出較好的抑制作用，具有廣譜抑菌效果。

引起植物炭疽病的炭疽菌屬（Colletotrichum spp.）共有14個復(fù)合種，每個復(fù)合種又包含不同的炭疽菌種[20]，其中果生炭疽菌（C.fructicola）可引起杧果[21]、橡膠樹[22]、蘋果[23]、草莓[24]等多種作物炭疽病。據(jù)報道，C.fructicola也是引起煙草炭疽病的主要病原[5]。因此，C.fructicola在煙草上的傳播、流行需要引起重視，C.fructicola的防控也勢在必行。本研究重點(diǎn)分析了貝萊斯芽孢桿菌 F85對C.fructicola菌絲生長、分生孢子萌發(fā)及附著胞形成的影響，為由 C. fructicola侵染引起的煙草炭疽病的防控探尋了生物防治方向。隨著 F85無菌發(fā)酵濾液濃度的增加，對 C. fructicola菌絲生長的抑制作用逐漸增強(qiáng)，分生孢子芽管畸形率逐漸增多，這與代亞鋒等[13]研究結(jié)論一致。 F85無菌發(fā)酵濾液濃度高于5%時，對C.fructicola菌絲干質(zhì)量的抑制率達(dá)78.00%以上，分生孢子芽管畸形率達(dá)72.00%以上； F85無菌發(fā)酵濾液濃度為20%時，對 C. fructicola菌絲干質(zhì)量的抑制率和芽管畸形率均達(dá)到100.00%。在活體葉片上，5%以上濃度 F85無菌發(fā)酵濾液對煙草炭疽病的防效達(dá)70%以上。以上結(jié)果表明貝萊斯芽孢桿菌 F85抑制煙草炭疽病菌菌絲生長，造成炭疽病菌分生孢子萌發(fā)生成的芽管異常，從而有效防止煙草炭疽病的發(fā)生和擴(kuò)展。這與Choub等[19]關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌CE100抑制 C. gloeosporioides的作用機(jī)制一致。

目前，利用微生物活體及其代謝產(chǎn)物來防治煙草病害的方法已經(jīng)日益成熟，然而使用微生物活體防治病害時受環(huán)境影響較大，且效果不穩(wěn)定。通過微生物代謝產(chǎn)物來防治病害既符合農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的要求，相比利用微生物活體防治又具有高效、安全、與環(huán)境相容度高等優(yōu)勢[25]。根據(jù)前人報道研究， B. velezensis產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中具有抑菌效果的物質(zhì)主要有脂肽類、聚酮類化合物、芽胞桿菌溶素等抗生素[26]以及fengycin B， iturin A， surfactin A 等抗真菌代謝物[27]。本研究中 F85分泌的抑菌物質(zhì)的種類需要進(jìn)一步鑒定。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌 F85對多種煙草炭疽菌具有較好的拮抗作用，可有效抑制煙草炭疽菌C.fructicola的菌絲生長，同時抑制炭疽菌分生孢子的萌發(fā)和附著孢形成，進(jìn)而有效防治煙草炭疽病。 F85無菌發(fā)酵濾液濃度為5%時， C. fructicola菌絲干質(zhì)量的抑制率和分生孢子的芽管畸形率分別為78.20%和72.40%，對活體葉片煙草炭疽病的防效可達(dá)70.00%；F85無菌發(fā)酵濾液濃度為20%時， C. fructicola菌絲干質(zhì)量的抑制率和芽管畸形率均達(dá)到100.00%，對活體葉片煙草炭疽病的防效達(dá)100.00%。本研究為挖掘防治煙草炭疽病的生防菌資源及后續(xù)生防菌劑的研發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

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