熱處理對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

羅惠芳，王翰庭，王 嬋

（武漢商學(xué)院食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430000）

我國為淡水魚養(yǎng)殖大國，截至2020 年我國魚類產(chǎn)量占全國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量的83.73%[1]，鳙魚為我國的四大家魚之一，受傳統(tǒng)烹制方法的影響，基本將魚骨直接丟棄。魚骨主要組成元素有蛋白質(zhì)、灰分、水分及脂肪，將其加工利用，很容易被人體消化吸收。大部分的魚骨占魚體質(zhì)量的10%~15%，含有豐富的蛋白質(zhì)，若直接丟棄將是極大的浪費(fèi)。

由于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不同區(qū)域的原子隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，使其柔性程度不同，剛性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)就難以被人體利用[2]，因此國內(nèi)外都開始了對(duì)食品蛋白質(zhì)柔性化加工技術(shù)的研究。生物酶解法是一種安全和相對(duì)溫和的方法，已被廣泛應(yīng)用于食物原料加工中，如施永清等人[3]采用雙酶解法制備魚鱗抗菌肽，Yang Ji 等人通過酶解制備了羅非魚皮明膠水解液等。但鳙魚骨結(jié)構(gòu)堅(jiān)硬，若直接酶解效率較低，有研究者發(fā)現(xiàn)適度的熱處理可以使高級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)降解，從而更柔性化，Sang-gi Min 等人研究發(fā)現(xiàn)，水熱處理可輔助豬皮副產(chǎn)物蛋白質(zhì)水解物的生產(chǎn)；陳林等人[4]研究得出，水熱預(yù)處理改變了花生蛋白空間構(gòu)象、提高了蛋白酶解敏感性，因此有必要通過適當(dāng)熱處理輔助鳙魚骨蛋白酶解。

通過Alcalase 酶解鳙魚骨蛋白，以蛋白質(zhì)回收率、TCA-NSI、水解度為考查指標(biāo)，分析研究不同熱處理時(shí)間、熱處理溫度及底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響。旨在為日后滿足市場需求，發(fā)掘新的途徑進(jìn)一步開發(fā)利用廢棄蛋白資源、制造功能性食品等提供理論依據(jù)，以提高水產(chǎn)品生產(chǎn)的附加值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鮮活鳙魚骨，購自沌陽集貿(mào)市場；Alcalase（200 U/mg），源葉生物提供；BCA 試劑盒，Biosharp生物科技公司提供。

1.2 試驗(yàn)試劑

硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、甲醛、硼酸、三氯乙酸、石油醚（60~90 ℃）、硫酸銅、硫酸鉀、磷酸，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.3 儀器與設(shè)備

GZX-9140MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊生物儀器有限公司產(chǎn)品；HYP-304 型消化爐、KDN-102C 型定氮儀、SZC-101 型脂肪測定儀，上海纖檢儀器有限公司產(chǎn)品；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產(chǎn)品；UPT-1-5T 型超純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司產(chǎn)品；YP-30002 型電子天平，上海越平儀器有限公司產(chǎn)品；TDZ4-WS 型臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；YY0027-90 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，武漢精華科儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海今邁儀器公司產(chǎn)品；KSW型高溫爐，武漢精達(dá)儀表廠產(chǎn)品；LDZX- 75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；722 型可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；YB-1500A 型多功能粉碎機(jī)，永康速峰工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 鳙魚骨的制備

將新鮮活鳙魚進(jìn)行宰殺、去鱗、去肉，將鳙魚剔出的大致魚骨進(jìn)行沸水隔水蒸煮2.5 min，取出，得到無雜質(zhì)的魚骨。魚骨清洗于37 ℃下烘干，用0.1 mol/L 的NaOH 溶液沒過鳙魚骨浸泡12 h，去除雜蛋白、脂肪等，清洗后再用1%的鹽酸沒過魚骨浸泡2 h 脫鈣，流水沖洗3 h，于37 ℃下烘干10 h，最后粉碎即可得到鳙魚骨粉（密封、冷藏保存）。

1.4.2 鳙魚骨基本成分的測定

根據(jù)凱氏定氮法[8]測定鳙魚骨中的蛋白質(zhì)，索氏抽提法[9]測其脂肪，根據(jù)國標(biāo)[10]測定其灰分，根據(jù)國標(biāo)中的直接干燥法[11]測其水分。

1.4.3 熱處理對(duì)鳙魚骨蛋白的影響

（1） 熱處理時(shí)間的影響。配置1%的鳙魚骨溶液置于121 ℃條件下經(jīng)過5 個(gè)不同的加熱時(shí)間（0，20，45，70，95 min） 后測定蛋白質(zhì)回收率、水解度。

（2） 熱處理溫度的影響。配置1%的鳙魚骨溶液，固定加熱時(shí)間為30 min，將鳙魚骨溶液分別置于5 個(gè)不同溫度（0，60，80，100，121 ℃） 下進(jìn)行熱處理后測定蛋白質(zhì)回收率、水解度。

1.4.4 酶解單因素試驗(yàn)及酶解工藝

（1） 熱處理時(shí)間的影響。配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鳙魚骨溶液，分別于100 ℃條件下加熱0，20，45，70，95 min，冷卻后酶解。

（2） 熱處理溫度的影響。配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鳙魚骨溶液，固定加熱時(shí)間為30 min，分別于0，60，80，100，121 ℃下進(jìn)行熱處理，冷卻后酶解。

（3） 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。分別配置鳙魚骨溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，2%，3%，4%，5%，于121 ℃條件下加熱20 min，冷卻后酶解。

（4） 酶解工藝流程。對(duì)熱處理后的鳙魚骨蛋白溶液加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，主要操作工藝為鳙魚骨溶液經(jīng)過熱處理后冷卻至50 ℃左右，加酶量為1.5%（即3 U/mL），通過pH 值8.0 的緩沖溶液將鳙魚骨溶液調(diào)配為pH 值8.0 后，于溫度為55 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行120 min 的酶解。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行沸水浴滅酶10 min，再以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心15 min，其上清液即為鳙魚骨蛋白的酶解產(chǎn)物。

1.4.5 水解度測定

鳙魚骨水解液中的氨基態(tài)氮含量的測定參照國標(biāo)[9]甲醛滴定法進(jìn)行測定，原料中的含氮量采用凱氏定氮法測定。水解度的計(jì)算公式[10]：

1.4.6 蛋白質(zhì)回收率測定

采用考馬斯亮藍(lán)法得出上清液中蛋白質(zhì)含量，凱氏定氮法測定原料中總蛋白含量。蛋白質(zhì)回收率計(jì)算公式[14]：

1.4.7 TCA 可溶性氮得率測定

通過BCA 試劑盒測定其離心后的上清液中可溶性蛋白質(zhì)，原料中的總蛋白質(zhì)量采用凱氏定氮法測定。TCA 可溶性氮得率計(jì)算公式[15]：

1.4.8 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品均至少3 次平行測定，通過Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算整理，結(jié)果用Mean±SD 表示，利用Origin 2021 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本成分的分析

鳙魚骨粉基本成分見表1。

表1 鳙魚骨粉基本成分/g·（100 g）-1

由表1 可知，4 種基本成分含量均>10%，尤其是灰分和蛋白質(zhì)含量更高，此結(jié)果表明鳙魚骨的營養(yǎng)成分很高。魚肉中的蛋白質(zhì)含量為15%左右，鳙魚骨中蛋白質(zhì)含量為25.93%，魚骨中的蛋白質(zhì)因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)復(fù)雜很難被人體消化吸收，但是經(jīng)過處理的魚骨蛋白會(huì)比植物蛋白更適宜人體所需，因此尋找有效技術(shù)充分利用廢棄的鳙魚骨蛋白尤為必要。

2.2 熱處理對(duì)鳙魚骨蛋白蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響

熱處理對(duì)鳙魚骨蛋白蛋白質(zhì)回收率和水解度（DH） 的影響見圖1。

圖1 熱處理對(duì)鳙魚骨蛋白蛋白質(zhì)回收率和水解度（DH） 的影響

由圖1 可知，熱處理對(duì)鳙魚骨蛋白水解度和蛋白質(zhì)回收率均產(chǎn)生了一定的影響。由圖1（a） 可知，未經(jīng)過熱處理組的蛋白質(zhì)回收率和水解度分別為2.98%和0.05%，DH 和蛋白質(zhì)回收率隨著熱處理溫度的上升而持續(xù)提升，當(dāng)熱處理溫度為121 ℃經(jīng)過30 min 加熱后鳙魚骨蛋白溶液的DH 和蛋白質(zhì)回收率分別是未處理組的15.4 倍和103 倍。由圖1（b）可知，在121 ℃下經(jīng)過20 min 加熱后其蛋白質(zhì)回收率和水解度都顯著增大，上升速度最快，后緩緩上升，到70 min 后顯著下降?？赡艿脑蚴歉邷仄茐牧说鞍踪|(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步降解為小分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)肽鍵不斷裂解為短肽鏈，同時(shí)部分蛋白質(zhì)分子的展開推動(dòng)了鳙魚骨明膠的溶出與水解，使得回收率和水解度提高。而當(dāng)熱處理時(shí)間過長導(dǎo)致鳙魚骨蛋白中的一些小分子物質(zhì)、短肽鏈（如可溶性蛋白）的損失，而使得回收率降低。在此基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化不同熱處理方式對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響。

2.3 熱處理對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

2.3.1 不同熱處理溫度對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

（1） 不同熱處理溫度對(duì)鳙魚骨蛋白蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響。

熱處理溫度對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響見圖2。

圖2 熱處理溫度對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

由圖2 可知，經(jīng)過熱處理的鳙魚骨酶解液的蛋白質(zhì)回收率和DH 隨著溫度的升高而持續(xù)呈上升趨勢(shì)。這可能是由于經(jīng)過熱處理特別是經(jīng)過高溫的鳙魚骨蛋白結(jié)構(gòu)舒展，高級(jí)結(jié)構(gòu)被降解，更多的酶切位點(diǎn)暴露，使得堿性蛋白酶與鳙魚骨蛋白充分接觸，進(jìn)一步促進(jìn)了蛋白酶的水解作用。由圖2 可知，當(dāng)溫度上升到121 ℃時(shí)的蛋白質(zhì)回收率和水解度比未經(jīng)熱處理組提高了約40%和5%，相比于其他熱處理溫度的水解效果最好，由此選取121 ℃為最佳的處理溫度較適宜，能夠達(dá)到在有限條件下充分利用資源的目的。

（2） 不同熱處理溫度對(duì)鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響。

三氯乙酸可沉淀十肽以上的蛋白質(zhì)，TCA 可溶性氮得率即得到酶解液的短肽得率。

熱處理溫度對(duì)鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響見圖3。

圖3 熱處理溫度對(duì)鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響

由圖3 可知，TCA 可溶性氮得率與熱處理溫度呈正相關(guān)，TCA-NSI 隨著溫度的升高而提高且在121 ℃下經(jīng)過30 min 熱處理后極速上升，此時(shí)鳙魚骨酶解液TCA-NSI 高達(dá)30%是比經(jīng)熱處理組提高了約26%?？赡苡捎诮?jīng)過高溫使得蛋白質(zhì)多肽鏈分裂為小分子肽鍵，可見高溫處理對(duì)鳙魚骨酶解液的TCA 可溶性氮得率影響很大，與蛋白質(zhì)回收率的趨勢(shì)大致相同，均在121 ℃時(shí)為最佳熱處理溫度。

2.3.2 不同熱處理時(shí)間對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

（1） 不同熱處理時(shí)間對(duì)鳙魚骨蛋白蛋白質(zhì)回收率和DH 的影響。

熱處理時(shí)間對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響見圖4。

圖4 熱處理時(shí)間對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

由圖4 可知，經(jīng)過熱處理的鳙魚骨酶解液的蛋白質(zhì)回收率和DH 均明顯高于未處理組，其中經(jīng)過20 min 提升的速度最快，其蛋白質(zhì)回收率達(dá)到44%比未處理組多31%；水解度達(dá)到6.5%，是未處理組的4 倍。20 min 后，隨著加熱時(shí)間的增加，水解度增長很緩慢，而蛋白質(zhì)回收率與時(shí)間不成正比，不會(huì)隨著時(shí)間的增加而上升甚至出現(xiàn)下降的現(xiàn)象。這可能是因?yàn)榧訜徇^度導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子重新組合成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使得酶切位點(diǎn)被包圍，堿性蛋白酶難以對(duì)鳙魚骨蛋白作用，使得水解效果降低。因此最佳的熱處理時(shí)間應(yīng)選擇20 min。

（2） 不同熱處理時(shí)間對(duì)鳙魚骨蛋白TCA 可溶性氮得率的影響。

熱處理時(shí)間對(duì)鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響見圖5。

圖5 熱處理時(shí)間對(duì)鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響

由圖5 可知，經(jīng)過熱處理的鳙魚骨酶解液的蛋白質(zhì)回收率和DH 均明顯高于未處理組，其中經(jīng)過20 min 時(shí)的TCA-NSI 達(dá)到22.4%是未處理組的4.5 倍。而當(dāng)時(shí)間超過20 min 后緩慢上升，45 min 后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明熱處理時(shí)間過度會(huì)導(dǎo)致酶解效果不理想?？赡苁且?yàn)榈鞍追肿咏Y(jié)構(gòu)重新組合成難分解的狀態(tài)或小分子物質(zhì)經(jīng)過長時(shí)間的熱處理受到一定的損傷。因此，20 min 可為最佳的熱處理時(shí)間。

2.3.3 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

（1） 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鳙魚骨蛋白蛋白質(zhì)回收率和DH 的影響。

不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響見圖6。

圖6 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

由圖6 可知，在經(jīng)過同樣熱處理?xiàng)l件下（121 ℃，20 min） 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鳙魚骨蛋白酶解液的蛋白質(zhì)回收率和DH 差別很大。在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于3%時(shí)，DH 呈緩慢上升趨勢(shì)，而后則呈顯著下降趨勢(shì)；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，蛋白質(zhì)回收率便開始顯著下降。蛋白質(zhì)回收率和DH 均沒有隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而提高，反而出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，原因可能是底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)太高，溶液體系偏于濃稠，水自由度降低，導(dǎo)致鳙魚骨蛋白經(jīng)過熱處理也難以析出；與此同時(shí)，堿性蛋白酶與鳙魚骨蛋白的酶解位點(diǎn)也變少等原因，使得蛋白質(zhì)回收率和DH 均有所下降。結(jié)合水解度和蛋白質(zhì)回收率應(yīng)選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%為佳，其蛋白質(zhì)回收率達(dá)到44.7%，水解度為7.2%。

（2） 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鳙魚骨蛋白TCA 可溶性氮得率的影響。

不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響見圖7。

圖7 不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響

由圖7 可知，經(jīng)過相同熱處理?xiàng)l件下（121 ℃，20 min） 在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，TCA-NSI 達(dá)到最大為23.7%；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%后，TCA 可溶性氮得率呈現(xiàn)大幅下降趨勢(shì)，這與蛋白質(zhì)回收率的趨勢(shì)大致相同。造成TCA 可溶性氮得率下降的原因可能是由于此指標(biāo)表征測的是短肽得率，而當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)過大會(huì)導(dǎo)致蛋白難以溶出，酶與鳙魚骨蛋白的作用點(diǎn)也變小，因此很難將蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)降解為短肽。結(jié)合成本問題和現(xiàn)實(shí)操作等因素，故可選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)首先對(duì)鳙魚骨中的基本成分進(jìn)行了測定，得到其蛋白質(zhì)含量為25.93%，粗脂肪含量為19.75%，總灰分含量為37.56%，水分為15.54%，說明鳙魚骨中的營養(yǎng)成分很高，其中蛋白質(zhì)比魚肉中蛋白質(zhì)含量還要高，因此對(duì)鳙魚骨蛋白進(jìn)行研究對(duì)其合理利用尤為必要。以熱處理時(shí)間、熱處理溫度為變量；以蛋白質(zhì)回收率、水解度為指標(biāo)，分析得出，熱處理對(duì)鳙魚骨蛋白產(chǎn)生一定的影響。試驗(yàn)得出經(jīng)過熱處理?xiàng)l件為加熱時(shí)間121 ℃，加熱時(shí)間20 min，此時(shí)的鳙魚骨蛋白的蛋白質(zhì)回收率和水解度分別是未經(jīng)熱處理組的15.4 倍和103 倍。鳙魚骨粉若不經(jīng)預(yù)處理基本無法溶于水，致密的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致蛋白無法溶出，只有借助外力條件才能使其結(jié)構(gòu)降解。

基于熱處理會(huì)對(duì)鳙魚骨蛋白產(chǎn)生影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行單因素試驗(yàn)研究不同熱處理?xiàng)l件對(duì)鳙魚骨蛋白酶解特性的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)加熱時(shí)間為20 min，加熱溫度為121 ℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，其蛋白質(zhì)回收率達(dá)到44.7%，水解度為7.2%，TCA 可溶性氮得率高達(dá)23.7%，分別是未處理組的3.0 倍，4.2 倍，4.7 倍。高溫?zé)崽幚硎且环N普遍的原料預(yù)處理方式，生物酶解是較為安全、可控性強(qiáng)、效率高的水解食品蛋白的方法，兩者結(jié)合運(yùn)作高效簡單，將鳙魚骨變廢為寶，加工魚丟棄的下腳料被重新利用，減少資源浪費(fèi)綠色環(huán)保，提供了一條新途徑開發(fā)利用水產(chǎn)品蛋白資源，使合理利用資源具有美好廣闊前景。